C. — ISOLEMENT DES FERMENTS

Les microbes agissent par leurs sécrétions. La manière la plus simple d'obtenir ces sécrétions est de filtrersur bougie les cultures totales. Nous avons employéles bougies CaamBerLanD F avec une pression négative de 40 centimètres de mercure, à une température de 18 à20 degrés. ;

(1) Hozperer a montré l'importance de la réaction du milieu dans la filtration des enzymes. C’est ainsi que la présure et la pepsine ne filtrent bien qu’en milieu neutre où qu'en milieu acide à 2 0/0 d'acide chlorhydrique. La trypsine, elle, demande un milieu alcalin. La papaïne passe en toutes réactions, de la neutralité au méthylorange à la neutralité à la phtaléine.

La réaction de filtration la plus favorable parait donc être

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celle-là même que réclame le ferment pour agir, légèrement acide pour le lab et la pepsine, alcaline pour la trypsine, imdifférente pour la papaine. Nous montrerons que c’est la neutralité au tournesol qui est favorable à nos microbes pour se développer, et à leurs ferments pour agir. Les cultures totales donnent approximativement cette réaction optima, il était donc indiqué de les filtrer telles qu’elles.

Mais devant certains résultats négatifs, nous avons recherché siune autre réaction ne serait pas plus favorable. Nous verrons plus loin que les filtrats normaux n’attaquent pas sensiblement l’ovalbnmine crue. Nous avons filtré les cultures sous différentes réactions : neutralité au tournesol (réaction normale), neutralité à la phtaléine, neutralité au méthylorange, puis ramené tous Les filtrats à la neutralité au tournesol. L'expérience nous a montré que le pouvoir digestif ne varie nullement et que par conséquent la réaction de filtration n’est pas en cause dans ce résultatnégatif. «

(2) Reste à trouver dans quelles conditions nous obtiendrons les ferments les plus puissants. Pour rechercher de quels facteurs dépend l’activité des extraits, nous avons fait varier les conditions de culture et le mode d'obtention des extraits. Nous avons éprouvé ensuite sur la gélatine leur pouvoir digestif.

(a) Nous avons déjà vu que, dans les cultures, la protéolyse est maxima après 24 heures pour l’Histolytique, après 72 heures pour le Sporogène. L'expérience ci-après montre que les filtrats les plus gélatinolytiques proviennent également des cultures âgées de 24 heures pour l'Histolytique, ou de 72 heures pour le Sporogène.

Nous avons ensemencé Îes deux microbes sur du bouillon de viande putréfiée et nous avons filtré les cultures sur bougie CHamBErLAnD F, après des temps de séjour variables à l'étuve à 37 degrés (de 6 heures à 10 jours). Nous avons recherché avec vingt gouttes de ces filtrats préalablement neutralisés au tournesol, le temps de contact à 37 degrés nécessaire pour amener la liquéfaction persistante à 12 degrés de 2 cc. de gélatine à 10 0/0. Le tableau ci-après représente les résultats obte-

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nus. En abscisses, sont marqués les temps de séjour à l'étuve des différentes cultures totales d’où proviennent les filtrats. En ordonnées, est marqué le temps de contact à 37 degrés nécessaire pour la digestion complète de la gélatine.

Fig. 2. — Influence de l’âge des culiures sur le pouvoir gélatinolytique des filtrats.

L'étude des courbes ci-dessus met en évidence l'optimum d’activité- des deux filtrats, provenant pour l'Histolytique de cultures âgées de 24 heures, pour le Sporogène de cultures âgées de 72 heures. À la 15° heure de culture pour l'Histolytique, à la 24° heure pour le Sporogène, le pouvoir ECS que est déjà important.

(b) Nous avons également mesuré l’activité gélatinolytique pour les filtrats de cultures sur milieux glucosés, carbonatés,

phosphatés ou contenant des mélanges de ces substances, par

rio

analogie avec ce que nous avions fait pour les cultures totales.

Pour l'Histolytique, nous n'avons pas trouvé de différences importantes. Le glucose paraît favoriser l'apparition du ferment, quoique ce sucre ne soit pas attaqué. Pour le Sporogène,

10" Je ; Tenps de confact

Fig. 3. — Influence de la composition du milieu de culture sur la production de gélatinases.

l'addition de glucose est nettement défavorable. Nous reproduisons les courbes d’action de deux filtrats normaux ou glucosés, ramenés à la neutralité au tournesol. En abscisses, sont les heures de contact au bain-marie à 37 degrés des filtrats et de la gélatine. En ordonnées, est portée la durée de l’état liquide à 12 degrés. Nous avons désigné par le signe æ la liquéfaction persistant 20 minutes à 12 degrés (digestion totale).

Le glucose est attaqué par Le Sporogène. La culture est abon-

dante et la production de gaz augmente. Le ferment glycolytique se développe, le ferment protéolytique (gélatinase) a son activité diminuée. Ce balancement entre les productions des deux ferments relève sans doute d’une adaptation spécifique au milieu nutritif.

