CHAPITRE PREMIER Pigments biliaires isolés
§ 1. — Pigment originel ou bilirubinique.
a) Bilirubine.
2. Propriétés. — La bilirubine [C'''tP°Az''0°] se présente sous la l'orme d'une poudre rouge sombre. Au point de vue chimique, c'est un corps à l'onction acide; c'est un acide monobasiqne, déplaçant l'acide carbonique des carbonates alcalins, en produisant des bilirubinates neutres. Quand on la fait agir sur les carbonates, elle se dissout d'abord, puis déplace une portion équivalente d'acide carbonique. La bilirubine est insoluble dans Peau, dans l'éther de pétrole et dans Pacide acétique glacial ; peu soluble dans l'éther, l'alcool, la térébenthine, la glycérine à chaud ; plus soluble dans le sulfure de carbone, l'alcool amylique, la benzine ; très soluble dans le chloroforme qui est son véritable dissolvant.
Ces solutions ont un pouvoir colorant très intense ; une solution chloroformiqueà 1 pour 40000 colore encore en jaune les tissus ; par évaporation les solutions chloroformique, benzinique, laissent déposer la bilirubine à l'état cristallisé.
3. État naturel. — La bilirubine existe-t-elle en dissolution dans les biles jaune ou rouge de l'homme et des
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animaux (porc, chien) ou en combinaison ? Telle est la première question, qui nous a occupés. Nous avons constaté l'insolubilité de la bilirubine pure dans les constituants de la bile, pris isolément ; dans les sels biliaires et enfin dans le mélange nommé bile décolorée, qui contient presque tous les éléments de la bile, sauf les substances colorantes.
Expérience. — On obtient la bile décolorée, en traitant la bile par la poudre de charbon animal, de la manière suivante (1) : 100 centimètres cubes de bile fraîche verte de veau, sont mélangés avec 40 grammes de noir animal bien lavé. Après quelques heures de repos, on évapore au bain-marie ; la masse obtenue, refroidie, est traitée par l'eau distillée et ramenée au volume primitif. Le liquide est filtré, on obtient ainsi une liqueur claire, incolore.
Ceci posé, la bilirubine est mélangée à la bile décolorée dans les proportions de 1 centigramme pour 10 centimètres cubes. En agitant, le liquide se colore légèrement en jaune, mais la plus grande partie de la poudre se dépose sur le fond.
La teinte légère qu'on observe tient à la présence d'une petite quantité de carbonates alcalins, qui possèdent la propriété de dissoudre la bilirubine, ou mieux de former une combinaison avec elle.
En effet, si l'on neutralise la liqueur exactement, par une solution diluée d'acide chlorhydrique à 1 pour 100, elle cesse de se colorer, la bilirubine n'y est pas du tout soluble.
En résumé, on doit admettre que dans la bile, la bilirubine ne se trouve pas à l'état de nature, mais à l'état de bilirubinates alcalins.
Il s'établit évidemment, dans la bile, un partage des alcalis entre les acides parmi lesquels, la bilirubine ; d'autre part, la quantité du pigment étant très petite dans la bile [son pouvoir tinctorial est considérable], les bili-
(1) Article Bile, par A. Dastre. Dictionnaire de physiologie de Gh.
HiCHET.
OXYDATIIIN 1)10 LA UILlllUBINE H
rubinates pourraient être considérés comme dissociés, h ce degré de diliilion étendue . Ce n'est que dans ce sens, qu'il serait possible de dire qu'une petite partie de la bilirubine se trouve dans la bile à l'état de nature (dissociation). En réalité la presque totalité est à l'état de combinaison alcaline.
Par rapport au pigment la bile peut donc être considérée, comme une solution de bilirubinate alcalin, dans le carbonate de soude.
4. Oxydation de la biliruliine. — Transformation du pigment. — Nons étudierons, d'abord la bilirubine seule, en poudre, en solution chloroformique,en solution glycérique ; puis ses sels, les bilirubinates.
On dit que la bilirubine C'-ir"Az*0', s'oxyde lentement à l'air et se change en biliverdine : C^-H^"Az*Os.
Cette transformation ne se produit que pour les bilirubinates [par ex. : C^-ff^NaAz^O''] de couleur rouge-jaunùtre, qui se changent en biliverdinates [C^'H^'^NaAzW], de couleur verte.
