Détermination île la quantité de bilirubine

Nous avons déterminé la quantité de la bilirubine par le procédé de A. Jolies.

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La solution alcoolique d'iode constitue un agent d'oxydation, gradué et faible, qui transforme complètement la bilirubine en biliverdine sans dépasser ce terme. La réaction a lieu d'après la formule C^WAv.H)'' + il -f 2H0 = C^Wf-A'/Os -\- 4HI, d'après laquelle 508 d'iode répondent à 572 de bilirubine, ou en d'autres termes 1 centimètre cube delà solution alcoolique d'iode centi-normale (1 gr. 27 pour 1000 d'alcool) correspond à Ogr. 00144 de bilirubine.

La fin de la réaction est marquée par la coloration verte pure de liqueur ; par les caractères spectroscopiques de la biliverdine ; par l'invariabilité de la teneur en iode.

En titrant l'iode employé (différence entre la quantité ajoutée et celle qui reste en excès) on sait, du même coup, combien il y a de bilirubine.

On emploie, pour l'opération, la bilirubine en solution chtorofor' mique (1 centigramme pour 30 centigrammes de chloroforme), on ajoute la solution centi-normale d'iode par gouttes et on agite. La liqueur devient verte. On sait la quantité d'iode employé ; il faut savoir ce qu'il en reste dans la liqueur. Pour cela, on emploie, comme dans le procédé d'iodimétrie, la solution centi-normale d'hyposulfite de soude cristallisé (2 gr. -iO pour 1 litre d'eau), dont chaque centimètre correspond à 1 milligr. 27 d'iode.

Afin de faire agir cette solution aqueuse sur la solution chloroformo-alcoolique, il faut ajouter à celle-ci de l'iodure de potassium (10 ce. de la solution à l/lO) et de l'eau (100 ce). On additionne rhyposulfite de 3 ai centigrammes de liqueur d'amidon à 1/100 et l'on verse la liqueur alcoolique iodurée d'iode, dans une quantité donnée d'hyposulfite, jusqu'à coloration bleue de l'amidon iodé. La quantité d'iiyposulfite employée fait connaître la quantité d'iode qui existait dans la liqueur.

C'est là le procédé applicable pour la solution chloroformique dé bilirubine et pour les bilirubinates. Mais quand un opère sur une liqueur complexe comme la bile, il faut prendre quelques précautions.

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§ 2. — Pigment définitif ou biliverdinique.

La biliverdine, pigment définitif, provient par oxydation de la bilirubine, dont elle diffère par deux atomes d'oxygène en plus C^'H^^Az^O' = C^'H^^Az'O' + 0^

Cette transformation se produit spontanément à l'air ; les solutions alcalines (bilirubinates) y verdissent lentement; le verdissement est rapide en présence des agents oxydants et de la lumière.

lO. Biliverdine. Soinbilité. — La biliverdine est insoluble dans l'eau et l'éther, comme la bilirubine. Mais à l'inverse de celle-ci elle est insoluble dans le chloroforme pur.

Elle est très soluble dans l'alcool qui est son dissolvant de choix (bleu verdàtre avec fluorescence rouge), et très soluble dans l'acide acétique glacial et dans la solution chloroformique d'acide acétique glacial : par quoi elle se distingue encore de la bilirubine. Ces remarques fournissent le moyen de séparer ces deux substances.

La biliverdine a la fonction acide ; elle forme des biliverdinates et elle décompose les carbonates alcalins.

U faut être prévenu qu'on dit souvent : biliverdine pour biliverdinaie ; les circonstances montrent assez s'il s'agit de l'acide ou du sel. Le nom àQ pigment définitif s^^'çWque aussi indifféremment à l'un et à l'autre.

Il est indispensable de faire observer, pour comprendre la suite, que les solutions de bilivei-dine dans l'alcool ou l'acide acétique, et les solutions de biliverdinate dans l'eau et dans les liqueurs alcalines, présentent la même

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couleur, variant du verl omeraude au vert foncé suivant la concentration.

Comme la bilirubine, la biliverdine (poudre) introduite dans une solution de carbonate de soude, s'y dissout d'abord,prend ensuite la place de l'acide carbonique et le biliverdinate se dissout lui-même dans la liqueur alcaline.

