PRÉPARATION DES ANIMAUX. PRÉLÈVEMENTS

Sommaire. — Préparation des animaux ; inoculations de bacilles de Koch vivants ; inoculations de bacilles de Koch tués par la chaleur ; inoculations de filtrat ; inoeulations de tuberculine ; injections d'huile d'olive éthérée ou d'huile de foie de morue éthérée. — Prélèvements de sang par ponction intra-cardiaque ; prélèvements d'organes.

$ 1. — Préparation des animaux

Les cobayes ont été préparés soit par des inoculations de produits tuberculeux, soit par des injections d'huile éthérée, et quelques-uns par les deux procédés ; mais un même animal n’a jamais été inoculé qu'avec un produit tuberculeux de même espèce (par exemple, bacilles de Koch vivants, ou tuberculine) ou n’a jamais reçu que des injections d’une huile éthérée déterminée, toujours la même.

Inoculations conjonctivales de bacilles de Koch vivants.

Le cobaye étant solidement immobilisé en position horizontale par un aide, on écarte les paupières de l’œil droit, en les soulevant légèrement ; avec une boucle, de

3 mm. de diamètre, en fil de platine on prélève une certaine quantité de bacilles — toujours la même — dans une culture sur pomme de terre glycérinée et on les dépose dans le cul-de-sac conjonctival. On ferme ensuite doucement les paupières à deux ou trois reprises et on remet le cobaye en liberté.

Nous avons utilisé cette voie d'infection plutôt que la voie sous-cutanée pour des raisons clairement exposées par CALMETTE (19, pp. 179-180).

« On verra, écrit-il, évoluer chez cet animal, sans qu'il se produise la moindre lésion au niveau du globe oculaire, de ses enveloppes ou de leur voisinage immédiat, une tuberculose ganglionnaire typique, débutant par le ganglion rétro: mastoïdien, envahissant aussitôt les 2 ganglions rétropharyngiens, les 2 ganglions de la partie antérieure du cou, puis les trachéaux, les bronchiques et s'étendant en l’espace de 4 à 5 semaines à d'autres groupes viscéraux, aux ganglions du hile du foie, à ceux du mésentère, parfois aussi à des ganglions superficiels tels que les inguinaux, à la rate et presque constamment aux poumons. €

Ce mode d'infection est donc très sûr et, à la gravité près (due à la virulence des bacilles employés) la forme de tuberculose qui en résulte ressemble singulièrement, dans sa première phase, à celle qui caractérise chez l'homme, surtout dans l'enfance, la scrofule. La ressemblance est telle qu'en examinant les animaux d'expérience, l’idée vient immédiatement à l'esprit que la contagion familiale humaine s'exerce fréquemment sans doute par la même voie, et qu'elle est alors consécutive à la projection, par un tuberculeux tousseur, sur la conjonctive oculaire de sujets sains, de particules de salive riches en bacilles.

Beaucoup mieux que l'inoculation expérimentale [souscutanée}, l'infection par instillation oculaire, réalisant l’in-

FD Ÿ DE fection en quelque sorte naturelle par les voies lymphatiques, sans effraction de tissus, sans lésions à la porte d'entrée des bacilles, permet d'étudier, chez le cobaye, l'action des tuberculines, celle des sérums et des substances chimiques susceptibles d'influencer l'évolution de la tuberculose. Cette

voie peut aussi être utilisée avec avantage, pour les essais de vaccination avec des bacilles modifiés ou atténués. »

Inoculations de bacilles de Koch tués par la chaleur.

Ces bacilles provenaient d’une culture en voile, sur bouillon glycériné à 4 %, âgée de 6 semaines. Le voile compact, ridé, caractéristique, recouvrait tout le liquide et grimpait un peu sur la paroi du ballon ; le bouillon sous-jacent était clair.

Par la tubulure latérale du ballon, située au dessous du niveau du voile, le bouillon fut aspiré dans une pipette à boule et traité comme nous le verrons plus loin.

Quant au voile resté dans le ballon, il fut stérilisé dans l’autoclave par chauffage à + 115° pendant dix minutes. Ensuite on le mit en suspension dans de l’eau physiologique stérile pour le laver ; après plusieurs centrifugations et lavages à l’eau physiologique stérile, on l’étala dans une boîte de Pétri stérile pour le mettre à sécher pendant 24 heures dans l’étuve à 4195.

Plusieurs fragments de ce voile furent ensemencés sur les milieux électifs (bouillon glycériné, pomme de terre glycérinée, milieu de Pétrof) ; ces ensemencements placés à l’éluve à + 38° ne donnèrent jamais de cultures positives même après plusieurs mois d'observation : les bacilles étaient donc bien tués.

