TL NN PT ES

Les pertes d’antigène sont donc très différentes pour les 3 expériences relatées, passant de 23,2% pour l'essai No. 2 à 87,4 % pour l’essai No 5. Ainsi toutes les anatoxines tétaniques ne se prêtent pas à la purification avec les mêmes avantages d'économie. En se basant sur les expériences 2 et 4, on peut admettre que, pratiquement, une salure unique à 30—35 % permet de retrouver dans la mousse un taux utile d’antigène. Pour corroborer cette affirmation, nous avons été conduits à changer notre technique de salure, et nous avons adopté la méthode relatée ci-après.

Expérience No 6 :

La même anatoxine tétanique que celle de l’essai No. 5, soit le toxoïde No. 1121, titrant 25 U. F. et 4,83 mgr. N par ce., est répartie en 7 lots de 2 litres chacun. Chaque volume d’antigène est additionné d’une quantité croissante de sulfate de soude : le premier échantillon est salé à 20 %, le second en une fois à 25 %, le troisième à 30 %, et ainsi de suite, toutes les autres conditions d’expérience restant par ailleurs les mêmes.

Tableau 10. Observations sur les mousses et la dialyse.

Poids Vas RFA d’eau attirée Salure à: | de la mousse] avant après pes TAPROrL

recueillie dialyse | à la mousse | au volume

È initial

20 Jo 2 gr. | 22 ce. 27 ec. + 250°/0 + 23/0

25 %o 8 gr. 38 ce. | 48cce. | +125% + 26 0/0

30/0 14 gr. 64 cc. 82 cc. + 129 0/0 + 280/0 2 - es — = — - Sn +4 ï -

35/0 26 gr. 06 cc. | 102 ce. 0230/0 00/0

40 °/0 11 gr. 81 cc. 110 cc. + 264 1/0 + 36/0

45 1/0 11 gr. 81 cc. | 104 cc. + 209/o +280)

50/0 16 gr. 86 ec. | 127 cc. + 256% | +430,

Plus la concentration saline est grande, plus l’on est en droit d'attendre une mousse abondante : cette spéculation ne se vérifie cependant pas. Il existe un seuil entre 30 et 35% de concentration saline, où la mousse est plus abondante que lors

de l’emploi de quantités voisines de sulfate de soude. Tout se passe comme si, à 30—35 % de salure, la mousse retenait dans ses mailles un plus grand volume d’anatoxine salée.

Par ailleurs, l'attraction d’eau pendant la dialyse n’obéit pas à une loi rigide. Dans son ensemble, elle donne une courbe ascensionnelle, mais avec une forte dépression, qui correspond, là encore, à la concentration saline de 35 %.

Tableau 11. Titrages de l’azote et des U. F.

Salure à mgr. N/cc. U.F./cc. gamma N/U.F.

| 25 Jo 0,42 65 6,5 30 %/0 0,77 70 11,0

| Auatoxine | 1,83 25 | 193,2

Ce tableau 11 étaie nos connaissances : l’augmentation de la concentration saline va de pair avec une augmentation de l'azote : pour un échantillon donné, la quantité d’azote est fonction du degré de salure. Il n’en va pas de même de la teneur en U. F.: on obtient très rapidement un titre élevé d’antigène, à 25 % de salure déjà, mais les échantillons ultérieurs n’accusent pas une forte élévation de leur titre : à 40 %, il semble déjà que la presque totalité des U. K. ait précipité, puisque le titre de 80 U.F./ec. à 40% ne passe qu’à 85 U.F./ec. à 50% de salure : à cette concentration, la totalité de l’antigène précipitable est acquise : en augmentant le taux de sulfate de soude, on n’enrichit plus que l’azote. Ces considérations ressortent encore mieux du tableau 12.

Tableau 12. Index C et P; récupération des U. F.

Pourcentages des U. F. con-

Concentré à Index C Index P tenues dans les 2 litres d’anatoxine originale

20 °/o 0,52 te 0,7

25 °/o 2,60 29,8 tr 6,2

30 °/o 2,80 17,6 je de \

L’anatoxine tétanique 1121 se prête mal à la salure par le

sulfate de soude (cf. expérience No. 5). Le rendement quantitatif de la méthode est faible; les avantages qualitatifs soit moins

nets que lors des expériences No. 2 et 4 relatées plus haut.

Une salure unique à 25 % de sulfate de soude donne une faible récolte en U. F.: 6,2 % seulement, mais l’index P de purifications est élevé: 29,8, c’est-à-dire que VU. F. a perdu

— 96,6% de son azote initial.