11. Bilîverdiiiates. — Us sont plus solubles dans l'eau que les bilirubinates. A tous les autres égards leur bistoireest parallèle à celle des bilirubinates. Nous avons dit que la biliverdine et les biliverdinates présentent la même couleur; par conséquent, il n'y a pas de virage si l'on passe de la biliverdine au biliverdinate ou inversement. Si l'on traite une solution de biliverdinate alternativement par un acide ou un alcali, par l'acide acétique et la soude, il n'y aura pas de changement de couleur.

Le courant d'acide carbonique ne change pas la couleur du biliverdinate.

Les solutions de biliverdinates (et aussi de biliverdine) sont très stables dans les conditions ordinaires, en excluant, bien entendu, l'action des microbes.

Le vide aussi est sans influence sur les solutions de biliverdinates.

Les cinq caractères tirés : de la solubilité, de la stabilité et de la conservation de la couleur sous l'action de l'acide acétique, de la soude, de l'acide carbonique et du vide caractérisent le pigment vert, la biliverdine et les biliverdinates.

13. Altérations des biliverdinates sous l'action des microbes. Putréfaction spontanée de la bile verte. —

Les solutions de biliverdinates peuvent s'altérer sous l'action des microbes ; nous ne parlons pas évidemment des

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solutions pures clans lesquelles des organismes vivraient difticilement, mais des solutions auxquelles se trouvent mêlées des substances organiques convenables et spécialement de la bile.

La bile verte — rendue verte par les biliverdinales — s'altère spontanément à l'air. Au bout de peu de temps (deux jours à quatre jours dans les circonstances ordinaires) les tubes qui la renferment commencent à jaunir par le fond, les couches supérieures restant vertes. Le jaunissement remonte successivement et il ne reste bientôt plus de couleur verte que dans la couche supérieure, tout à fait au contact de l'air. Hugounenq et Doyon ont bien étudié ce phénomène et déterminé les microbes qui le produisent (1). Le plus remarquable est un cocco-bacille très mobile, liquéfiant la gélatine et ne fixant pas le Gram. Mais il existe un grand nombre d'autres bacilles réducteurs, staphylococcus aureus, vibrion septique, bacille coli, etc. La matière colorante qui se produit est jaune verdâtre sous faible épaisseur ; elle est rouge en grandes quantités. Elle a des bilirubinates le caractère de la couleur, du spectre continu sans bandes déterminées avec absorption aux deux extrémités. Elle s'en distingue en ce qu'elle ne donne la réaction de Gmelin ni la réaction d'Ehrlich. Elle diffère donc assez notablement des pigments fondamentaux : elle en diffère plus que leurs dérivés immédiats, bilicyaniue, cholételine, etc. C'est une espèce de corps urobiHnoïde.

Haycraftet Scofield (2), quelques années auparavant,

(1) HofiOUNKNQ et Doyon, Recherches sur les pigments biliaires. Archives de Physiologie, 1896, p. ")2o.

(2) J.-B. Haycraft et H. Scofield, Zur Farbenlehre der Galle. Cenlralblatt fur PhysioL, 1889, p. 222.

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avaient observe ce même phénomène du jaiinissemenl de la bile verte par le l'oiul du lubc. Leurs observations sont moins précises que les précédentes. Elles en diffèrent par un point essentiel. Le pigment jaune qui se forme dans celle putréfaction spontanée de la bile serait tout simplement le pigment bilirubiiiique. il donnerait la réaction de Gmelin : il reproduirait la biliverdine. Il s'agirait d'une simple réduction de la biliverdine par oxydation.

1° Cette contradiction entre des expérimentateurs également connus pour leur habileté nous a intéressés. Nous avons reconnu facilement qu'ils avaient raison les uns et les autres. Leur divergence s'explique par le moment, plus ou moins éloigné, où ils ont fait leur observation. Au début, pendant les premiers jours, on trouve comme Haycraft et Scofield un pigment jaune qui est réellement constitué par la bilirubine (bilirubinale) avec tous ses caractères, y compris la réaction de Gmelin et la possibilité de repasser au vert sous l'influence des agents qui oxydent la bilirubine, chaleur, lumière en iirésence de l'oxygène, etc.

