CUIVRE
GLUCOSE ANHYDRE
3° Méthode de Follin et Wu (1). — Principe. — L'oxyde cuivreux obtenu par réduction du sulfate de cuivre par le glucose en liqueur alcaline donne avec le réactif phospho-molybdotungstique une coloration bleue que l'on compare à une teinte étalon donnée par une solution de glucose de titre connu.
Technique — On prend 3 tubes de forme spéciale (2) (fig. 12) et l'on verse dans le premier 2 ce. de sang privé de ses matières albuminoïdes (3), dans le second 2 ce. de solution de glucose à 1 pour
(1) Otto Follin et Hsien Wu, Journal of biol. Chem., 1919, XXXVIII, p. 106 ; 1920, XLI, p. 367.
(2) Ces tubes ont deux traits de jauge :à 25 ce. et à 4 ce. (ce dernier trait dans la partie étranglée).
(3) Cette précipitation des matières albuminoïdes se fait bien, ainsi que le conseillent les auteurs, par l'acide tungstique : voir plus loin à la méthode de Fontes et Thivolle.
10.000, dans le troisième 2 ce. de solution de glucose à 1 pour 5.000. Dans chaque tube la liqueur sucrée est additionnée de 2 ce. de solution alcaline d'oxyde de cuivre (1).
On opère la réduction en plongeant les trois tubes pendant 10 minutes dans un bain-marie bouillant.
On les refroidit aussitôt après en les plongeant dans l'eau froide durant 2 ou 3 minutes en évitant toute agitation qui entraînerait une réoxydation de l'oxyde cuivreux par l'oxygène de l'air.
Il ne reste plus qu'à évaluer la quantité de sel cuivreux qui s'est formée par l'action du glucose. On verse JK dans chacun des trois tubes 2 ce. de réactif phospho-
^ molybdotungstique (2).
Fig. 12. — Tu- L'oxyde cuivreux qui était en suspension dans la
besde Folin ,. J r* j -i * ' i *•
et Wu. liqueur se dissout. Quand il est passe en solution, on
complète au volume de 25 ce. dans chaque tube avec de l'eau distillée. On mélange.
On compare au colorimètre l'intensité de la coloration bleue obtenue dans le premier tube avec celle que donnent les deuxième et troisième tubes étalons (3).
4° Méthode de G. Fontes et L. Thivolle (4). — Principe — Cette méthode s'inspire du même principe que celle de Follin et Wu : quand
(1) Solution alcaline d'oxyde de cuivre. Dans un demi-litre environ d'eau distillée placé dans un ballon jaugé de 1 litre, dissoudre successivement 40 gr. de carbonate de soude anhydre, puis 7 gr. 50 d'acide tirtrique et 4 gr. 50 de sulfate de cuivre pur.
Le dosage étant basé sur la coloration que donnent les sels cuivreux avec le réactif phosphomolybdotungstique, il faut s'assurer que la liqueur cuivrique initiale est entièrement exempte de composés cuivreux, c'est-à-dire qu'elle se décolore par addition d'un égal volume de réactif molybdique.
(2) Réactif phosphomolybdotungstique.
Dans un ballon de Ii00 à 1.000 ce. on dissout 85 gr. d'anhydride molybdique et 5 gr. de tungstate de soude dans 200 ce. d'eau et 200 ce. d'une solution de soude caustique à 10 p. 100. L'acide molybdique renfermant de l'ammoniaque qui gène le dosage, on chasse celle ci par une ébullition prolongée pendant une demi-heure environ. On laisse ensuite refroidir, on dilue la liqueur à 350 ce. environ par addition d'eau distillée et l'on ajoute 125 ce. d'acide phosphorique à 85 p. 100 après refroidissement.
(3) Voir les remarques sur la mesure colori métrique faites par Ch. Glillalmin, Journal de pharmacie et de chimie, ltr et 16 novembre 1921.
(4) G. Fontes et L. Thivolle, Méthode de microdosage manganimétrique du glucose. Application au sang et au liquide céphalo-rachidien. Bull, de la Soc. de chimie biologique, t. III, n" 5, juin 1921, p. 226.
Le lecteur trouvera dans cet article des détails secondaires de technique que nous ne pouvons pas exposer ici.
on traite l'oxyde cuivreux par une solution acide d'anhydride molybdique incolore, il se fait un sous-oxyde de molybdène qui colore la liqueur en bleu.
Mais, au lieu d'évaluer cette coloration au colorimètre comme le font Follin et Wu, les auteurs traitent la liqueur bleue parle permanganate de potassium : le sous-oxyde de molybdène repasse par oxydation à l'état d'anhydride molybdique incolore. Le terme de la réaction est indiqué par la décoloration de la liqueur.
On opère par comparaison avec une solution titrée de glucose. La quantité de permanganate employée dans les deux cas est proportionnelle à la quantité de sucre à doser et à celle que renferme l'étalon.
Technique — On recueille 2 ce. de sang prélevé par ponction veineuse dans un flacon renfermant quelques cristaux d'oxalate d'ammoniaque.
