I. Salure par le sulfate de soude

La technique que nous avons adoptée comporte cinq temps essentiels :

a. Salure : l’anatoxine tétanique originale est chauffée au bain-marie à 370, afin de favoriser la dissolution du sel. On ajoute 20 % en poids de sulfate de soude (Na, SO, de Siegfried S. A. Zofingue) et remue avec un bâton de verre jusqu’à ce que le sel soit dissout; puis on laisse reposer pendant 15 minutes, et recueille la mousse formée dans une capsule de porcelaine tarée.

La mousse récoltée, on ajoute 5 % de sel, on recueille la nouvelle mousse après 15 minutes, et aïnsi de suite, de 5 en 5 %, jusqu’à saturation certaine (soit au moment où la concentration saline atteint 55 %). Le dernier échantillon de mousse n'est prélevé que le lendemain, alors que l’antigène à passé la nuit à 370. Pendant toute l’opération, le bain-marie est maintenu à 370 (il n’est en général pas nécessaire de chauffer pendant l’adjonction de sel, car le sulfate de soude est légèrement exotherme).

b. Dialyse : après pesage, chaque échantillon de mousse est repris dans de l’eau distillée tiède; la quantité de liquide est empiriquement fixée de telle façon que la masse soit totalement dissoute.

Pour débarrasser les échantillons de leur sulfate de soude, on les met chacun dans un sac à dialyse (simple «ac de cellophane monté sur un col de bouteille), que l’on immerge partiellement dans un cristallisoir, à l’eau courante. On les y laiese jusqu’à ce que la réaction au chlorure de baryum ne révèle plus que des traces de sulfate.

En général la dialyse est complète après 4 fois 24 heures : chaque échantillon est alors recueilli et mesuré, ce qui permet de déterminer le volume d’eau attiré ou perdu au cours de la dialyse.

c. Filtration : pour conserver stérilement les échantillons, on les soumet à une double filtration sur appareil de Seitz, avec membrane K d’abord, puis avec membrane EK; les filtrats sont recueillis sous une couche de toluol.

d. Titrage de l'azote : il se fait à l'appareil de Kjeldahl, selon la technique usuelle.

c. Titrage de l’antigène : les épreuves de floculation furent pratiquées avec un sérum étalon de l’Institut sérothérapique et vaccinal suisse à Berne, sérum titrant 600 U.F. par cc. Toutefois, comme certains échantillons avaient une teneur très faible en U. F., nous les avons mélangés à parties égales avec une anatoxine < entraîneuse », qui jaugeait 30 U.F./cc. Un simple calcul permettait alors de fixer la valeur de l'échantillon qui, isolé, ne floculait pas. Cette technique de l’«entraîneuse»> ne fut appliquée que pour les concentrés, les filtrats ou éluats de chromatographie titrant moins de 15 U.F./cc.

Voici, à titre d'exemple, les protocoles établis au cours de l’une de nos expériences :

Expérience No 2:

(12—15 novembre 1942) : on part de 10 litres d’anatoxine tétanique No 1053, qui titre 17 U.F. et 4,9 mgr. d’azote par cc. a. Salure : on ajoute successivement, tous les l4 d’heure,

5 % de sulfate de soude.

Tableau 1. Salure de 10 litres d’anatoxine tétanique avec du sulfate de soude.

Echantillon à| Quantité de Na2 SO1 ajoutée 20 %/o 2000 gr.

21—25 /o 500 gr.

26—30 °/o | 500 gr.

31—35 0 500 gr.

é 36—40 ‘Jo 500 gr.

41—45 °/0 500 gr.

46—50 %/0 500 gr.

51—55 °/0 500 gr.

56—60 ‘Jo 500 gr.

té dés ‘Cu din mn à-2

de had: doi

À 20% de salure, la mousse qui se forme à la surface du liquide est blanche, spumeuse, mal liée et assez difficile à recueillir. Mais, plus la concentration saline s'élève, plus cette mousse tend à devenir épaisse, de consistance crémeuse, puis « poisseuse », d’un brun de plus en plus foncé. À 55 % de salure, elle prend à peu près l'aspect de l'extrait de viande « Liebig ».

b. Dialyse : on dissout les échantillons de mousse dans de l’eau distillée, et on les soumet à la dialyse pendant 4 jours. Voici les observations enregistrées :

Tableau 2. Changements de volumes de liquide pendant la dialyse.

Quantité de liquide (cc) Quantité d’eau attirée LU pendant la dialyse Echantillon à avant après en valeur |en % du volula dialyse absolue me original 20 °/o 54 56 ED a il 21—25 °/o 76 101 AA) | 33 26—30 °/0 62 97 ARS +56 31—35 °/0 63 89 520 + 43 36—40 ‘0 63 78 2 + 24 41—45 1/0 62 76 + 14 22 46—50 °/0 58 62 “nl HAT 51—55 1/0 57 79 4522 + 38 56—60 °/0 54 98 + 44 + 82

L’échantillon à 20 % de salure se comporte à peu près comme un corps inerte : il n’y a pratiquement pas d'absorption du liquide ambiant dans le sac de cellophane. Les échantillons

suivants ont tous attiré de l’eau, en proportion variable d’ailleurs.

