A. — MESURE DE LA PROTEOLYSE

Nous avons étudié les variations de l'activité des ferments de l’Histolytique et du Sporogène, variations avec les conditions de culture, avec l’âge des cultures, enfin avec le mode d'obtention des ferments.

Pour mesurer d'une façon rapide et commode cette activité diastasique, nous avons adopté l'épreuve de la digestion de la gélatine. ,

Nous avons pris de la gélatine extra-fine, fondue au bain-marie à 50 degrés dans dix fois son poids d’eau distillée. Nous avons alcalinisé cette gélatine au tournesol (environ { ec. de soude décinormale pour 10 cc. de liquide), puis nous l’avons chauftée à 110 degrés pendant 10 minutes pour précipiter les phosphates. Nous avons ensuite filtré la solution, réparti en tubes par 2 cc., enfin nous avons stérilisé ces tubes 10 minutes à 105 degrés.

Nous avons ajouté à cette gélatine liquéfiée à 37 degrés, des quantités de ferment variables que nous avons laissées agir à 38-40 degrés. Toutes les dix minutes, nous retirions les tubes pour les mettre dans un bain à 12 degrés. Les tubes témoins se resolidifiaient en 2 minutes 30 sec. ; les tubes contenant le ferment restaient au contraire liquides plus ou moins longtemps. Nous considérions la digestion comme totale lorsque la gélatine était.-encore liquide après 20 minutes de séjour à 12 degrés.

Cette méthode nous a ainsi permis de choisir les ferments les plus actifs. Avec les ferments obtenus dans les meilleures conditions, nous avons ensuite recherché les modalités de la digestion des deux microbes sur les diverses albumines. Comme la digestion de la gélatine ne nous donnait que des indications grossières sur les actions digestives, nous avons utilisé deux autres méthodes pour mesurer la protéolyse d’une façon plus détaillée et plus exacte :

(1) Tétrage de l'azote au formol.

(2) Précipitation par l'acide trichloracétique bourtlant.

(1) Tirrace Au roRmoz. — Cette méthode due à SOERENSEN mesure quantitativement les protéines désagrégées au stade acides aminés. SOgRENSEN a appliqué les observations de SciFF, que les solutions neutres d'acides aminés prennent une réaction acide par addition de formaldéhyde.

Les matières protéiques ont habituellement une réaction

Nu?

amphotère. Les chaines peptides CH/ sont neutres.

NCOOH

Mais si l'on ajoute du formol, la fonction basique NH? entre en combinaison, la fonction acide COOH devient libre et se mani- NEP N—CH :.

RARE TR LCD = RE CA Er SCOOH NCOON Le produit dela réaction se comporte comme un acide monoatomique. On titre ainsi les fonctions acides et indirectement Les

noyaux aminés apparus.

Technique de la méthode. — Nous avons mesuré dans un ballon 5 à 10 cc. du liquide contenant les produits de digestion à titrer. Nous avons neutralisé ce liquide en présence de phtaléine, avec une solution décinormale de soude jusqu'à l'obtention d’une teinte légèrement rose. Nous avons ajouté ensuite 5 à 10 cc. de formol du commerce neutre à la phtaléine et filtré. Si le liquide titré contenait des acides aminés, il se décolorait. Nous versions alors en agitant, la solution décinormale de soude jusqu’à la réapparition de la teinte rose primitive. Pour nous

assurer que la réaction était complète, nous ajoutions au liquide 1 à

Met Pr

2 cc. de formol. Cette addition supplémentaire ne devait pas modifier la coloration obtenue. Le volume de soude employé indiquait la quan-. lité de chaïnes peptides libérées.

Cette méthode, d’après Sœnensex, dose 90 0/0 de l'azote aminé. Elle donne de bons résultats quand le titrage se pratique sur une quantité de liquide suffisamment grande, de 4 à 10 ce., et si l’on emploie pour la réaction un minimum de 3 à 4 ce. de soude décinormale. Nous avons tâché de rester dans ces limites, aussi n’avons-nous pas jugé nécessaire de recourir à la méthode de Vax Sivre, plus récente, qui permet des mesures précises sur des quantités très réduites.

