DATES
l'addition de l’alcool. Pour éviter cet inconvénient il faut procéder de la façon suivante:
Placer dans un tube de centrifugation:
Sérum à examiner: 2 CC.
Diazo-réactif fraîchement préparé: 1 cc.
Agiter fortement et placer pendant 10 minutes à l’obscurité. Puis ajouter:
Alcool à 95°: 5,8 cc.
Solution saturée de sulfate d’ammonium: 2 cc.
Agiter fortement et centrifuger.
Décanter le liquide limpide surnageant, qui a une coloration rouge.
Mélanger dans un tube à essai ou à hémolvse bien propre:
le liquide rouge: 1,8 ce.
et l’acide chlorhydrique concentré: 0,2 cc.
Agiter; on obtient immédiatement une coloration bleuviolet.
Examiner à la cellule photoélectrique.
Si s’est nécessaire on peut également filtrer à travers un .papier filtre préalablement humecté à l’éther; d’autre part si la concentration en bilirubine était trop intense, on peut diluer à l’aide de la solution suivante:
Liqueur de dilution: Alcool à 95°:%9°cc., Acide chlorhydrique concentré: 1 cc.
Dans ce cas il faut tenir compte des proportions de dilution pour calculer les résultats définitifs de la bilirubinémie.
Etablissement de la courbe d’étalonnage.
Pour établir notre courbe d'étalonnage nous sommes parti de la bilirubine «Roche» (C3*H*%606N4). Nous avons préparé une solution standard à 5 mgr. pour 100 ce. de chloroforme.
À partir de cette solution nous avons effectué une série de solutions alcooliques de biliverdine à concentrations progressivement décroissantes de la facon suivante:
Nous prélevons de la solution chloroformique les doses de 0,1 — 0,2 — 0,4 — 0,8 — 1,0 — 1,6 — 2,0 — 3,2 — 4,0 — 6,4 8,0 centimètres cubes que nous introduisons séparément dans un tube à essai; puis nous évaporons le chloroforme. Nous reprenons les résidus à l’aide de:
Alcool à 95°: 11 cc.
Diazo-réactif fraîchement préparé: 5 ce.
Nous attendons pendant 10 minutes et nous ajoutons: Acide chlorhydrique concentré: 4 cc.
Nous mélangeons bien et obtenons une gamme de solutions à teintes bleu-violet progressivement plus intenses. A l’aide de ces solutions nous avons établi notre courbe d’étalonnage que nous reproduisons ici, correspondant aux degrés opacimétriques de la cellule photo-électrique indiquée en ordonnée et aux taux de bilirubine portés en abscisse.
Le tableau N° X exprime ces différentes valeurs,
Tableau N° X.
Courbe d'étalonnage de la bilirubine.
Solution Teneur en Biblirubine Teneur en Biliburine Degré chloroformique de la prise d'essai : pour 1000 Opacimétrique ce en mgr. en mer. ) 0,2 0,01 0,5 87 0,4 0,02 1,0 72 0,8 0,04 2,0 60 1,0 0,05 2,5 54 1,6 0,08 4,0 41,5 2,0 0,10 DU 36 d,2 0,16 8,0 26 4,0 0,20 10,0 23.0 6,4 0,32 16,0 19,0 8,0 0,40 20,0 —
Les degrés opacimétriques indiqués par notre graphique indiquent directement le taux de la bilirubinémie en milligrammes pour 1000 cc., si l’on effectue la réaction de THANN- HAUSER et ANDERSEN, telle que nous l’avons indiqué et en partant de 2 cc. de sérum. La réaction définitive et pour la diazo-réaction indirecte et pour la diazo-réaction directe s'opère ainsi au moyen de 0,33 ec. de sérum.
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Graphique N° 7,
Nous voyons que la courbe donne des résultats suffisamment exacts entre 26 M. V. et 72 M. V. c’est-à-dire pour des hyperbilirubinémies limitées entre 8 et 1 mg. pour 1000. La sensibilité est moins rigoureuse pour des taux de bilirubine situés entre 0,5 et 1 mg. pour 1000, la courbe permet cependant encore dans ces cas d’hyperbilirubinémie peu marquée une évaluation approximative, satisfaisante pour la clinique.