Dans cette expérience, tous les échantillons furent, après la dialyse, amenés à 100 cc. par adjonction d’eau. L’échantillon 21-25 % est amené à 150 cc. C’est à partir de ces dilutions que seront titrés l’azote et l’antigène.

c. Filtration : sur membranes Seitz K et EK.

d. Titrage de l'azote : chaque échantillon est titré 3 fois à l’apparei! de Kjeldahl : les valeurs indiquées intéressent donc une moyenne (tableau 3).

e. Titrage de l’antigène : par la méthode de floculation. Lors des titrages avec l'anatoxine 1053 et ses dérivés, nous n’avions pas encore fait appel à la technique de l’« entraîneuse », et les taux inférieurs à 20 U. F./cc. ne purent être recherchés.

Tableau 3. Résultats du titrage de l’azote et des U. F. pour chaque concentré :

Concentré à mgr. N./ce U. F./cc Quoi U. F./mgr. N.| mer. N./U.F. 20 °/o | 077 <2204 80 ? ?

21—25 % : a | 500 | 117,09 0,0084 26—30 °/0 5,74 Es E 76,65 0,01305 35% Joe 560 | , 90 | 16,07 0,06222 36—40%0 | 5,60 : 4,46 0.22400 41—45 (/0 . | < 20 | ? | ?

SA À Lo | 17 3,46 0,28824 que No.

Il ressort de ce tableau 3 que les quantités d’antigène facilement contrôlables sont précipitées entre 21 et 40 % de sulfate de soude. C’est la fraction recueillie entre 21 et 25 % de salure qui représente l’antigène le plus pur. La fraction suivante est également riche en antigène, tandis que les deux concentrés obtenus entre 31—35 % et 36—40 % de salure contiennent relativement peu d’antigène et beaucoup d’azote. Dans toutes les fractions supérieures à 41 % de sel, on ne retrouva pas d’antigène par la simple méthode de la floculation.

Les fractions d’antigène recueillies aux divers taux de salure représentent à la fois une concentration et une purification de l’anatoxine :

Tableau 4. Index de concentration et de purification de l’anatoxine tétanique:

Fraction recueillie Concentration Purification | | entre ... de T U. F./cc Index C gamma N/U.F. Index P 21—25 1/0 500 29,4 8,54 | 33,8 26—30% | 440 259 | 13,05 | 22,1 31—35 0 : 90 a | 62,22 | 4,6 Jane de 25 > 224,00 1,3 Me ne) 17 2 | 288,24 10 |

L’index C est le quotient : U. F./cc. du concentré U. F/cc. de l’anatoxine

l'index P est le quotient : mgr. N./U. F. de l’anatoxine

mer. N. /U. F. du concentré

Les deux index, C et P, permettent de mesurer directement les taux de concentration et de purification des fractions correspondant aux différentes salures. Le tableau 4 démontre clairement que, dans le cas de l’anatoxine tétanique 1053, les meilleures index sont ceux des concentrés obtenus entre 21 et 30 % de sulfate de soude. Ces index ne sont toutefois intéressants que

si la majorité de l’antigène se trouve réunie dans ces fractions. Connaissant le volume de chaque concentré recueilli après la dialyse, il est facile de calculer le taux de récupération des U. F.

Tableau 5. Récupération des U.F.

Pourcentage des U.F.

Concentré à: Volume U.F./cc ARE contenues dans les (en ce) AE 10 litres d’anatoxine | 21—25 Jo 150 500 75 000 44,1 26—30 °/o 100 440 44 000 25,9 31—35 °/o 100 90 9 000 5,3 36—40 V/0 100 25 2 500 1,5 Anatoxine tétani- 12 { due No 1002 10000 IUx 17 000 = Total 76,8

Les échantillons de concentré récoltés entre 21 et 40 % de salure comprennent le 76,8 % des U.F. présentes dans l’anatoxine originale. Les pertes sont donc de 23,2 %; elles se répartissent sur les diverses fractions qui contenaient moins de 20 U. F. au cc., et que nous n’avons pas étudiées avec des méthodes plus raffinées; elles relèvent encore des pertes de matériel au cours des multiples manipulations : filtrations, etc. Il est possible encore qu’une certaine partie de l’antigène ne « précipite » absolument pas sous l’influence de la salure.

Voici maintenant, comparés à ceux de l’expérience No. 2, les résultats fournis par les essais No. 4 et 5.

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