(2) LA PRÉCIPITATION PAR L'ACIDE TRICHLORACÉTIQUE A CHAUD, NOUS a permis de mesurer les digestions à un demi-milligr. près, et de reconnaitre les produits de digestion moins avancés que les acides aminés :

Albumine vraie, est précipitée ; :

Albumose, filtre à chaud, est précipitée à froid ; ;

Peptone, acide aminé, restent en solution

Nous avons ajouté aux liquides de digestion un égal volume d’une solution d'acide trichloracétique à 10 0/0 Nous avons porté les mélanges à l’ébullition, puis jeté les liquides sur un double filtre taré. Nous avons lavé les filtres rapidement à l’eau bouillante pour éviter leur corrosion par l’acide. Les filtres étaient ensuite desséchés à 37 degrés, puis à 105 degrés, jusqu'à poids constant, enfin pesés. Nous avons examiné chaque fois les liquides qui avaient filtré pour y rechercher les albumoses (précipité par refroidissement).

Le plus souvent, nous avons complété ces recherches par le dosage de l’ammoniaque (distillation en présence de magnésie légère), la caractérisation dans les produits de digestion : des peptones (réaction du biuret), de l’ammoniaque (réactif de Nesscer), des phénols (chlorure ferrique), de l'indol (réaction

indol-nitreuse).

B. — CULTURES ANAÉROBIES -

Les bacilles Sporogène et Histolytique sont des anaérobies stricts. Une première difficulté consistait à trouver un #0de de culture pratique pour les expériences que nous nous proposions d'exécuter.

Nous avons commencé par faire des cultures dans le vide. Nos ballons de bouillon étaient stérilisés à l’autoclave à 105 degrés, ensemencés à A0 degrés, puis fermés au moyen d'un bouchon de caoutchouc vaseliné, traversé par un tube de verre. Le tube était adapté à une pompe, le vide effectué à une pression négative de 74 centimètres de mercure, puis le tube de verre étiré et scellé avec un fin chalumeau. Mr

Ce procédé est parfait (on peut le compléter par un lavage avec un gaz inerte). Mais il est long et coûteux. Les ballons sont fragiles à cause du vide. Si pour une raison quelconque la culture se fait mal, on hésite à recommencer toutes ces manipulations.

Pour réaliser une anaérobiose facile et rapide des milieux de culture nous avons recouru au sulfure de calcium, qui produit une atmosphère de gaz sulfhydrique pratiquement dépourvue d'oxygène, Nous privions tout d’abord le bouillon de culture de la plus grande partie de l'air qu'il renfermait par une stérilisation à l’autoclave à 105 degrés, ou pour les petites quantités de milieu par une ébullition rapide au bain-marie - à 100 degrés. Nous ajoutions ensuite une pincée de sulfure de calcium stérilisé au four à flamber (environ une anse de platine pour 10 centimètres cubes de bouillon). Nous ensemencions ensuite.

Nous nous sommes assuré que ce mode de culture conservait au bacille et à ses extraits tous les caractères des cultures dans le vide (Césam et ALzeaux ont fait la même constatation pour lactivité des toxines du B. de Scamonz et du B. tetamu cultivés dans les milieux au sulfure de calcium). Dans nos

SR

mesures de protéolyse, nous n'avons jamais trouvé d’inconvénient à la présence de légères quantités de gaz sulfhydrique dans les liquides de digestion.

En recherchant le meilleur milieu de culture, nous avons constaté que le bouillon de viande putréfiée permettait, toutes choses égales d’ailleurs, une culture plus facile que le bouillon peptone ordinaire, soit qu'il contint des hormones favorisant le développement microbien, soit que sa teneur plus forte en acides aminés activât la protéolyse et la croissance.