Discussion

Parmi toutes les méthodes préconisées pour la concentration et la purification des toxines et toxoïdes, la salure au sulfate de soude est une méthode éminemment simple et économique.

La technique adoptée : salure fractionnée et étude des mousses correspondant à des tranches successives de concentration saline comporte une certaine marge de causes d’erreurs. On a recueilli les mousses 15 minutes après la dissolution du sulfate de soude; or, après ce laps de temps, si la majorité de l’antigène réagissant à la concentration saline envisagée s’est déjà amoncelée à la surface du liquide, il existe cependant une fracüon de toxoïde qui remonte beaucoup plus lentement, et qui ne sera pas examinée avec l'échantillon en cause. Les concentrés à différents taux de salure correspondent donc à l’antigène qui remonte en surface pendant un temps donné, fixé arbitrairement à 15 minutes. Lors de la récolte des mousses, de leur dissolution, de leur dialyse et de leur filtration, il se produit des pertes de matériel qui ne sont pas négligeables.

Les différents concentrés, pour une même anatoxine, ne peuvent pas être considérés comme des produits « purs », c’està-dire provenant rigoureusement d’une concentration déterminée; en effet, lors du prélèvement de la mousse, il reste toujours du matériel accolé aux parois, et que l’on recueillera peut-être avec le concentré suivant.

Dans le calcul des index de concentration et de purification C et P se glissent des erreurs inhérentes à la nature même des méthodes de titration : si les quantités d’azote déterminées à l'appareil de Kjeldahl peuvent être admises comme exactes, les titres antigéniques que donne la floculation ne sont justes qu'à 5 ou 10 Z près.

Ces considérations fixent suffisamment l’approximation de nos résultats. Néanmoins, nous pouvons déduire de nos protocoles un certain nombre d’observations qui revêtent un caractère général.

Les différents échantillons d’anatoxine tétanique examinés possèdent chacun une individualité physico-chimique; les uns se prêtent très bien à la salure, les autres beaucoup moins bien.

L'adjonction de sulfate de soude fait apparaître une mousse à la surface de l’anatoxine. Dans cette mousse se trouvent des corps très complexes, entre autres l’antigène et des composés azotés. Aux différents taux de salure, les mousses ont un caractère très variable : pâles et peu visqueuses aux basses concentrations, elles n’absorbent que peu ou pas d’eau à la dialyse: brun-foncé en présence de quantités élevées de sulfate de soude, elles sont très visqueuses et attirent beaucoup d’eau pendant la dialyse. Que ce soit entre 21-25 %, ou entre 40-45 %, les mousses contiennent de l’antigène. Nous pouvons en conclure que l’antigène n’est pas influencé par une solution déterminée d’électrolytes. Si l’antigène létanique est une protéine, cette protéine est de caractère défini, mais de sensibilité peu spécifique en fonction du taux des ions salins. Si l’antigène est seulement accouplé à un support protéinique — tel un groupe prosthétique —- ce support n’est pas rigoureusement spécifique par rapport aux électrolytes; il peut être de nature chimique multiple, ce qui expliquerait son comportement envers les diverses concentrations salines.

À 20% de salure, la quantité d’antigène qui s'élève à la surface est très faible. Pour toutes les anatoxines, c’est dans la mousse qui se forme entre 21 et 25 % de salure que se réunit la forte majorité de l’antigène, alors qu’un minimum d’azote est entraîné : l’unité floculante peut ne contenir qu'1 % de l'azote total que contient l’U.F. de l’anatoxine originale. Dans la fraction comprise entre 26 et 30 % de salure, la quantité d’antigène est encore élevée, mais celle de l’azote est aussi beaucoup plus forte, donc la purification est moindre.

Dans la pratique de la préparation des anatoxines du commerce, la méthode de salure par le sulfate de soude peut rendre de grands services. Il arrive fréquemment que des lots de ioxoïdes soient faibles et, comme tels, inutilisables. En salant ces lots, on récupère — selon l’échantillon — jusqu’à 75 % de l’antigène sous forme de concentré. Ce concentré peut être ensuite étendu avec de l’eau physiologique, au titre antigénique désiré: il peut être mélangé, comme correcteur du titre floculant, à des anatoxines trop faibles, ou servir à la préparation de vaccins mixtes : diphtérique-tétanique par exemple, avec cet avantage de conserver de hauts titres antigéniques. Il peut enfin servir de point de départ à d’autres purifications, soit par nouvelle salure, soit par toute autre méthode.

IT. Chromatographie

Dans son travail sur les toxines tétaniques et diphtériques, Ballinari 43 s'adresse à la chromatographie pour concentrer ces antigènes. I] conclut que le meilleur adsorbant est l’oxyde d’aluminium (Al, O.,) en milieu acide, avec optimum entre pH 5,3 et 6,0; mais l’élution s’accompagne de très grosses pertes, de l'ordre de 75 % avec l’anatoxine diphtérique.

Le principe même de la chromatographie est simple : on fait passer un liquide dans une colonne d’adsorbant que contient un tube de verre. Au cours de sa progression à travers la colonne, les constituants du fluide se fixent sur l’adsorbant au gré de leur affinité. Après passage du liquide, la colonne peut être décomposée en plusieurs zones étagées les unes sur les autres: les supérieures contiennent les particules le plus facilement adsorbées. Les substances douées d’une affinité trop faible ou nulle pour la colonne se retrouvent dans le liquide à la sortie du tube. Lorsque l’opération est terminée, deux fractions se présentent : le filtrat, où la substance étudiée peut se retrouver tout ou partie, puis la colonne, où la substance a pu se fixer. Dans le cas particulier de nos recherches, celui de l’anatoxine

tétanique, on peut mesurer le degré d’adsorption par deux méthodes :

a) en calculant le nombre d’U.F. dans le liquide initial, avant son passage dans la colonne, et celui des U.F. du filtrat. La différence des deux valeurs donne la quantité d’U. F. retenues par l’adsorbant.

b) en éluant l’adsorbant, puis en recherchant le titre antigénique dans l’éluat. Au contraire de la première, cette méthode ne donne que des résultats approximatifs, car l’élution n’est jamais parfaite.

Notre appareillage fut identique à celui de Ballinari #3. Nous n’y avons apporté qu’une petite amélioration en recouvrant d’un treillis métallique la face supérieure du bouchon de caoutchouc destiné à supporter la colonne. L'ensemble du filtre

placé entre le bouchon et l’adsorbant comportait les couches suivanies :

adsorbant rondelle de papier-filtre, épaisseur de laine de verre ou d’ouate, rondelle de papier-filtre, treillis métallique, bouchon

Voici, avec quelques détails, l’une de nos expériences, faite dans le but de déterminer le pH d’adsorption optimum :

Expérience No 7:

3 échantillons de 200 cc. de l’anatoxine tétanique 1053 sont amenés aux pH suivants :

pH 6,5 : avec NaOH à 4 %,

pH 5,5 : c’est le pH de l’anatoxine originale,

pH 4,5 : avec CH,COOH à 30 %.

3 colonnes de chromatographie sont montées chacune avec 10 gr. d'oxyde d’aluminium (Siegfried S. A., Zofingue) suspendus préalablement dans une solution-tampon au pH correspondant. Les colonnes sont ensuite «lavées » sous légère pression négative avec des solutions-tampon de Sœrensen :

pour pH 6,5 : 700 cc. de K H, PO, m/15

HO0Uïec de Na H4P0:. 1220, 0'°m/15.

pour pH 5,5 : 950%ec. de K H> PO, :m/15

Hno0 cc der NA EL PO: 12H20: m/715.

pour pH 4,5 : 200 cc. de CH, CHOH COOH m/10

+ 800 cc. de Na CH, COOH. 3 H,0 m/10.

Ce lavage des colonnes est rendu nécessaire par l’alcalinité de VAI, O,. Après passage de 800—900 ce. de la solution-tampon, le liquide à la sortie du tube de chromatographie garde à peu de chose près le pH désiré : 6,5, 5,5 et 4,7.

On fait alors circuler les 200 cc. d’anatoxine tétanique; le filtrat est recueilli par fractions séparées, de 50 cc. chacune. Les colonnes d’adsorbant sont ensuite expulsées avec un bâton de verre, et divisées en deux moitiés. l’une supérieure, l’autre inférieure. Chaque fragment est suspendu dans 20 ec. d’eau à pH 7,5, agité longuement, laissé 1, heure à l’étuve, alcalinisé à pH 7,5 par une lessive de soude normale. Puis nouvelle agitation, séjour à l’étuve et une nuit à la glacière; on centrifuge, décante et recueille enfin chaque éluat dans une bouteille stérile. Nos observations sont résumées dans le tableau No 13.

Tableau 13. Titrages des U. F. dans les filtrats et les éluats.

Colonne à pH 6,5 pH 5,5 pH 4,5

pH |U.F.| pH | U.F.| pH | U.F.

Eluat de la moitié supérieure de la colonne (20 cc.)

Eluat de la moitié infé- 7.5 5 7.5 15 7.5 7

rieure de la colonne (20 ec.)