Au contraire, si l'on attend plus longtemps, et qu'on examine la bile de veau abandonnée à l'altération spontanée, après 0, 8, 15 jours, il se fait un précipité, la liqueur est jaune sale et alors elle ne donne plus la réaction de Gmelin, comme l'ont vu Hugounenq et Doyon.

2" II faut plus ou moins longtemps pour passer delà première phase à la seconde. Nous avons pu condenser le phénomène dans un court espace de temps, par l'artifice suivant :

Nous prenons de la bile verte de veau et nous la laissons s'altérer pendant un lemps variable, à la lempéi'alure du laboratoire et de l'éluve. Nous avons ainsi des biles pu-

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tréfiées de 2 jours, 4 jours, 8 jours, 12 jours, etc. Ces échantillons vont nous servir pour l'ensemencement ; nous les désignerons par les numéros 2, 4, 8, 12, etc.

D'autre part, nous recueillons de la bile fraîche de veau — bile qui ne contient que de la biliverdine — et nous sommes assurés d'obtenir ce résultat, en la chauffant pendant une demi-heure à 1 00° en présence de l'air. — On en prépare plusieurs tubes A, B, C, D, etc.. Quelques-uns de ces tubes sont fermés pendant le chauffage même ; ils se conserveront indéfiniment à l'obscurité ou à la lumière, avec leur couleur verte. — Les autres seront ensemencés avec les précédents, en mettant 1/2 centimètre cube du contenu putréfié dans 3 centimètres cubes de bile verte.

On observe que les tubes A, B, C, ensemencés avec la bile des premiers jours (2), (3), (4), s'altèrent lentement à leur tour. — Au contraire, en ensemençant avec la bile altérée d'une période plus avancée, par exemple du 12° jour, on obtientdes phénomènes très rapides. Au bout d'une heure de contact, à 40°, la bile verte commence à jaunir: après 3 heures le jaunissement est complet: la réaction de Gmelin, celle de l'iode alcoolique, l'action du chauffage montrent que l'on a affaire à un bilirubinate.

Après 18 heures de contact cette première phase est dépassée. La liqueur est devenue trouble : elle ne donne plus la réaction de Gmelin, ni les autres réactions du pigment bilirubinique. On a aflfaire au pigment urobilïnoïde.

3° La rapidité avec laquelle s'est produite la première phase, la transformation de la biliverdine en bilirubine, nous a amenés à nous demander si cette action était due au développement des microbes eux-mêmes, ce qui serait difficile à concevoir, ou simplement à l'action de quelque produit soluble qui existerait dans la bile d'ensemencé-

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ment. — Déjà, on conslalo au moyen du papier à l'acétate (le plomb que cette bile d'ensemencement contient do l'acide sulfhydrique ou du sulfhydrate d'ammoniaque provenant de la taurine de l'acide taurocholique. Et, d'autre part, nous avons montre que ces agents réducteurs ramenaient très rapidement la biliverdine à l'état de bilirubine.

Nous avons donc introduit dans un ballon Pasteur(inuni du filtre poreux et garni de deux tubulures) de la bile verte biliverdinique. Puis, nous avons fait pénétrer, de la même manière, c'est-à-dire par la filtration à la trompe, la bile putréfiée, dont les microbes sont dès lors arrêtés. La transformation de la biliverdine en bilirubine a eu encore lieu.

Ainsi, c'est un produit soluble qui a exercé le premier effet de réduction. Ce n'est pas une réduction vitale. — Il était intéressant de décider, en détruisant au moyen d'un sel de plomb l'acide sulfbydrique de la bile putréfiée avant de l'ajouter, si c'est véritablement l'acide sulfhydrique qui a agi ici. I^ 'expérience paraît confirmer cette vue. Mais l'action n'a pas été, dans ce cas, poussée très loin ; on n'est pas arrivé jusqu'à la formation du produit urobilinoïde (1).

§ 3. — Pigments intermédiaires ou biliprasiniques.