Expérience. — La bilirubine en poudre laissée dans un tube à essai plusieurs mois, exposée à la lumière, en contact avec l'air, n'a subi aucun changement.
Chauffée à lUO'' pendant plusieurs heures, elle ne change pas davantage.
Expérience. — On prépare une solution de bilii-ubine dans le chloroforme :
Bilirubine, 0 gr. 01.
Chloroforme, 10 centimètres cubes.
On agite tous les jours, à la lumière. Après un mois, le chloroforme évaporé lentement, n'a laissé au fond du tube qu'un amas d'une poudre de bilirubine et sur les parois un léger dépôt formé d'anneaux verts. Traitée par l'alcool, la masse prend une couleur vordàtre
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(biliverdine). L'oxydation de la bilirubine a été très faible; elle a coïncidé d'ailleurs, avec l'altération lente du chloroforme.
La lumière détruit donc plus ou moins lentement les solutions de bilirubine dans le chloroforme.
Capranica (1) admet que la lumière peut amener l'oxydation de la solution cliloroformique. Nous ne pouvons pas confirmer celte assertion.
Expérience. — Dissoute dans la glycérine à chaud, la bilirubine, après plusieurs jours, n'a pas changé.
11 en est de même avec les corps gras ; la bilirubine dissoute dans le chloroforme en quantité suffisante, est mélangée avec l'huile d'olive (neutre). Le mélange se fait très bien. En évaporant par la chaleur le chloroforme, la bilirubine abandonne l'huile et se concentre au fond du tube dans la goutte de chloroforme non évaporé.
Ainsi, dans tous les cas, grande résistance à l'oxydation directe, qui s'explique par la difficulté de contact avec l'oxygène.
En employant des agents oxydants faibles, tels que/'efflw oxygénée étendue, le contact n'est pas moins difficile, il n'y a contact avec l'oxygène que pour les petites portions dissoutes dans l'eau chloroformée ; conséquemment oxydation faible et lente.
En résumé : la bilirubine elle-même est peu accessible à l'oxygène et difficilement transformable en biliverdine. Cette fixation d'oxygène ne peut être obtenue que par des artifices chimiques. C'est ce qu'ont fait Hugounenq et Doyon avec le bioxyde de sodium, Jolies avec la solution alcoolique d'iode, Haycraftet Scofield avecl'éther ozonisé ou avec le pôle positif du courant électrique appliqué à la bilirubine biliaire imbibant un papier filtre, et nous-
(1) Capranica, Archives de biologie italiennes, 1882, p. 87.
lilIJIHRIiVATES 13
mêmes avec le bioxyde d'hydrogène. On verra que réciproquement la transformation inverse de bilivenline en biliruliino peut être obtenue par les agents chimiques de réduction (amalgame de sodium, hydrogène sulfuré, pôle négatif de la pile, etc.).
Nous venons de voir que ces transformations ne se produisent pas spontanément à l'air, c'est-à-dire que les solutions de bilirubine vraie n'absorbent pas l'oxygène de l'air pour passer à l'état de biliverdine. La transformation, au contraire, se produit avec les bilirubinates qui deviennent biliverdinates. Voilà donc ce que l'on entend, lorsque l'on parle de la transformation lente à l'air de la bilirubine en biliverdine ; on a en vue les sels correspondants.
Il faut être prévenu de cet abus de mots qui se commet continuellement; on dit Inlïriihme au lieu de bilïnibïnate ou inversement. On confond donc trop souvent, dans le langage, l'acide avec son sel alcalin. De même, quand on emploie le mot « pigment fondamental », on l'applique indifîéremment à la bilirubine ou aux bilirubinates. Les indications que nous venons de fournir montreront suffisamment dans chaque circonstance s'il s'agit de l'acide ou du sel.
h) Les bilirubinates.
On peut dissoudre la bilirubine (acide bilirubinique) dans la soude ouïes carbonates alcalins jusqu'à neutralité ; on a ainsi non pas une solution, mais un véritable sel. L'alcali joue un double rôle : il se combine à l'acide, puis il agit comme dissolvant du sel.
Inversement, les acides minéraux décomposent les bilirubinates alcalins et déposent la bilirubine insoluble.
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Les bilirubinates alcalins sont solubles dans l'eau, comme tous les sels alcalins: ils sont insolubles dans le chloroforme.