PRÉPARATION DU BOUILLON DE VIANDE PUTRÉFIÉE. — Faire macérer un kilo de viande de bœuf hachée finement dans deux litres d'eau de fontaine, pendant 24 heures à 37 degrés. Faire bouillir à feu doux pendant 20 minutes. Filtrer, ajouter la quantité de soude décinormnale nécessaire pour une réaction neutre à la phtaléine. Précipiter par un chauffage à 80 degrés, puis à l’autoclave à 115 degrés. Filtrer sur papier Carpin. Ajouter deux litres d’une solution de peptone à 4 0/0, neutre au tournesol. A ce moment le milieu est à peu près neutre au tournesol: Enfin stériliser à l’autoclave à 105 degrés pendant 15 minutes.

PROTÉOLYSE DANS LES CULTURES. — Nous nous sommes ensuite demandé qu'elle était l'influence de l'âge des cultures et de la composition du milieu sur le pouvoir protéolytique.

Nous avons pris plusieurs tubes contenant 10 ce. de bouillon de viande putréfiée, neutre au tournesol, privés d'air par un séjour de quelques minutes au bain-marie bouillant et additionnés de sulfure de calcium.

Nous les avons ensemencés avec 4 gouttes de cultures d’'Histolytique ou de Sporogène, âgées de 24 heures d’étuve à 37 degrés.

Dans deux tubes témoins, nous avons dosé immédiatement l'azote titrable au formol. Nous avons placé les autres tubes à l’étuve à 31 degrés. Toutes les six heures pendant le premier jour, puis toutes les 24 heures, nous retirions deux tubes l’un de Sporogène, l’autre d'Histolytique; dans lesquels nous titrions également l'azote formol.

Les courbes ci-dessous schématisent les résultats obtenus. En abscisses, sont les temps (en heures) de séjour à l’étuve. En ordonnées, sont les valeurs en centimètres eubes de soude déci-

ENST UV RE

normale de l'azote titrable au formol, pour 10 centimètres cubes du milieu de culture, Nous n'avons représenté que la

partie intéressante des courbes. Les dosages ont en effet été poursuivis jusqu'après le 15° jour d'étuve.

dé Histolyique

Sporogène

Fig. 1. — Protéolyse dans les cultures.

Nous remarquons sur ces courbes que la protéolyse est considérable pour le Sporogène à partir de la 40° heure d'étuve et maxima à la 70° heure. RE

Pour l’'Histolytique, la production d'acides aminés est intense de la 15° à la 24° heure, par conséquent d’une façon beaucoup plus précoce. La protéolyse de l'Histolytique est aussi plus puissante.

Nous avons additionné nos milieux de culture, de glucose (0,50 à { 0/0), de carbonate de chaux (0,50 0/0), de phosphate de potasse (1 0/0). La mesure de la protéolyse de nos deux

microbes dans ces différents milieux ne nous à pas donné des résultats intéressants. Le carbonate et le phosphate ont paru sans effet. L'Histolytique est sans action sur le glucose. Au contraire, ce sucre est attaqué fortement par le Sporogène dont le développement est favorisé.

Enfin, nous avons essayé de mesurer l'influence des associalions microbiennes sur la protéolyse. Nous avons fait de nombreux ensemencements de divers Sporogènes et de divers Protées, aérobies très protéolytiques, tantôt en cultures communes, tantôt en cultures isolées. Nous avons trouvé dans tous les milieux une augmentation analogue des acides aminés; les actions digestives des divers microbes ne semblent pas s’ajouter. Les aérobies ne fournissent aucune aide pour la protéolyse des anaérobies, ils ne sont utiles que comme réducteurs, pour réaliser l'anaérobiose du milieu.

Il reste à déterminer quelle est la concentration optima en ions permettant la culture de nos deux anaérobies. Cette question importante fait l’objet d'un chapitre spécial: