Sur la concentration et la purification de la toxine et du toxoïde formé tétaniques par le sulfate de soude et la chromatographie
Iustitut d'Hygiène et de Bactériologie de l’Université de Berne (Directeur: Prof. Dr. C. Hallauer)
(Travail effectué sous la direction de P. D. Dr. med. R. Regamey)
Sur la concentration et la purification de la toxine et du toxoïde formolé tétaniques par le
sulfate de soude et la chromatographie
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l’Université de Berne
pour l’obtention du grade de Docteur en Médecine
par
MARC NEYROUD
de Montreux (Vaud)
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Institut d'Hygiène et de Bactériologie de l’Université de Berne (Directeur: Prof. Dr. C. Hallauer)
(Travail effectué sous la direction de P. D. Dr. med. R. Regamey)
Sur la concentration et la purification de la toxine et du toxoïde formolé tétaniques par le
sulfate de soude et la chromatographie
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l’Université de Berne
pour l’obtention du grade de Docteur en Médecine par
MARC NEYROUD
de Montreux (Vaud)
Acceptée par la Faculté de Médecine sur la proposition
du Prof. Dr. C. Hallauer.
Berne, le 26 janvier 1944.
Le Doyen:
Prof. Dr. E. Glanzmann.
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On sait que, sous l’influence prolongée du formol et de la chaleur (Ramon), l’ectotoxine que produisent dans leur bouillon de culture les bacilles tétaniques, diphtériques, les staphylocoques, ainsi que d’autres microbes encore, perd peu à peu ses propriétés toxiques pour ne conserver que sa fonction antigénique. C’est l’anatoxine, toxoïde formolé ou « Formoltoxoid » des auteurs allemands. Cette propriété antigénique permet d’obtenir, Chez l’animal ou chez l’homme, une immunité active contre le tétanos ou la diphtérie par exemple.
| L’anatoxine contient deux éléments essentiels, qui vont contribuer tous deux à l’immunisation :
l’antigène, spécifique, et le ballast, représenté par toutes les substances protéiniques non spécifiques du bouillon.
Si ce ballast peut être considéré comme un adjuvant non spécifique de l’antigène, il est aussi responsable des réactions d’ordre anaphylactique, parfois très graves, que l’on observe au cours de limmunisation active (Whittingham 44, Parish et Oakley 45, Cooke, Hampton, Shermann et Stull46). C’est pourquoi l’on s’est efforcé de purifier l’anatoxine, de la débarrasser tout ou partie de ce ballast indésirable. On cherche encore à ralentir l'élimination du toxoïde hors de l’organisme pour prolonger son activité dans le temps; c’est le principe des antigènesdépôts : toxoïde précipité par l’alun, ou adsorbé sur des sels d’alumine.
Le problème de la purification des anatoxines fut étudié parallèlement à celui de la purification des sérums antitoxiques mais, semble-t-il, avec moins de rigueur.
Toutes choses étant égales d’ailleurs, l’immunité active est fonction de la quantité d’antigène inoculée. Aussi s’est-on efforcé de concentrer les anatoxines, afin d’inoculer une dose maxima d’antigène sous un volume restreint. Cette concentration du toxoïde va souvent de pair avec sa purification. Depuis une quinzaine d’années, la question de l’immunisation active de l’homme ou de l’animal contre le tétanos ou la diphtérie se résume ainsi :
obtenir une anatoxine qui contienne beaucoup d'unités antigéniques et peu de ballast original, c’est-à-dire un toxoïde dont la fonction
unités floculantes (U. K.) / cc *)
soit élevée, et la fonction mgr. azote (N) / cc
soit très basse, en d’autres termes une anatoxine dont le quotient
soit le plus grand possible. De nombreuses méthodes furent préconisées pour la concentration et la purification des toxines d’abord, puis des anatoxines. La majorité des travaux étudient l’antigène diphtérique; les recherches sur le traitement de la toxine et du toxoïde tétaniques sont beaucoup plus récentes et moins nombreuses. Voici, brièvement résumées avec leurs avantages et leurs inconvénients, les principales méthodes proposées pour la purification et la concentration de ces antigènes.
L’acide acétique (Watson et Wallace?, Watson et Langstaff3, Locke et Main, Lichtenstein 14) et plus souvent l'acide chlorhydrique (Sedallian et Gaumont 5, Koulikoff et Smirnow 6, Siebenmann 7, et d’autres auteurs 8, 9, 10, H 12, 13) furent expérimentés. Par simple abaissement du pH à 4,7 (qui paraît être le point isoélectrique des protéines liées à l’antigène), on obtient une floculation de l’anatoxine, le floculat entraînant la presque-totalité de l’élément antigénique. Mais il semble que, de ce fait, le toxoïde soit assez gravement lésé.
L’acide trichloracétique (Boivin et Izard'5, Ramon, Boivin et Richou 16) permet à froid, à 0° et au pH de 3,5 environ, une purification très poussée avec élimination de 99 % de l’azote et une perte de 25 % du pouvoir antigénique.
L'action combinée de l’acide et de l’alcool donna également à Bunney, Cianciarulo et Kiamil 17 une purification de 99 %, avec récupération de 70 à 80 % de la fonction toxique.
Hansen et Schmidt 8 constatent qu’à -10° l’alcool méthylique purifie très bien, mais attaque aussi la toxine, tan-
* Notre travail n'intéressant que des expériences «in vitro», nous continuerons de postuler, à la suite de Ramon, que la teneur en unités floculantes va de pair avec le pouvoir antigénique ou immunisant, bien que cet aphorisme soit, avec raison, battu en brèche par Prigge!.
dis que l’alcool éthylique purifie moins parfaitement, mais ne modifie pas la toxine.
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L’acétone BARON donna de bien meilleurs résultats à no et Norlin ®” qu'à Wadsworth, Quigley et Sickers *, ?1. Les premiers de ces auteurs utilisèrent une anatoxine diph-
térique titrant 60 U.F. et 8,19 mgr. d’azote par ce., soit 136
, . . . . 7 gamma d'azote par U. F. et obtinrent ainsi un produit purifié
. n'ayant plus que 0,86 gamma d'azote par U.F. c’est-à-dire 158
fois plus pur. L’acétone fut encore utilisé par Moloney et Orr *?, qui purifient leur antigène par trois méthodes successives : précipitation au point isoélectrique en présence de chlorure de fer, précipitation ultérieure par l’acétone et adsorption finale sur phosphate de fer. La technique d’Eaton 23 est encore plus compliquée.
À côté d’autres procédés rarement employés : acide benzoïque en solution saturée dans l’acétone (Spasowicz et Porebaski*), ultrafiltration (Zajdel*, *, Sparrow et Mayzner°!), congélation (Salimbein et Loiseau?*, Elkeles®*), action des diastases (cf. Schmidt”), osmose (Goldie*!), deux techniques de concentration et de purification des antigènes sont aujourd'hui très en vogue : ce sont la précipitation par les sels minéraux et l’adsorption aux sels d'aluminium.
Pour la salure, on préfère en général le sulfate d’ammonium. T'asman et ses collaborateurs *?, *, %#, *, ont précisé les modalités de la purification par cette méthode. Le point de saturation se trouve à 735 gr. de (NH 4), SO, par litre; c’est entre 265 et 450 gr./litre que précipitent les fractions protéiniques portant la quasi-totalité de l’antigène. Et cela quelle que soit la nature de l’anatoxine de départ (pH de 8,0 à 8,8). A demi-saturation, on perd à peu près 50 % de l’antigène, mais le toxoïde est 30 fois plus concentré.
Enfin, ladsorption aux sels d'aluminium (grâce auxquels la résorption de l’antigène dans l’organisme est fortement ralentie — action de dépôt) intéresse la précipitation des anatoxines par l’alun (Glenny et Barr*, Wells, Graham et Havens*’, Park et Schroeder **, Havens et Wells **), et la fixation aux oxydes ou hydrates d’alumine. L’alun à 22,5 % permet d’éliminer le 70 % de l’azote, avec perte de 20—30 % de l’antigène; à des taux d’alun plus faibles, l'efficacité de l’antigène reste entière, mais la purification est moindre. La toxine diphtérique se prête bien à la purification par l’AI, (OH),, modification
C 7 (Willstätter “, Schmidt et Linderstrom-Lang “, Schmidt et Hansen 42). Une application indirecte des méthodes d’adsorption par les sels d’alumine a été réalisée par Ballinari 43 qui tenta de purifier la toxine tétanique par la chromatographie.
Parmi les nombreux procédés que nous venons d’énumérer, il en est deux que nous nous sommes proposé d'étudier simultanément : la salure par le sulfate de soude (moins toxique en injection sous-cutanée que le sulfate d’ammonium) et la chromatographie.
