C. Enrobage. — L'objet étant ainsi à la fois coloré et

ANN. SG. NAÏI. ZOOL. IX, 7. — ART. N° 3.

déshydraté, il s'agissait de l’inclure dans la paraffine. L'huile de cèdre m'a paru le plus précieux des véhicules employés. Mais, plus récemment, j'ai pu supprimer complètement pour de pelits objets celte partie de l'opération et la remplacer par un procédé beaucoup plus expédilif que m'a indiqué M. Viallanes. Au sortir de l’alcool absolu, l’objet est plongé dans le toluène, où il peut rester longtemps sans s’altérer. Cette substance se mélange parfaitement à l'alcool absolu.

On fait le vide dans le tube au moyen d’une trompe à eau, ce qui favorise la sorlie de l’alcool et la pénétration du toluène. On fait ensuite l'inclusion dans la paraffine chaude, en faisant encore le vide dans le tube. Le toluène, très volalil, est enlevé et la paraffine pénètre très rapidement. Quelques minutes suffisent en effet pour les objets très petits.

La paraffine employée est de la paraffine allemande fondant à 52°. Toutefois, en été, pour faire des coupes très minces au 1/400° par exemple, la paraffine française à 60° m'a donné de bons résultats. Quand la pénétration est jugée accomplie, un peu de paraffine est coulée dans un verre de montre qui à été recouvert d'une très mince couche de glycérine. L'objet est plongé dans celte paraffine encore liquide, et alors délaché rapidement de son support de liège. La paraffine est refroidie brusquement dans l’eau froide; par un trait tracé sur le bloc on indique, avant le complet refroidissement, le sens dans lequel les coupes devront être failes. Une fois refroidi, le bloc se détache de lui-même de la coupelle, grâce à l’interposition de la glycérine. Il est coupé de la grandeur voulue el fixé à la cuvette du microtome de Dumaige (1).

Les coupes, comme on sait, s’obliennent en séries continues, au moyen de cel excellent appareil, et il est facile d’en faire spontanément varier l'épaisseur ; j'avais ainsi à volonté dans une même série des coupes au 100°, au 200° et au 400° de millimètre.

(4) L'emploi de la glycérine a été indiqué par M. Garnault dans sa monographie du Cyclostome.

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D. Montage des coupes. — Pour monter les coupes j'ai employé un procédé frès simple que je n'ai vu encore indiqué nulle part. {l est souvent important de pouvoir traiter les coupes une fois collées par des réactifs variés. On peut en effet avoir besoin de colorer à nouveau des coupes trop pâles, ou inversement, d'éclaircir des coupes opaques, d'étaler des coupes plissées ou même d'ouvrir sans les détériorer des préparations complètement montées dans le baume.

J’ai renoncé successivement à tous les procédés qui m'avaient élé indiqués, quoique j'eusse reconnu leurs avantages respectifs; mais chacun d'eux m'a semblé présenter de graves inconvénients : la gomme laque et le collodion ne résistent pas à un lavage à l'alcool absolu, et ne donnent pas des préparations bien planes : l’albumine glycérinée de Mayer a l'inconvénient de se colorer trop fortement par les substances que j'employais et de sécher difficilement, ou bien de présenter, par la dessiccation, des craquelures fort génantes. :

Je me suis arrêté à l'usage de la gélatine, dissoute dans vingt-cinq fois son poids d'eau et filtrée. Une couche épaisse de cette substance bien chaude est étendue sur la lamelle ; les séries de coupes, coupées en segments de longueur convenable, sont déposées parallèlement, et la lamelle est portée sur la platine chauffante de Malassez à une température voisine de 40°. On voit alors les coupes s’étaler parfaitement sur la gélatine sans se séparer les unes des autres. Tous les plis disparaissent et l’ensemble des coupes devient parfaitement plan. On enlève le plus possible du liquide avec un papier buvard jusqu’à ce que la couche de gélaline soit invisible ; on laisse ensuite sécher pendant douze heures. Parfois il arrive que la couleur bleue disparaît quand on chauffe la gélatine : c’est que cetle substance est alors alcaline. On évite cet accident en y ajoutant une très pelile quantité d’un acide quelconque. Les coupes ainsi collées résistent à tous les agents. On commence dans tous les cas par se débarrasser de la paraffine au moyen du xylène ; si l’on voit

alors que la coloration est salisfaisante, on monte les coupes dans le baume de Canada, qui me semble à tous égards préférable à la glycérine.

Pour décolorer les coupes trop bleues, je les maintiens ‘quelque temps dans un mélange à volumes égaux d'alcool absolu, de girofle et de xylène. Plus souvent on a à colorer des coupes trop pâles ou bien à ajouter une coloralion nouvelle ; les deux matières qui m'ont donné les meilleurs résultats pour l’un ou l’autre de ces deux usages sont le vert de méthyle et le bleu de méthylène. Ils doivent être dissous dans un mélange à volumes égaux d'alcool absolu et de xylène ; l'alcool absolu employé pur détériore les tissus el exfolie la gélatine. Le vert de méthyle réussit en solution très concentrée, et si l’action est prolongée pendant plusieurs heures; Le bleu de méthylène colore plus rapidement, el son action doit être arrêtée dès que la gélatine commence à bleuir. On peut, suivant que la substance colorante est concentrée et employée pendant peu de temps, ou bien peu concentrée et maintenue pendant un temps plus long, oblenir des sélections spéciales qui ont un certain intérêt : ainsi le mucus et, à un moindre degré, les muscles se colorent rapidement el fortement : ils se décolorent de même sous l'action du réactif cité plus haut. Au contraire, l'effet produit sur les nerfs est plus lent et plus durable. En définitive, en employant les substances colorantes dans les proportions citées plus haut, on n’a à faire usage des coloralions ou des décolorations après coup que si l’on fait varier nolablement l'épaisseur des coupes. Les proportions indiquées donnent des teintes encore suffisantes pour des coupes au 400°; elles sont beaucoup trop vives pour des coupes au 100°. D'une manière générale, les muscles restent colorés d’un bleu violet intense ; le mucus d’un bleu pur, les nerfs d'un bleu presque pur plus pâle; les cellules épithéliales ont leurs membranes bleues et leurs contours roses: les cellules nerveuses sont roses el les cellules neuro-épithéliales rouge vif; enfin Les noyaux n'absorbent pas le bleu.