Réaction caractéristique avec la lessive alcaline. — Si l'on part d'une solution chloroformique de bilirubine, et si l'on agite cette solution avec une lessive alcaline, la bilirubine quitte le chloroforme qui se décolore pour passer à l'état de bilirubinate dans la liqueur aqueuse. r>elui-ci reste dissous si la quantité d'eau est suffisante : mais si l'on a opéré avec une faible quantité d'alcali concentré, le bilirubinate se précipite. De même le sulfate d'ammoniaque à saturation précipite les bilirubinates alcalins.
Cette réaction différencie labilirubine d'autres pigments tels que la lutéine des corps jaunes ovariens et du jaune d'œufdont les solutions chloroformiques agitées avec le carbonate de soude n'abandonnent pas à celui-ci leur matière colorante.
Les bilirubinates alcalins agités au contact de l'oxygène ou simplement abandonnés à l'air se transforment en biliverdinales.
Sels alcalino-lerreu-T. — La bilirubine se combine encore avec les terres alcalines pour former des bilirubinates alcalino-terreux .
Ces sels sont insolubles dans l'eau et insolubles dans le chloroforme. Ils constituent la masse principalede certains calculs biliaires (calculs de bilirubinate de chaux uni à d'autres substances, chez le veau).
Si l'on part d'un bilirubinate alcalin, on le transforme facilement en bilirubinate alcalino-terreux en le traitant par une solution de sel terreux, par exemple parle clilorure de calcium. Le bilirubinate calcique insoluble se dépose : il a pour formule C'-^P^^aAz*0^
iiii.iiu.iiiNAi'i:s 15
Les hilirubinalcs de plomb, d'argcnl, etc., sont également insolubles.
Voici le tableau des solubilités :
EAU. r.nr.oiiOFOiiME. alcool. iîtiier.
Bilirubine ïnsoliiltlc. Soliible. un pcusolnblo. très peu soluble.
Hilirubinalcs .ilcalins ..... Sobiblcs. Insolubles. Insolubles.
Bilirtibinates alcolino-lerrcux . , . Insolubles. Insolubles. Insolubles. Insolubles.
o. Préparation «lu biliruhiiiate de sodînm. — On
prend 0 gr. 066 de bilirubine en poudre pour iOO centimètres cubes de la solution de carbonate de soude à 1 pour 1000. Le pigment se dissout rapidement, en prenant une couleur jaune rouge.
Le liquide contient du bilirubinate de soude et du carbonate de soude : c'est ce mélange que l'on appelle la solution alcaline. La solution neutre s'obtient en neutralisant exactement avec l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique ; c'est un liquide qui à côté du bilirubinate contient de l'acétate et du chlorure de sodium.
6. Couleur. — \° Les bilii'ubinates alcalins sont solubles dans l'eau. Contrairement à l'opinion commune (Staedeler) ils y sont peu solubles (100 grammes d'eau dissolvent moins de 0 gr. 006 de bilirubinate de soude à la température ordinaire) ; ils sont solubles dans les alcalis et les carbonates alcalins.
2° La coloration d'une solution de bilirubine ou de bilirubinate varie graduellement du rouge grenat sombre au jaune paille, suivant la concentration. Les couleurs extrêmes sont très distinctes : rouge et jaune.
Prenons comme dissolvant le carbonate de soude à 1 pour 100 ; ajoutons-y de la bilirubine : si la quantité atteint 0 gr. 04 pour 100 du dissolvant, la couleur est rouge; en augmentant le dissolvant, la couleur devient jaune paille ; si l'on continue à étendre le carbonate de soude, la teinte restera jaune et sera seulement diluée.
16 PROPRIÉTÉS DES BILIRUBlNATES
On aura le même résultat en employant des solutions de soude aux titres de 15 pour 100, 30 ou 60 pour 100.
En ajoutant des acides (acide acétique, par exemple), on ne fera que diluer la liqueur tant qu'on ne dépassera pas la neutralisation ; l'effet sur la couleur sera donc le même: à la couleur rouge, correspondant à la concentration forte, succédera le jaune de plus en plus clair des concentrations faibles.
Il est à remarquer que les choses se passent de même avec les solutions de bilirubine dans le chloroforme. La bilirubine acide et ses sels alcalins se comportent donc de même au point de vue de leur teinte dans les solutions.