Aussitôt après le prélèvement on opère la défécation par l'acide tungstique comme le conseillent Follin et Wu.
1 ce. de sang mesuré dans une pipette à un trait est versé dans un matras jaugé de 10 ce. On rince la pipette à plusieurs reprises, avec de l'eau prélevée dans un verre qui en renferme 6 ce. environ. On lave les parois du matras avec les 2 ou 3 ce. d'eau qui restent dans le verre. On verse dans le matras 1 ce. de solution de tungstate de soude à 10 p. 100 et 1 ce. d'acide sulfurique aux deux tiers normal. On complète à 10 ce. avec de l'eau distillée. On agite et on filtre.
2 ce. du filtrat (correspondant à 0 ce. 20 de sang), versés dans un tube de centrifugeuse, sont additionnés de 1 ce. de liqueur cupro-tartrique alcaline (1).
On verse dans un tube semblable 1 ce. de solution de glucose à 1 p. 1.000 (2), 1 ce. d'eau et 1 ce. de liqueur cupro-tartrique. Les deux tubes sont chauffés pendant 6 minutes au bain-marie bouillant.
On retire les tubes et on procède aussitôt à l'englobement de l'oxyde
(1) Liqueur cupro-tartrique alcaline:
! Sulfate de cuivre erist 17 gr. 5
Acide sulfurique 2 ce. 5
Eau q. s. pour 1.000 ce.
B Dissoudre 80 gr. de carbonate de soude anhydre dans 200 ce. d'eau environ, ajouter 15 gr. d'acide tartrique et après dissolution compléter à 1.000 ce. avec de l'eau.
Au moment de l'emploi on mélange volume égal de A et de B. On porte le mélange à l'ébullition pendant une minute ; on néglige la petite réduction qui se produit à chaud.
(2) Cette solution est faite en dissolvant 1 gr. de glucose pur et anhydre dans q. s. d'eau pour faire un litre. On la conserve en l'additionnant de toluène.
cuivreux par un précipité gélatineux de carbonate de magnésie. Dans chaque tube et dès la sortie du bain-marie, on ajoute V gouttes de solution saturée de sulfate de magnésie et IV gouttes de solution saturée de bicarbonate de soude.
On replonge les tubes dans l'eau bouillante pendant 1 minute. On remplit les tubes presque jusqu'au bord avec de l'eau distillée bouillante. On centrifuge. On enlève l'eau surnageante et l'on verse aussitôt dans chaque tube 5 ce. de réactif molybdique-phosphorique (1). On agite .
Le précipité se dissout : on attend 5 minutes pour que la coloration bleue soit entièrement développée.
Dans chaque tube on fait tomber goutte à goutte une solution de permanganate de potassium à 0 gr. 08 pour 1.000 jusqu'à ce que l'on obtienne la décoloration de la liqueur et non pas la coloration rose que donnerait un excès de permanganate.
On fait le rapport entre le nombre de centimètres cubes de permanganate employé dans la liqueur à doser et dans le tube témoin : ce rapport donne la quantité de glucose en milligrammes contenue dans
0 ce. 2 de sang.
Trois cas peuvent se présenter :
1) Le rapport des volumes de permanganate employé donne un chiffre compris entre 0 mmgr. 1 et 1 milligramme de glucose.
On multiplie le chiffre obtenu par 5 pour avoir, en milligrammes par centimètre cube ou en grammes par litre, le taux de la glycémie.
2° Le rapport donne un chiffre égal ou supérieur à 1 milligramme (hyperglycémie supérieure à 5 p. 1.000).
On refait un dosage en prenant cette fois non plus 2, mais 1 ce. du filtrat que l'on additionne de 1 ce. d'eau et l'on compare toujours à
1 ce. de solution de glucose diluée par 1 ce. d'eau.
On multiplie par 10 pour avoir comme plus haut le taux de glucose en milligrammes par centimètre cube ou en grammes par litre.
3° Le rapport donne un chiffre compris entre 0 mmgr. 01 et 0 mmgr. 1 (hypoglycémie inférieure à 0,5 p. 1.000).
(1) Réactif moiybdique phosphorique :
( Molybdate d'ammoniaque 40 gr.
) Lessive de soude (D = 1.36) 60 ce.
On ajoute environ 100 ce. d'eau et on fait bouillir jusqu'à disparition de l'ammoniaque. On laisse refroidir, on dilue par addition de 200 ce. d'eau environ. On ajoute 200 ce. dacide phosphorique de D = l,38, on fait bouillir 1/4 d'heure. On laisse refroidir. On complète à 1.000 ce. avec de l'eau distillée.
On recommence le dosage en opérant par comparaison entre 1 ce. du filtrat et 1 ce. de solution de glucose à 1 p. 10.000, additionnés tous deux de 0 ce. 5 de liqueur cuprotartrique et traités ensuite par 2 ce. de réactif molybdique.
Le résultat sera à multiplier ici encore par 10.