Filtrat: lère portion 6,1 9 Re 6 4,7 ?

(50 cc.) Frrears M Ter Penh nan EE ds M A sea

4ème portion

(50 &) CA D A RE EAN NT ae

Anatoxine tétanique

No 1053 55 |. 17

C’est dans la colonne moyenne, c’est-à-dire à pH 5,5, que l’anatoxine tétanique est le mieux adsorbée : l’éluat de la moitié supérieure de la colonne contient 17 U.F./ce., celui de la moitié inférieure 15 U.F./cc. alors que les titres antigéniques des filtrats sont beaucoup plus bas que celui de l’anatoxine originale. Le titre très faible dans la première portion du filtrat à pH 6,5 peut s'expliquer par la dilution que subit l’anatoxine avec la solution-tampon qui imbibait la colonne au début de expérience.

Notons encore que les meilleurs éluats ne marquent aucune concentration d’antigène, puisqu'ils atteignent à peine la valeur de l’anatoxine originale.

La question des pertes en U. F. et de l’élimination de l’azole sera examinée plus loin.

Expérience No 8 :

cet essai avait pour but de déterminer plus exactement le pH d’adsorption optimum, et aussi de comparer l’AL, O, de Siegfried à celui de Brockmann (Merck).

Poux ep “OT = S ‘(PRIN) EURO uOf9s FO‘IV =

‘ £SOT ON LT | SS onbrue93 ourxoyeuy

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Avec la même anatoxine tétanique No 1053, nous avons préparé pour chaque échantillon 4 colonnes d’adsorbant, à

pH 6,5 — pH 6,0 — pH 5,5 — pH 5,0.

Pour gagner du temps en raccourcissant le lavage, nous avons agité l'oxyde d'aluminium dans un ballon avec une solutiontampon, puis acidifié jusqu’à obtenir le pH désiré. La suspension est ensuite versée dans le tube à chromatographier. On fait alors passer 100 cc. d’anatoxine tétanique dans chaque colonne.

Cependant au cours du passage de l’anatoxine, l’adsorbant libère de l’alcali, et les filtrats n’ont plus exactement le pH original; ces altérations du pH et les titrages des U. F. sont rapportés dans le tableau 14. L'élution des colonnes fut conduite comme pour l'expérience précédente.

Tous les filtrats contiennent moins d’'U. F. que l’anatoxine originale. Il s’est donc produit une adsorption. Les deux variétés d’AI,O, examinées — Brockmann et Siegfried — ont le même pouvoir adsorbant. De pH 6,9 à pH 6,2, la fixation de l’antigène sur le sel d'aluminium est mauvaise : elle est bien meilleure à pH 5,7, puisque le filtrat ne contient plus que 3 U.F./cc., le 80 % de l’antigène ayant été retenu par l’ALO.. L'adsorption du toxoïde ne se fait pas dans une zone déterminée : elle est répartie sur toute la hauteur de la colonne.

Expérience No 9 :

pour éviter l’alcalinisation secondaire, au cours de la filtration au chromatographe, nous avons préparé la suspension d’adsorbant quelques heures à l’avance, en l’agitant fréquemment entre temps, et en réglant constamment le LEE La colonne formée est encore perfusée avec 1,0 litre de solution-tampon. Cette fois, le filtrat à la sortie de la colonne garde le même pH qu’au départ : 6,0 St 2,4 5,0 pour les 4 colonnes.

Après passage de 100 cc. de l’anatoxine 1040 (pH original 6,9; 26 U.F. et 4,64 mgr. N par cc.), les colonnes sont expulsées et divisées en deux moitiés. Chaque fraction est reprise dans 30 cc. d’eau distillée à pH 7,5. Les temps de l’élution sont les mêmes que dans les expériences précédentes. Nous avons, de chaque filtrat et de chaque éluat, déterminé le titre floculant et le taux d’azote total.

Tableau 15. Titrages des U.F.

Colonne à | pH 6,0

Anatoxine tétanique 26 No 1040 | |

De pH 6,0 à pH 5,0 l’adsorption est relativement mauvaise, puisque le filtrat le plus faible contient encore 14 U.F. par cc.; elle est de l’ordre de 30 %. Bien que l’adsorption à pH 5,0 se révèle légèrement supérieure à celle réalisée aux autres pH, il n’y a, semble-t-il, pas de zone optima, et une opération faite en milieu plus acide conduirait à une précipitation du toxoïde, dont le point isoélectrique est voisin de 4,7 : la colonne de chromatographie ne jouerait alors qu’un rôle de simple filtre. Les deux oxydes d'aluminium examinés donnent des résultats superposables.

