CHAPITRE II

Technique de l'étude de la résistance leucocytaire

Deux principes dominent toute l'étude de la résistance leucocylaire. Ils sont à la base de toute recherche de ce genre; nous croyons néanmoins bon d'insister ;

1° Il faut se rendre maitre de la technique au prix d’un lemps assez long et de quelques déceptions.

20 Le pourcentage des leucocytes pouvant être grandement influencé par les idées préconçues et les désirs de l'opérateur, ce dernier doit se mettre en garde contre lui-même en s’attachant à vouloir ignorer durant tout le temps de ses recherches les résultats qu'il obtient.

A ce prix seul, les conclusions que l'on est appelé à tirer ont quelque valeur.

Pour ces raisons, nous avons tenu à ignorer systématiquement les résultats obtenus tant par l'Ecole d'Achard que par J. Carles et P. Mauriac; nous avons durant toutes nos observations écarté toute recherche bibliographique.

Nous nous sommes également borné à inscrire au jour le jour, les uns à la suite des autres, les résultals que nous donnait chaque pourcentage. Ce n’est qu'au moment de la rédaction délinitive de nos observations que nous avons ordonné ces résullats en élablissant des graphiques.

Nous étant muni de pareilles précautions au risque d'assister impuissant à la faillite de notre méthode, et de considérer notre travail comme indigne de toute conclusion, nous avons eu le plaisir de constater que pour la même affection nous avions des

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courbes presque identiques entre elles et rappellant celles qui avaient pu être établies par nos devanciers.

Nous ne voudrions cependant pas en semblant entourer notre méthode de tant de mystères la faire juger très sévèrement ou laisser supposer qu’elle n’est à la porlée que de rares privilégiés. Le fait seul que, nous étant entouré de loutes les précautions énoncées, nous ayons trouvé des résultats concordants: est une preuve irrélutable de la qualité de la méthode. Les doutes qui d’ailleurs nous ont été déjà formulés, sur l’allération artificielle de la résistance leucocytaire au cours des manœuvres de manipulation, tombent devant cette preuve. Nous sommes loin de nier que les traumatismes que l’on fait subir aux leucocytes ne provoquent à un certain degré leur destruclion. Mais qu'importe si ce degré est toujours le même. Tout ce que nous sommes en droit de demander à une pareille méthode est de permettre d'établir des relalivités, des comparaisons. Nous croyons qu'elle remplit cette condition.

Elle est aussi à la portée de tout le monde, Entre toutes les mains suflisamment exercées elle donne les mêmes résultats. C'est une épreuve de laboratoire qui, tout en étant plus délicate, mérite d'avoir sa place à côlé de la résistance globulaire; elle ne sort donc pas du domaine de la clinique.

Il existe certainement un facteur individuel: bien que pour la résistance normale nous ayons trouvé le même chiffre que MM. J. Carles et P. Mauriac, il est fort probable qu'il n’y aura pas toujours un accord parlait entre tous les observateurs. Mais qu'importe, les variations seront loujours les mêmes, les courbes seront établies à un degré plus ou moins élevé, elles auront toujours la même forme.

Le technique que nous avons employée est, dans ses grandes lignes, celle de l'école d’Achard. Elle consiste à faire séjourner dans une solution hypotonique, anticoagulante, toujours la même, une quantité de sang durant le même temps, puis à centrifuger, colorer les frotlis et pratiquer les numérations.

Alin de ne rien laisser au hasard nous allons exposer la tech-

ME nique dans ses moindres détails. Elle comprend trois temps principaux :

1° Epreuve de la résistance.

2° Etalement sur lames.

3e Numération,

L. Epreuve de la résistance, — La solution employée pour cette épreuve se formule ainsi :

Chlorure de sodium .........:.... 0,75 centigrammes Giiralé de soudé = rit 2. ue 0,60 — ERISULIBR RER EE Pr. 100 grammes.

Cette solution doit toujours être fraiche, car elle s’altère assez rapidement. On voit apparaître de légers flocons au bout de quelques jours, une simple filtration permet de s’en débarrasser, nous avons toujours préféré renouveler la solution.

Dans un tube à centrifuger cylindro-conique on met vingt gouttes de la solution, plus dix gouttes d’eau distillée. On agite.

Les tubes doivent être d’une propreté absolue et ne servir qu'à cet usage. Ils doivent être lavés à l’eau pure et passés à l'alcool. Eviter d'employer un acide, car un rinçage insuffisant pourrait en laisser des traces.

Il est bon d’avoir deux compte-gouttes toujours les mêmes, l'un pour la solution, l’autre pour l'eau distillée. L'emploi de pipeltes Pasteur ou de flacons compte-gouttes est à rejeter, les premières donnant des gouttes variables suivant la diminution de la pipette et surtout trop petites, les seconds élant d'une précision fort douteuse.

La prise de sang se fait à l'oreille du malade ou au doigt à l'aide d'une pipette Pasteur. IL faut veiller à ce que le bout effilé ait à peu près toujours la même section, afin que les gouttes de sang soient comparables entre elles.