5° Méthode d'Ivar Bang — Principe — L'oxyde cuivreux obtenu par réduction d'une liqueur cuivrique est traité directement dans la liqueur où il a pris naissance par l'acide iodique. Une quantité de cet acide, correspondant à l'oxyde cuivreux, est décomposée.
On titre l'excès d'acide iodique en le traitant par l'iodure de potassium : l'iode libéré est dosé avec une solution d'hyposulfite de soude.
L'élément le plus caractéristique de cette méthode est que nulle ne mérite plus qu'elle le nom de méthode de microdosage. On opère en effet sur une quantité de sang qui doit être comprise entre 100 et 130 milligrammes.
Technique — Du sang obtenu par piqûre du doigt est absorbé par une bande de papier filtre de 26 millimètres de largeur, pesée exactement avant, puis après le prélèvement (1). Il faut que le papier filtre ait absorbé une quantité de sang d'environ 100 milligrammes (soit, très approximativement, deux gouttes).
On fait macérer une première fois la bande de papier pendant une demi-heure au moins dans 6 ce. 5 d'une liqueur (2) qui se charge du sucre du sang. On décante cette première liqueur dans une fiole de 100 ce. On fait subir au papier une deuxième macération, identique à la première, dont le produit est réuni à celle-ci dans la même fiole.
Aux liqueurs sucrées on ajoute alors 2 ce. d'une solution cupro-iodique (3) et 2 ce. d'une solution alcaline (I).
(1) Ces pesées doivent se faire avec une grande précision et une grande rapidité. l\;ir l>ang préconisait l'emploi d'une balance de torsion.
(2) Cette liqueur se prépare en versant dans un flacon de 2 litres 200 ce. d'eau environ. On dissout dans cette eau 3 ce. d'acétate d'urane pur. On ajoute 1.300 ce. d'une solution saturée de chlorure de potassium pur, 1 ce. 5 d'acide chlorhydrique à 25 p. 100 et on complète à deux litres avec de l'eau distillée.
(3) Solution cupro- iodique :
.. ,. ) Solution d'iodate de potassium — 10 ce.
Mêler < L 10
( Solution de sulfate de cuivre a 10 p. 100 ... 2 ce. 5 Compléter à 100 ce. avec de l'eau distillée.
(4) Solution alculine :
i Carbonate de potassium 75 gr.
] Sel de Seignctte 20 —
( Eau distillée q. s. pour 1 litre
On chauffe le mélange pendant 4 minutes exactement au moyen d'un courant de vapeur d'eau qui arrive dans la masse liquide par un tube renilé à son extrémité : celle-ci est percée de 5 à 6 petits trous.
Après chauffage on ajoute à la liqueur 2 ce. d'acide sulfurique à 20 p. 100 en volume. On retire de la fiole le tube qui a amené la vapeur ; on lave celui-ci à l'eau. Après cinq minutes de repos on verse dans la fiole 25 ce. d'eau, puis, après refroidissement, 0 ce. 5 d'une solution renfermant 5 p. 100 d'iodure de potassium. L'iode libéré est titré en présence d'empois d'amidon par addition de solution d'hyposulfite de sodium N /100 jusqu'à décoloration. Soit n le nombre de centimètres cubes de solution d'hyposulfite nécessaire. La formule (1)
donne en dixièmes de milligramme la quantité de glucose que renfermait l'échantillon de sang.
On trouve normalement dans le sang une quantité de glucose libre qui varie suivant les auteurs de 0 gr. 70 à 1 gr. 50 par litre. Au delà de 1,50 il y a hyperglycémie; quand celle-ci a teint 3 gr. la glycosurie apparaît.
Graisses ; Lipoïdes ; Gholestérine.
Il existe dans le sang à côté des savons et des acides gras libres (dont quelques-uns volatils), et de traces de glycérine, des combinaisons beaucoup plus complexes des acides gras : des éthers gras (oléique et palmitique) de la cholestérine — en plus de la cholestérine libre ; et des lipoïdes phosphores (lécithine).
De cet ensemble complexe la cholestérine se détache depuis qu'en ces dernières années les travaux de Chauffard et de ses élèves ont mis en relief l'intérêt considérable que présente son dosage en clinique.
Parmi tous les travaux qui ont été publiés sur ce sujet, nous retiendrons :
(1) En effet les 2 ce. de solution cupro-iodique renfermant 0,2 de solution d'io-
date — correspondent à 0 ce. 2 d'hyposulfite r-, soit 2 ce. d'hyposulfite rr-(.. De ces
2 ce, 0 ce. 03 sont consommés à blanc. Il reste donc au départ 1 ce. 1)7. La réaction
de dosage en a consommé 1,97 — n. Enfin — de milligramme de glucose corres-
N pond à 0 ce. 28 d'hyposulfite :„;..
1° La technique de Grimbert et Laudat qui permet de doser exactement tous ces éléments et en particulier la cholestérine totale, libre, et éthérifiée.
2° La méthode de Grigaut grâce à laquelle on peut faire soit un dosage pondéral, soit un dosage colorimétrique rapide de la cholestérine totale que l'on exprime en cholestérine libre « sans rien présumer de l'état libre ou de combinaison initial ».