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Pour l’histologie fine des tissus nerveux j'ai trouvé un grand avantage à ajouter à l'alcool absolu une pelite quantité d'acide chromique solide avant d'y faire dissoudre le bleu de méthylène; celui-ci prenait une teinte plus vive, comme il arrive lorsqu il est en présence de lacide chromique dissous dans l’eau. L’acide, avant qu'il ait commencé à décomposer l'alcool, garde les propriétés dissociantes à l’6gard du système nerveux et sert en même temps de mordant pour la malière colorante. J’obliens ainsi sur les coupes, avec facilité, une teinte d’un bleu intense pour toutes les fibrilles nerveuses, qui apparaissent avec autant de netteté qu'à la suite des meilleures dissocialions à l’acide chromique.

$ 2. — Dissociations.

La méthode de dissociation m'a servi surtout pour l’étude de l’épithélium. Son application présentait dans le cas actuel des difficultés spéciales qui ont détourné jusqu'ici de l'examen des Prosobranches tous-les zoologistes qui s’occupaient de ces questions. Flemming dit en effet formellement que la dissociation des cellules épithélales des Prosobranches ne Jui à jamais donné de résultats satisfaisants, et cependant il s’adressait aux animaux d'eau douce ; cela tient à ce que chez eux les plateaux des cellules épithéliales ciliées sont très épais et bien plus solidement unis que dans les autres groupes. Aussi lorsqu'on tente des dissocialions, les plateaux tombent-ils souvent tout d’une pièce. D'autre part, le gonflement bien connu du mucus sous l’action de l'eau rendant incommode l'usage des réactifs faibles et à action lente, j'ai emplové, après bien des essais, un mélange composé des substances suivantes :

ATCOO ANTON RM RES eee cote 10 grammes.

Acide chromique au 1/1000€............ 10 — CMCOHNE PEAU EEE rec 5 — AGIT ACELIQUERS retenir ceci 5 AURA RTE De ne telne Fete contre 200€ —

Ce liquide coagule rapidement le mucus et permet d'i-

soler les cellules avec les aiguilles au bout d’un temps variant d’un quart d'heure à trois heures; la forme des cellules est d’ailleurs conservée d’une manière satisfaisante.

Dans une note publiée précédemment j'ai indiqué comme un excellent réactif dissociant le chlorure de ruthénium. J'employais ce sel en dissolution étendue d'une nuance jaune orangé; il jouit à peu près des propriétés de l'acide chromique faible, mais il fixe mieux les tissus et surtout ne déforme pas les cellules comme l'acide chromique au millième si son action se prolonge. La teinte qu'il communique est plus vive, plus fixe et surtout présente cel avantage qu'elle est pour le système nerveux d’un ton presque gris sur un fond général orangé. Après l’action du chlorure de Ruthénium pendant un quart d'heure, le système nerveux inter-épithélial de la fausse branchie peut être dissocié el mis en évidence clairement au moyen d’un pinceau fin. J’obtenais aussi de belles préparalions destinées à montrer par transparence le tissu intérieur des organes en lamelles ; malheureusement ce produit ne se trouve pas dans le commerce, et je n'ai pu m'en procurer qu'une seule fois au laboratoire de M. Debray.

S 3. — Observations par transparence.

Celte méthode s'applique tout naturellement à l'étude des organes plats et minces tels que les feuillets de la branchie, de la fausse branchie et de la glande à mucus. Malgré sa simplicité, elle a donné jusqu'ici des résultats peu exacts à plusieurs des observateurs qui l'ont appliquée aux animaux dont je m'occupe. En effet, les anciens zoologistes se gardaient d'enlever l’épithélium, ils ne coloraient pas les tissus : il leur était par suite impossible de connaître les éléments situés dans l'épaisseur du feuillet. Il est au contraire indispensable de traiter d’abord l'organe à examiner dans son ensemble par un réactif permettant d'enlever facilement l'épithélium sous l’action d'un filet d’eau ou d'un pinceau. L'alcool au tiers et surtout l'acide chromique au 1/10,000°

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conviennent {rès bien pour cet usage. La membrane de soutien sur laquelle s’insèrent les cellules épithéliales est toujours irès résistante, et l’on peut, avec un peu de soin, éviter de dilacérer ce feuillet, ou d’écraser les tissus sousjacents. Après être restés une heure environ dans l'acide chromique, les feuillets sont portés dans une dissolution colorante, lavés avec soin et examinés dans la glycérine. J'employais pour diverses lamelles d'un même organe le picro-carminate, la purpurine (pour l'étude des muscles), l’hémaloxyline, et surtout le bleu de méthylène dissous dans de l'acide chromique au 10/1000"; il était facile d’ailleurs de faire des colorations doubles. La membrane de soulien, quoique vivement colorée en bleu, reste toujours parfaitement (transparente. |