3° D'après la couleur, on peut se faire une idée de la teneur en bilirubine d'une solution de bilirubinate et de sa réaction.
Les solutions de bilirubinate de soude dans l'eau, sont toujours jaune paille. Elles ne peuvent pas être rouges parce qu'elles ne contiennent pas pour cela assez de bilirubinate, qui est faiblement soluble dans l'eau ; aussi lorsqu'en prenant une solution de bilirubinate dans le carbonate à 1 pour 100, on neutralise par l'acide acétique ou l'acide chlorhydrique, une partie du bilirubinate est précipitée etla liqueur, tout à fait neutre, présente une couleur jaune clair. Le jaune paille est la teinte d'une solution neutre ; une couleur rouge indique au contraire un liquide riche en pigment et de réaction alcaline. Dans les liqueurs franchement acides le bilirubinate est simplement en suspension et se dépose à la longue.
7. Propriétés. — La bilirubine acide et ses sels alcalins ont la même couleur .
i° Si nous traitons une solution de bilirubinate par un
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acide ou pur un alcali, c'esl-à-dire si nous passons de la bilirubine au bilirubinalc ou inversement, nous n'observerons pas de changement de couleur; il pourra se produiie un précipité par l'acide, une redissolution par l'alcali, mais, dans aucun cas, nous n'aurons de variation de couleur; pas de virage. Cette observation est essentielle pour la suite.
2° Une autre observation importante et qui résulte de ce que l'acide bilirubinique déplace l'acide carbonique des carbonates, c'est que, si l'on fait passer un courant d'acide carbonique dans une solution de bilirubinate, rien ne sera changé ; la couleur restera la même.
3° Une troisième observation est relative à la stabilité de la bilirubine et des bilirubinates.
La solution de bilirubine dans le chloroforme se conserve très longtemps sans changement à l'obscurité. A la lumière, elle finit par se décolorer; cette altération coïncide, d'ailleurs, le plus souvent, avec une altération du chloroforme lui-même.
Les bilirubinates alcalins en solution sont stables à la température ordinaire, en l'absence d'oxygène. Dans un tube où l'on a fait le vide, ils se conservent sans changement de couleur, que le tube soit à la lumière ou à l'obscurité. — Sous l'action de l'oxygène de l'air, ils se changent en biliverdinates, ti'ès lentement à l'obscurité: le verdissement commence à la surface et se propage à la profondeur à mesure que l'oxygène s'y dissout. A la lumière, l'action est très rapide.
4° Si l'on soumet au vide une solution de bilirubinate alcalin, elle ne s'altère point; il n'y a pas de changement de couleur.
5° La chaleur fait éprouver aux bilirubinates des modi-
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fications plus ou moins profondes qui seront étudiées avec quelque détail plus loin. Nous verrons que la chaleur favorise à un haut degré la fixation de l'oxygène sur le bilirubinate et sa transformation en biliverdinate. C'est un agent énergique de verdissement dont l'effet se fait sentir même en présence de quantités très faibles d'oxygène, telles que celles qui peuvent être dissoutes dans la solution debilirubinate.
Mais, en outre de cette action, la chaleur en exerce une autre, laquelle se manifeste seule lorsqu'il n'y a pas d'oxygène, que l'on opère dans le vide. Elle détermine un dépôt, un précipité ; elle rend les bïlrrubhiates alcalins moins solubles. Il faut ajouter une nouvelle quantité d'alcali pour compenser cet amoindrissement de solubilité.
Les cinq caractères tirés de : la solubilité ; la conservation de la couleur sous l'action des acides et des alcalis ; sa conservation sous le courant d'anhydride carbonique ; la stabilité générale ; l'indifférence au vide, sont ceux qui vont nous servir pour juger la question des transformations de la bilirubine.
8. Bilirubinate d'aniniouioni. Préparation. Proprié-* tés. — On l'obtient en dissolvant la bilirubine dans l'ammoniaque.
On mélange : Bilirubine 0 gr. 01 ; Ammoniaque 10 centimètres cubes de la solution 1/100.
On peut faire avec cette solution les mêmes épreuves qu'on fera plus loin avec le bilirubinate de sodium. On aura les mêmes résultats quant à l'action de l'air, de la lumière, de la chaleur.