Avant de terminer ce chapitre, nous tenons à exposer la technique de préparation d’une solution standard artificielle, permettant au biologiste dépourvu de bilirubine pure d'établir une courbe d’étalonnage.
On introduit dans un ballon jaugé de 100 cc.: Alun de fer ammoniacal: 0,1508 gr.
Acide chlorhydrique concentré (D— 1,19): 50,0 cc.
Agiter pour dissoudre, puis ajouter:
Eau distillée q. s. p.: 100.0 cc.
Cette solution est stable, elle se conserve indéfiniment et est équimoléculaire à une solution de N/320.
De cette solution on prépare ensuite une solution de N/8000 en prélevant 10 cc. On y ajoute 25 ce. d'acide chlorhydrique concentré et on complète avec de l’eau distillée dans un ballon jaugé à 250 cc.
Cette solution diluée peut aussi être conservée pendant plusieurs mois.
D’autre part on prépare une solution de sulfocyanure de potassium à 10 pour 100.
Pour obtenir la solution étalon (remplaçant la bilirubine) on introduit dans une ampoule à décantation de 50 ou 100 cc.:
: , , e = ne 947 la solution diluée de l’alun de fer ammoniacal: 3 ec.
la solution de sulfocyanure de potassium: 3 cc.
Il se forme du sulfocyanure ferrique que l’on épuise par agitstion au moyen de 12 cc. d’éther sulfurique. La coloration de cette solution éthérée correspond à celle d’une solution diazo-bilirubine à 5 mg. pour 1000. On peut ensuite établir la courbe par dilution progressive à l’aide d’éther sulfurique en évitant l’évaporation. On compare cette teinte à celle d’un sérum où l’on a déterminé le taux de bilirubine par la méthode de VAN DEN BERGH.
Finalement nous voudrions encore mentionner Ja méthode de JENDRASSIK et CZziKE (192), modification de celle de THANNHAUSER et ANDEPSEN. Elle offre l’avantage de s’appliquer indifféremment aux sérums à réaction indirecte et directe. Elle se base sur le fait que l’addition de benzoate de soude et de caféine dans le sérum permet d’obtenir des résultats quantitatifs aussi dans les bilirubinémies à réaction directe. Ce sel empêcherait l’adsorption de la bilirubine per les substances protéidiques. Nous avons cependant toujours eu satisfaction avec la méthode de THANNHAUSER et ANDERSEN, telle que nous l’avons exposée antérieurement.
On voit que notre technique permet, même pour des concentrations de bilirubine, ne dépassant que très faiblement le taux normal du sang humain, d'obtenir encore des résultats utilisables et suffisamment exacts pour la clinique. Pour des concentrations plus fortes, dépassant 1 mg. pour 1000, la méthode est très précise.
Rien ne s'oppose, si l’on veut obtenir des valeurs rigoureuses dans des cas de bilirubinémie peu prononcée, d’effectuer le dosage sur 4 ce. de sérum et diviser le résultat final par deux.
Nous croyons avoir ainsi donné une méthode de dosage de la bilirubine assez facilement à réaliser, d’exécution rapide et économique, n’exigeant pas de trop grande quantité de sérum et donnant des résultats corrects, plus rigoureux de toute facon que toutes les autres techniques employées habituellement, même que celle de BAKALTSCHUK (méthode néphélométrique), actuellement très recommandée en Allemagne. Seul Fexamen spectrophotométrique dépasse au point de vue sensibilité notre méthode.
Conclusions Générales é
Nous croyons avoir pu mettre en évidence au cours de l'exposé de notre modeste travail l’intérêt considérable que présentent ces dosages microbiologiques pour le clinicien et ses malades en premier lieu, pour le pharmacien-biologiste aussi. D’autre part on se rend compte de l’avantage que l’on trouve dans l'emploi de la cellule photo-électrique permettant des techniques opacimétriques suffisamment exactes pour la clinique et le laboratoire d'analyses médicales.