La partie du malade où l'on fait la prise doit être netloyée à l'alcool ou savonnée et passée à l’eau; dans les deux cas il faut attendre qu’elle soit parfaitement sèche.

La prise doit être faite rapidement, afin d'éviter tout début

de coagulation.

Secousse 3

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On met deux gouttes de sang dans le tube contenant la solution et l’on note soigneusement l'heure; le contact doit durer vingt minutes.

Nous avons préféré mettre deux gouttes de sang, afin que le culot soit un peu plus abondant et permette l'étalement sur deux lames.

IT. Etalement sur lames. — Au bout de vingt minutes, on centrifuge pendant un temps toujours le même que nous ne pouvons préciser, il dépend de la vitesse du centrilugeur.

L'usage du centrifugeur électrique qui permet une gradualion de vitesse constante est de beaucoup préférable. Il suffira de mettre en même position la manette du rhéoslat.

Après centrifugation, la solution doit être absolument limpide, sans hémolyse. On l’aspire à l’aide d’une pipetle tout en en laissant une épaisseur de 2 millimètres environ au-dessus du culot. On pourra ainsi agiter légèrement et éviter que les leucocytes qui se liennent à la partie supérieure ne soient aspirés presque en bloc.

On passe ensuite à l’étalement sur lames. Nous avons éprouvé d'assez grandes difficultés pour faire adhérer les frottis. L'emploi de la solution antlicoagulante en est cause. On est loin de l’adhérence facile que l’on obtient avec le sang pur.

La présence de formol qu'Achard et Feuillié conseillent d'ajouter afin de faire rétracter le proltoplasma des leucocytes, favorise en même temps celte opération, mais nous avons cru néanmoins devoir l’'abandonner. Lors de la lecture des frottis, il gène, à notre avis, pour apprécier la destruction des leucocytes en empêchant le protoplasma et le noyau de s’étaler. Aussi avons-nous été obligé d'employer un petit artilice.

Les lames, neuves de préférence, doivent être soigneusement essuyées, on y dépose ensuite de l'alcool à 90° que l’on laisse évaporer.

On dépose sur deux lames une goulte du culot. Achard et Feuillié l’élalent à l'aide d'une pipette posée à plat ou d’une carte de visite. Nous avons préféré à ce procédé en substituer un autre qui permelle d'éliminer à peu près complètement le

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coellicient personnel de traumatisme sur les leucocytes. Nous employons une feuille de papier à cigarettes, coupée en deux suivant sa longueur. La tenant par une de ses extrémités, nous laissons reposer l’autre sur la goutte et nous nous bornons à tirer doucement jusqu'au bout de la lame, c’est-à-dire sur les trois-quarts de sa longueur. L’étalement est parlait lorsqu'on a un peu l'habitude. Néanmoins, pour le répartir d'une façon uniforme, nous recommandons de saisir la lame entre deux doigts non suivant sa longueur, mais en travers, et de l’agiter vigoureusement par des mouvements d'oscillations. La force centrifuge se charge d’unilormiser le froltis.

On continue à le faire sécher rapidement sans le chauffer, puis on fixe à l'alcool absolu durant cinq minutes.

On colore ensuite à l'hématéine dix minutes et à l'éosine une minute et demie à deux minutes.

Nous avions voulu employer la coloration vitale de Sabrazès: bleu de méthylène au 1/500. Elle nous aurait évité un traumatisme des leucocytes: la fixation. Mais celte coloration, se faisant entre lame et lamelie, ne peut couvrir toute la longueur de la lame: or il y a intérêt, comme nous le verrons, à ce qu'il en soit ainsi pour la numération; de plus, nous avions besoin de fixer les frottis afin de pouvoir les conserver au cas où une vérilicalion se serait imposée. Pour ces deux raisons nous avons élé amené à conserver le procédé de coloration à l'hématéine-éosine. .

IL. Numération. — C’est sur ce dernier point que notre méthode diffère surtout de celle d’Achard et Feuillié. Nous avons tenu à employer un criterium précis, mais simple, qu'exige loule recherche clinique. Comme nous avons pu le voir dans le chapitre consacré à l'historique, les premiers auteurs divisäient les leucocytes en cinq catégories dont ils décrivaient minutieusement les caractéristiques, leur attribuaient à chacune un indice, faisaientle pourcentage de chaque catégorie, puis mullipliaient par son indice. L'addilion de ces derniers résullats donnait le nombre qui caractérisait le degré de résistance des leucocytes. La normale oscillait entre 425 el 450, ce qui, on l’avouera, ne

RME dit rien à notre esprit qui se représente beaucoup mieux des proportions à l’aide d'un simple pourcentage.

Les objections qui nous ont fait écarter cette méthode sont les suivantes :

La distinction entre les diverses calégories est extrèmement délicate, nécessite une très grande habitude, longue à acquérir et même avec une longue expérience on est souvent, en présence d'un leucocyte, sujet à de multiples hésitations. Gette méthode laisse une trop grande part à l'appréciation personnelle el nous croyons qu'il devient très difficile pour deux observateurs de trouver les mêmes pourcentages.