Les pertes en unités floculantes, calculées pour la colonne pe P de pH 5,0 et l’ALO, de Brockmann sont les suivantes :

Nombre d'U. F. :

dans l’anatoxine tétanique originale: 100 cc. X26 U.F.—2600 U.F. dans le filtrat: 100 cc. X 14 U.F. — 1400 U.F.

daus l’éluat sup.: 30 cc. X 17 U.F. — SIOU.F. dans l’éluat inf.: 30 cc. X13U.F. — 390U.F.

unités floculantes récupérées : 2300 unitées floculantes restées adsorbées ou perdues : 2600 mass =—=300 U:F soit 12°/0.

Compte tenu des différentes manipulations, et des pertes

de matériel qui leur sont inhérentes, les pertes d’antigène sont ainsi relativement faibles, ce qui démontre soit que l’élution fut très poussée, soit que l’adsorption fut mauvaise.

La purification est également mauvaise : les meilleurs éluats obtiennent un index P qui ne dépasse pas 2,3 !

Discussion

Dans ses travaux sur les toxines tétanique et diphtérique, Ballinari 43 obtint une adsorption élective de l’antigène avec des colonnes chromatographiques d’Al,O.. Le principe actif de la toxine était — au pH approprié — fixé dans les quelques centimètres supérieurs de la colonne. Dans nos conditions d’expérience, où nous avons utilisé la même technique et les mêmes adsorbants que cet auieur, il ne fut guère possible de fixer le toxoïde dans une zone donnée de la colonne de chromatographie.

L'emploi de la chromatographie avec l’oxyde d’aluminium selon Brockmann de Merck et l’oxyde d'aluminium de Siegfried ne permettent ni une concentration, ni une purification de l’anatoxine tétanique qui soient d'un intérêt évident.

Conclusions

Des deux méthodes de concentration et de purification auxquelles nous avons soumis l’anatoxine tétanique, la salure au sulfate de soude s’est révélée d’un rendement utile, tandis que la chromatographie avec deux oxydes d'aluminium n’a pas donné de résultats favorables.

L'adjonction de 20 % en poids de sulfate de soude au toxoide tétanique fait apparaître à la surface du liquide une mousse peu abondante, blanc-jaunâtre, mal liée, qui contient de l’azote et une faible quantité d’antigèene. Si l’on augmente de 5 % la concentration saline, il se forme une nouvelle mousse, plus abondante et un peu mieux liée, très riche en antigène, mais relativement pauvre en azote. Avec l’augmentation du taux de salure, de 5 en 5 , il se forme de nouvelles mousses qui sont de plus

rt Ra di à odané ut “aus de PME nd \ vw = EN

ANT PT INT DUT SPEED 1e NN LT

en plus brunâtres, visqueuses et collantes, hydrophiles: elles contiennent de moins en moins d’antigène.

La salure optimum est comprise entre 21 et 25 % de sulfate de soude; la mousse recueillie représente alors une forte concentration des unités floculantes. La purification de l’antigène est aussi élevée : l’unité floculante d’anatoxine peut être débarrassée de 98,74 % de son azote original.

Toutes les anatoxines tétaniques ne se prêtent pas avec la même docilité à la purification par le sulfate de soude, et les pertes totales d’antigène, au cours de l’opération, oscillent entre

23 et 87 %.

L’anatoxine tétanique est une solution colloïdale, et, lors de la salure fractionnée, les divers taux d’électrolytes sollicitent des micelles de grandeur différente. A chaque concentration saline correspond une autre fraction protéinique: or chacune de ces fractions contient de l’antigène. On peut en déduire que ce dernier n’est pas lié à une micelle de dimension rigoureusement déterminée. La molécule de toxoïde serait ainsi de nature chimique variable, ce qui ferait admettre pour cette molécule une combinaïison d’au moins deux constituants : l’un, le toxoïde tétanique proprement dit, spécifique et identique dans chaque molécule d’anatoxine; l’autre, non spécifique et de structure multiple, qui fixerait la grandeur de la molécule.

La méthode d’enrichissement et de purification par le sulfate de soude trouve une application certaine dans le problème pratique de l’immunisation. Elle ‘permet d’obtenir une plus grande quantité d’antigène par unité de volume, d'éliminer la plupart du ballast indésirable, et de donner une valeur uiile aux anatoxines à faible pouvoir floculant.

Nos essais d’enrichissement et de purification de l’anatoxine tétanique par chromatographie n’ont donné par contre aueun résullat pratique intéressant.

Con

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