Les principales qualités de ces microdosages résident: à le)
1) dans la quantité réduite de prélèvement humoral nécessaire pour effectuer un dosage correct;
2) dans la répétition facile des prises de sang peu abondantes et n’exigeant qu’une petite piqûre au niveau d’un doigt ou d’une oreille, permettant ainsi des recherches en séries régulières et à courts intervalles;
3) dans l'exécution facile, rapide et économique des dosages, avec une sécurité et une précision largement suffisantes pour les besoins de la pratique médicale.
Il y a là un ensemble de qualités qui légitiment l'effort que nous avons accompli en élaborant des techniques décrites avec tous les détails et beaucoup de soins pour doser au moyen de la cellule photo-électrique:
l’albumine urinaire; l’acétone et les corps cétoniques dans les urines;
l'alcool dans l’urine des hommes épris de boissons;
l’hémoglobine sanguine pour l’établissement exact d’un diagnostic hématologique;
le cholestérol total et libre du plasma sanguin, permettant le contrôle de l’équilibre du rapport de ces deux facteurs de la cholestérolémie normale et pathologique;
la bilirubine des sérums normaux et pathologiques à diazo-réaction directe et indirecte.
Nous avons ainsi pu donner pour l’albumine urinaire une technique simple pour préparer des solutions étalons permettant d'établir une courbe pour doser rapidement les fractions protéidiques pouvant se trouver dans des urines pathologiques. Le maximum de sensibilité pour ce dosage se trouve compris entre 0 gr. 1 et 0 gr. 25 d’albumine par litre;
Pour les dosages de l’acétone et des corps cétoniques dans l’urine nous avons élaboré une technique se basant sur la méthode de ROTHERA. Celle-ci est suffisamment sensible pour l’examen à la cellule photo-électrique, étant donné que dans nos conditions expérimentales la sensibilité de l’appareil n’atteint pas la limite de la sensibilité de la méthode même, Notre technique adaptée à la mesure colorimétrique exacte permet une manipulation rapide et fournit des résultats précis.
Le dosage de l’alcool dans les urines a été réalisé par la méthode de PROSENTHALER-HAMBERSIN. Nous avons pu démontrer que l’oxydation de l'alcool par le diazo-réactif s'arrête au stade aldéhydique, mais cette réaction n’est pas quantitative. Il faut donc un équilibre entre la quantité d'alcool à doser et le taux d’acide sulfanilique mis en réaction, car au cours de la saponification il peut se former outre le colorant diazoïque un corps à noyau phénolique à groupement chromophore, qui peut induire en erreur.
Il faut donc retenir que le dosage exact de l'alcool urinaire à l’aide de la méthode préconisée et à la cellule photoélectrique est possible seulement pour des urines contenant
entre 3,5 et 25 pour mille d’alcool. Au delà de ces concentrations limites il faudrait travailler avec des quantités d’urine plus grandes ou effectuer des dilutions appropriées, pour établir ensuite le résultat en tenant compte de ces modifications préalables.
L’hémoglobine du sang a été dosée en la transformant en hématine acide selon la technique de SAHLI-BüRKkER et d'AUTENRIETH. Nous avons au préalable préparé de l’oxyhématine selon la technique de Hamsik. Nous avons établi que ce corps retiré du sang humain de nos régions contient 0,055 gr. % de fer en moyenne, dosé par la méthode de FoxTÈs et THivOzrE. En admettant un poids moléculaire de 633 pour notre oxy-hématine, il faudrait donc une solution de 0,01 gr. d’'hématine pour cent pour préparer une solution renfermant la même quantité de fer que nos sangs humains, dont nous sommes parti. Basé sur ces constatations nous avons proposé l’emploi de l’hématine MERCK (P. M. — 650) pour effectuer la préparation de solutions étalons types, de conservation stable et inaltérable. Nous avons donné la technique détaillée pour préparer ces solutions témoins et nous avons pu déterminer qu’une solution contenant sensiblement 0,009 gr. pour cent d’hématine MERCK donne le même degré opacimétrique que le sang de sujets sains et normaux de notre région.