(e) Nous avons constaté précédemment que le pouvoir digestif des filtrats dépendait étroitement de l’âge des cultures dont ils dérivent. Ainsi, les filtrats de cultures très jeunes (moins de 6 heures) sont inactifs sur la gélatine. Le pouvoir digestif n’apparaît guère que vers la 10° heure de culture ; il augmente rapidement avec l’âge de la culture pour demeurer après le 4° jour à peu près stationnaire. Le ferment protéolytique ne se montre done qu'après un certain nombre de divisions microbiennes et qu'après la mort d’une quantité plus ou moins grande de bacilles. Cette mort s'accompagne de la dégénérescence du corps bacillaire, de son autolyse Ce phénomène intervient certainement dans l'apparition du ferment soluble microbien. Nous avons essayé d'augmenter artificiellement eette autolyse microbienne par l’action du chloroforme sur de jeunes cultures. Nous avons pu ainsi déterminer que la chloroformisation favorisait la libération du ferment digestif dans les cultures. Mais après un certain âge, 80 heures pour la culture du b. sporogène, 24heures pour celle du b. histolytique, l’action favorisante du chloroforme disparait.

Expérience. — Nous avons pris des cultures des deux microbes sur bouillon de viande putréfiée, additionné de sulfure de calcium et ayant 72 heures d’étuve pour le Sporogène, 15 heures d’étuve pour l’Histolytique. Dans chaque ballon de culture nous avons ajouté quelques centimètres cubes de chloroforme de façon à réaliser la saturation du milieu. Nous avons ensuite filtré sur bougie ces cultures après des temps variables de contact avec le chloroforme : 10 minutes, 1 heure, 6 heures, 24 heures, 48 heures. Nous avons répété la même expérience à différentes températures : 5 degrés, 18 degrés, 37 degrés.

Nous avons enfin mesuré le pouvoir digestif de À ce. de ces filtrats sur 2 cc. de gélatine à 10 0/0. Comme témoins, nous avons pris les cultures du même âge non chloroformées, filtrées après un séjour analogue à 5 degrés, 18 degrés, 37 degrés. Nous reproduisons ci-après un.

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résultat type de ces expériences. Nous avons fait agir le chloroforme à 18 degrés pendant des temps variables, de 10 minutes à 24 heures. Dans la troisième colonne, est indiqué le temps nécessaire au ferment pour la digestion totale de la gélatine. Plus ce temps est court, plus le ferment est actif.

Influence de la durée de la chloroformisation des cultures sur la gélatinase des filtrats.

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Durée de la k :

; 3 Rene Temps nécessaire Témoin 2 de :

. x 10 minutes 9 h.2 Sporogène (72 h.) d'heure 0 h. 30 24 heures 0 h. 30 | Témoin 5 h.

; : ï 10 minut 4 h.

Histolytique (15 h.) 1 Re 8 h.

24 heures : She |

Nous voyons que les meilleurs résultats d’autolyse s’obtien-

nent par un contact très rapide : 5 à 10 minutes à 18 degrés Des séries d'expériences sur le même objet, nous ont démontré également que la température de 18 degrés était la plus favorable. Comme on pouvait s'y attendre, le séjour à la glacière

retarde l’action du chloroforme, le séjour à l’étuve l’accélère. Le chloroforme parait libérer brusquement une certaine

quantité de ferment, qui était en puissance dans’ les bacilles. Prolongée, l’action du chloroforme est nettement défavorable.

(d) Nous avons essayé d'isoler les principes actifs des filtrats en éliminant le plus possible les matièresinertes par des précipitations. Les diastases sont entrainées par le précipité que l’on reprend ensuite par l’eau.

L'alcool-éther à parties égales ne nous à pas donné de bons résultats. Nous nous sommes servis de la précipitation par 6 volumes d'alcool à 96°. Le précipité floconneux était après

24 heures de contact desséché dans Le vide, puis redissous dans l'eau de façon à réaliser une concentration de 20/1, vis-à-vis du filtrat prunitif. Le liquide obtenu était filtré. Il présentait bien entendu, la réaction neutre au tournesol de l’eau qui avait servi à le préparer. Nous l'avons appelé précipitat pour le différencier du f/trat originel.

Nous n'avons pas trouvé de sérieux avantages à cette opération coûteuse et compliquée. Voici, par exemple, les pouvoirs digestifs comparés, dans le cas du Sporogène, de deux précipitats C2 et D2, et des deux filtrats C1 et Di dont ils dérivent par une concentration de 20/1. Nous avons comparé l’activité des gélatinases, des labs, et des caséases, en prenant dans chaque cas pour unité le ferment du filtrat. La réaction des filtrats et des autolysats était analogue (pH — 7,0, selon la notation de S'ŒRENSEN).

Le profit n'est pas suffisant pour nous faire suivre cette méthode.

Influence de la concentration des filtrats sur l’activité diastasique B. Sporogenes.

Concentration ‘Gélatinase Lab Caséase

Nous avons essayé en vain de démontrer l'existence de l'endodiastase, hhbérée par l'autolyse. La centrifugation d'une culture jeune nous a donné un liquide clair ayant les mêmes propriétés que le filtrat lui-même, Le culot de centrifugation lavé rapidement, puis centrifugé à nouveau, mis en contact avec divers agents autolysants (chloroforme, eau distillée), nous a fourni un extrait inactif sur la gélatine.

Les corps microbiens dont on cherche la dislocation prennent

rapidement des formes de résistance (sporulées ou non) et sont dès lors réfractaires à l’autolyse.

Xésumé. — Tous ces essais nous indiquent que la méthode pratique pour obtenir des filtrats actifs est de cultiver chacun des deux anaérobies en bouillon de viande putréfiée, privé d'air par l’ébullition, additionné d'une pincée de sulfure de calcium, puis de filtrer ces cultures sur bougie après un séjour à l’étuve, de 24 heures pour l'Histolytique, de 72 heures pour le Sporogène (cette culture chloroformée 5 minutes à 18 degrés avant la filtration). | :