Une boucle de ces bacilles tués fut déposée sur la

Conjonctive &es cobayes en prenant les précautions indiquées précédemment pour l'instillation des bacilles vivants.

Par inoculation sous la peau de la face interne de la cuisse droite, d’autres cobayes reçurent la même quantité de bacilles tués, mis en suspension dans un cenlimètre cube d’eau physiologique.

L’excédent des bacilles tués fut conservé à la glacière, dans un flacon stérile fermé par un bouchon de verre, pour des inoculations ultérieures.

Inoculations du filtrat de culture de B. K sur bouillon glycerine.

Le bouillon, recueilli précédemment sous la culture en voile, fut additionné de plusieurs centimètres cubes d’une culture en bouillon, âgé de 24 heures, de choléra des poules et filtré sur bougie Chamberland L,,

Cette filtration fut réalisée dans les conditions les plus correctes. Les bougies neuves, d’abord vérifiées par immersion dans l’eau et insufflation d'air sous pression pour être certain qu’elles n’élaient pas fissurées, avaient été stérilisées à l’autoclave. Ce n’est que lorsque le bouillon, ayant imbibé complètement la bougie, s’écoulait goutte à goutte par filtration dans le récipient. stérile, qu’on faisait le vide dans ce dernier, sans jamais dépasser une dépression de 20 centimètres de mercure. Au bout de dix minutes, la filtration était continuée sur une autre bougie. J

. La stérilité du filtrat fut vérifiée par ensemencement

de plusieurs centimètres cubes sur bouillon et sur gé-

se 40, 2

jose : aucune colonie dé choléra des poules n’apparut sur ces milieux placés à l’étuve à + 37° pendant plusieurs semaines. D'autre part une certaine quantité de filtrat concentré dans le vide sulfurique fut ensemencée sur pomme de terre glycérinée et sur milieu de Pétrof : après plusieurs mois de séjour à l’étuve ces milieux resterent stériles.

Le filirat était conservé à la glacière en ampoules scellées.

Nous l’avons inoculé aux cobayes tous les deux jours, à doses croissantes, avec le rythme suivant : d’abord par voie sous-cutanée © Cm° 1, O Cm* 2, Oo Cm 3, O CM° 4, COCHE DU par voie intrapéritonéale 1 cm°, 2 cm’, h cm°, 8 cm’, 10 cm*.

Après quelques jours d’interruption, les injections intrapéritonéales étaient reprises à la dose de 10 cm, à 15 jours d’intervalle.

Inoculations de tuberculine

Nous avons utilisé la tuberculine brute pour usage vétérinaire del’Institut Pasteurou {uberculine ancienne de Koch. Nous n’en rappellerons pas le mode de préparation, mais dirons seulement qu'elle provient de la concentration, au dixième de son volume, du bouillon glycériné à 4 % sur lequel s’est développé un voile âgé de 5 semaines. Voici d'après CALMETTE (19, pp. 107-108) ce qu'elle contient :

« La tuberculine initiale de R. Koch renferme à la fois les poisons solubles excrétés par le bacille dans les milieux de culture, les exotoxines, et une partie des poisons protoplas-

miques endobacillaires, dont la concentration lente À chaud, en milieu de plus en plus riche en glycérine, facilite la diffusion dans le liquide.Mais les exotoxines ysontsurtout abondantes car d’une part les bacilles tuberculeux retenus sur le filtre après la macération sont à peine moinstoxiques ques’ils avaient simplement été tués par un chauffage d'égale durée, et d'autre part on peut préparer une tuberculine — sensiblement moins toxique il est vrai, mais encore active — en concentrant directement les milieux de culture dont on a préalablement séparé les B. K. Cest d'ailleurs ainsi que procédait Denys (de Louvain) pour la préparation de la tuberculine employée par lui dans le traitement des malades. Cette tuberculine n’était autre chose que le bouillon de culture simplement filtré à travers des bougies poreuses. »

Nous avons injecté cette tuberculine, par voie sous- P . I culanee,tous les 2 jours en commençant par ne de cm” It

pour aboutir — comme l’avaient déjà fait dans un autre but CALMETTE et Massoz — à 1 cm° au vingtième jour.

Nous injections donc,. au début, o cm° 1, © cm* 2, o cm 3, o cm° 4, o cm° 5, d’une dilution au 1/10 de tubereuline brute dans l’eau physiologique, pour continuer par o cm* 1, 0 cm 2, 0 cm® 4, o em° 6, 0 cm 8 et 1 cm? de tuberculine non diluée.

Après quelques jours d'interruption, les injections étaient reprises à la dose de 1 cm° par semaine.

Injections d'huile éthérée Pour essayer d'augmenter le pouvoir lipasique du sang et des tissus de nos animaux d’expérience, nous leur avons injecté de lhAuile d'olive etherée, comme Guy 3