Si nous admettons un poids moléculaire de 650 pour l’hématine Merck (chlorhydrate), nous obtenons pour nos contrées la composition suivante du sang normal pour
l’homme:
HéMANER COR Ar tue 0,585 (650) ÉCRAN RE AUS: 0,0504 (56) Hémoglobines ce"... 15,0002 (166.669)
Nous voyons par conséquent qu’à l’aide de lhématine Merck facilement à obtenir et à composition stable il est facile de se préparer une solution standard d’hématine acide) celle-ci peut être une fois pour toutes étalonnée en comparaison avec 4 à 5 sangs d'hommes normaux pour être rame-
née à la valeur physiologique moyenne normale de la région, où on pratique les analyses et elle servira ensuite continuellement de témoin pour établir une courbe d’étalonnage soit pour le colorimètre d'AUTENRIETH-HELLIGE, soit pour la cellule photoélectrique.
Nous donnons les détails pour la technique du prélèvement et pour la préparation du sang. Notre méthode permet d'obtenir des résultats exacts et sensibles, répondant à toutes les exigences de la clinique. Ces résultats sont exprimés en valeurs absolues, c’est-à-dire corrigées selon les principes de BürKER et par conséquent toujours comparables et identiques d’un laboratoire à l’autre.
Pour les dosages de la cholestérolémie nous avons élaboré deux techniques personnelles en collaboration avec J. MEYER. Ces méthodes permettent de travailler avec 2 cc. de plasma ou de sérum. Nous effectuons une extraction alcoolique en milieu acidifié par l’acide phosphorique pour le dosage du cholestérol libre. Pour celui du cholestérol total nous épuisons à l’aide d’une solution éthéro-alcoolique en milieu alcalin. Les épuisements se font toujours à l’ébullition pendant 30 minutes à l’aide d’un appareil de distillation à reflux. Le dosage à la cellule photoélectrique s’effectue par la méthode colorimétrique de LIEBERMANN. La courbe d'étalonnage montre une précision dans les limites de 1,50 à 3,90 gr. de cholestérol pour 1000 ce. de solvant, si l’on met 2 ce. de liquide cholestérolifère à l’épreuve.
Les dosages de la bilirubinémie ont été réalisés par l'emploi de la méthode de THANNHAUSER et ANDERSEN. Nous donnons l'exposé de cette technique pour le dosage de la bilirubine des sérums normaux et pathologiques à diazo-réaction indirecte et à diazo-réaction directe. Pour l’établissement de la courbe d'étalonnage nous proposons l'emploi de la bilirubine «Roche», dont la solution chloroformique à » mgr. pour 100 est stable et se conserve bien à un endroit frais et en flacon bouché. La courbe établie à partir de dilutions progressives à la cellule photoélectrique donne des résultats précis pour des hyperbilirubinémies limitées entre
BU
8 et 1 mg. de bilirubine pour 1000 ec. de sang. La sensibilité est moins rigoureuse pour des taux de bilirubine entre 0,5 et 1 mg. pour 1000. Nous travaillons avec 2 ce. de sérum: dans les cas d’hyperbilirubinémie faible nous proposons l'emploi de 4 ec. de sérum et de diviser le résultat final par deux. La méthode proposée donne des résultats corrects, plus rigoureux que toutes les autres techniques habituellement recommandées pour les examens cliniques, seule l’analvse spectrophotométrique la dépasse en sensibilité.
Nous voyons donc en considérant l’ensemble de notre travail que l’emploi d’un colorimètre photo-électrique se justifie pleinement, car il répond entièrement aux trois qualités antérieurement énoncées et son installation sera rapidement amortie par le haut rendement en précision et en satisfaction et par la multiplicité de l’usage que permet un tel instrument.
Vu, Strasbourg, le 6 Juillet 1939 Le Président du Jury.
A. Sartory
Vu et approuvé, Strasbourg, le 6 Juillet 1939 Le Doyen
de la Faculté de Pharmacie:
A. Sartory
Vu et permis d'imprimer, Strasbourg, le 8 Juillet 1939.
Le Recteur de l'Académie de Strasbourg Président du Conseil de l'Université:
A. Zerracher
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