De plus, les leucocyles étant classés dans telle ou telle catégorie, on multiplie le nombre trouvé par un coefficient. Les erreurs d'appréciation que l’on a pu commettre se trouvent alors prendre une importance fort préjudiciable à la justesse du résultat final,

Le fait même de mulliplier par un coeîlicient met le graphique dans l'impossibilité de traduire la varialion exacte du degré de résistance. En prenant pour exemple les deux catégories extrèmes traduisant des résistances diamétralement opposées, la courbe se trouvera beaucoup plus modifiée si nous trouvons 10 °/, de moins de leucocytes de la catégorie 5 que si nous trouvons 10 c/, de plus de la catégorie 1. Nous n'avons certainement pas besoin d'insister, cette méthode, tout au moins au point de vue pratique, nous parait réellement trop prêter le flanc à la critique.

Nous avons pris un criterium, d'une simplicité absolue, qui saute aux yeux: nous numérons, d'une part, les leucocytes détruits et, d'autre part, ceux qui sont reconnaissables, c’est-àdire ceux chez lesquels on voit se dessiner les contours du noyau el du protoplasma, que le noyau soit déformé ou non. Du moment que les contours sont nets, c’est que le leucocyte n’a point éclaté au contact de la solution hypotonique, il a résisté.

Les leucocytes détruits sont reconnaissables à ce que leurs bords sont déchiquetés, le protoplasma que l’on voit s’épancher hors du leucocyle forme des bavures. Dans la destruction com-

plète on aperçoit une tache bleue formant nuage, très facile à reconnaitre avec la moindre habitude. Leur principale caractéristique est de présenter encore un aspect vacuolaire. Il est impossible de les confondre avec les impuretés qui parfois souillent les frottis.

Ces caractères très nets des deux variétés de leucocytes détruits et non détruits sont parfaitement suffisants pour suivre l’évolution de la résistance leucocytaire. Une pareille méthode doit à notre avis se dégager de toutes les minuties, afin de diminuer les erreurs d'appréciation. :

Il nous reste à indiquer comment il convient, à notre avis, de faire les numérations.

Le frottis, comme nous l'avons vu, couvreles trois-quarts de la lame, il faudra numérer d’un bout de frottis à l’autre suivant deux ou trois lignes parallèles. Les deux lames seront ainsi examinées, on comptera 300 leucocytes environ sur chaque lame. Il ne restera plus qu'à additionner le chiffre des éléments détruits et celui des résistants et à faire le pourcentage des détruits par rapport au total.

En agissant ainsi on supprime la cause d'erreur qui pourrait relever de l’inégale répartition des leucocytes détruits, ceux-ci se trouvant quelquefois plus nombreux à la fin du frotlis qu'au commencement. Le traumatisme de l’étalement en est la cause. Il ne faudrait point en exagérer l'importance; d’ailleurs, puisque par le procédé employé il est toujours rigoureusement le même, il fait partie de l'épreuve que l'on fait subir aux leucocytes.

Nous disons que le traumatisme de l’étalement n'a point une importance aussi grande qu'on le pense au premier abord; nous citerons à ce sujet les travaux de Gumprecht, qui n'a point constaté de destruction de cellules comprimées entre deux lamelles chargées du poids de 5, 10, 20 et même 50 grammes.

Comme nous l’avons dit, nous avons fait le pourcentage des éléments détruits: aussi nos courbes subiront une ascension d'autant plus considérable que la destruction sera elle-même plus importante. Nous tenons à signaler ce fait, car les courbes

de l'Ecole d’Achard ont été établies en sens inverse. À vrai dire, nous apprécions plutôt avec notre méthode la fragilité leucocytaire. L'étude est toujours la même.

Nous terminerons cet exposé de technique par une recommandation qui a son importance. Nous connaissons l'influence de la digestion et de l’alimentation sur les leucocytes.

Krolunitzky a fait sur la leucocytolyse digestive deux communications à la Société de biologie (11 juillet et 31 octobre 1913). IL établit que pendant les premières heures de la digestion il existe une diminution du nombre des leucocytes et une apparition des propriétés leucocytolytiques du sérum avec un maximum à la fin de la première heure et disparition au bout de quatre heures. La sécrétion psychique provoque une leucocytolyse fugace. Dans les expériences d'injection de liquides nutritifs dans le rectum, le mème auteur trouve une augmentation du nombre des leucocytes, contrairement à ce qui se produit par le passage dans l'estomac.

Afin d'éviter toute erreur pouvant tenir à l’action de la digeslion sur les leucocytes, nous avons toujours eu l'habitude de faire les prises de sang à la même heure, le malade étant à jeun. Cette pratique, surtout à l'hôpital, est d’une exécution assez facile, aussi croyons-nous qu'il est bon de s’y astreindre.