CHAPITRE VI ESSAIS DE CULTURE DES CHAMPIGNONS ENDOPHYTES

Il serait d’un grand intérêt, pour le sujet qui nous occupe, d'isoler en culture pure les Champignons de mycorhizes et d'appliquer dans toute leur rigueur, à l’étude expérimentale de la symbiose, les techniques pasteuriennes, ainsique Noël BERNARD a pu le faire dans le cas des Orchidées. Malheureusement la culture des endophytes se heurte à des difficultés considérables. Après avoir rappelé brièvement quelques-unes des tentatives des auteurs qui ont abordé ce problème et insisté sur Les résultats positifs obtenus par Noël BERNARD pour les Champignons des Orchidées et, plus récemment, par M. RAYNER pour celui des Calluna, j'exposerai dans ce chapitre les essais de culture de l’endophyte des Solanum que j'ai été amené à tenter.

42. Premières tentatives. — La de primitivement employée dans les recherches de cet ordre consistait à abandonner en milieu humide, ou sur des substratums nutritifs variés, des fragments ou des coupes de racines infestées, préalablement lavées à l’eau stérile. Les auteurs qui, à l’exemple de WanrLicx [42], ont eu recours à cette technique ont obtenu, avec une certaine constance, des Fusarium représentant les formes conidiennes de diverses espèces de Vectria ; ils ont généralement conclu de ces résultats que les Champignons de mycorhizes étaient des Fusarium.

M. GazLaup [17] a fait une critique serrée de ces expériences. ILa montré, d’une part, que les techniques employées étaient défectueuses et n’assuraient pas l’asepsie de la surface extérieure des racines: il a, d'autre part, obtenu des Fusarium

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à partir de racines ou d'organes divers non infestés, avec la même constance que lorsqu'il s'agissait de mycorhizes. Il a enfin tenté d’inoculer ces Champignons à des plantules aseptiques d’espèces variées et a constaté qu'ils ne pénétraient jamais les racines des plantules vigoureuses ; seules les plantules moribondes étaient envahies par le mycélium, qui pénétrait indistinctement tous les tissus, sans y donner aucune des formes caractéristiques des endophytes. Il conclut de ces résultats négatifs que les Fusarium ne sont pas les formes libres des endophytes.

Le même auteur a tenté l'emploi de méthodes d'isolement plus parfaites ; ayant semé en cellules de Van Tieghem, sur des milieux nutritifs variés, des coupes fines de racines infestées, il a constaté, par des examens microscopiques répétés, que le mycélium interne n’y subissait aucun changement ; les moisissures qui se développaient dans certains cas partaient toujours de la surface et n’étaient que des impuretés banales. Dans une autre série d'expériences, il a tenté l’inoculation à des plantules aseptiques des divers Champignons obtenus par les méthodes d'extraction directe. Il a pu ainsi obtenir des infestations artificielles de thalles d’'Hépatiques ou de voiles d’Orchidées, mais, dans tous ces cas, le mycélium pénétrait les cellules en droite ligne, sans former les pelotons, les vésicules et les arbuscules caractéristiques des Champignons de mycorhizes. En l’absence du critérium de l’inoculation, qui autorise seul à conclure à la spécificité des germes isolés, M. GaLLauD admet que les divers Champignons qu'il a expérimentés n'ont rien de commun avec les endophytes.

43. Les endophytes des Orchidées. — Noël BERNARD a résolu le problème en réalisant la culture pure des Champignons des Orchidées. Ayant semé sur de la gélose au salep des plantules provenant de semis faits en serre, ou des fragments découpés dans des racines contaminées, il obtint le développement de Champignons variés et constata que l’un d'eux, introduit dans des semis aseptiques de graines d’Orchidées, les faisait germer régulièrement [4]. Les plantules provenant de la germination de ces graines présentaient:

d’ailleurs le mode d’infestation caractéristique. La preuve était ainsi faite de l'identité de ce mycélium avec l’endophyte. Par la suite, Noël BERNARD perfectionna ses méthodes d’isolement [5]; il réussit à extraire sous le microscope, au moyen d'une fine aiguille de platine stérilisée, les pelotons intra cellulaires qui infestent les racines et les embryons d'Orchidées, et à les transporter aseptiquement sur les milieux de culture appropriés. Dans ces conditions, les pelotons se développent ét donnent d'emblée une culture pure de lendophyte.

Les Champignons ainsi obtenus, caractérisés par leurs hyphes cloisonnées, rarement pelotonnées dans les cultures; et par le développement tardif de filaments moniliformes ramifiés, à articles courts et renflés, ressemblent étroitement au AS Solani Khün (— ne rolacea Tulasne).

Cette ressemblance a permis à Noël Bernarp de les rapporter au genre /hizoctonia. Il en a décrit trois espèces : l’une, le Rhizoctonia repens, très répandue, est commune à un grand nombre d’Orchidées ; les deux autres, qui se distinguent essentiellement de la première par la production de sclérotes, sont spéciales à un petit nombre de genres : ce sont le Rhizoctonta mucoroides, commensal des Phalænopsis et des Vanda, et le Rhizoctonia lanuginosa, commensal des Odontoglossum.

Ces résultats ont été pleinement confirmés par les recherches de M. BurGerr [11, 12], qui a isolé les mêmes Champignons d’un grand nombre d’Orchidées tropicales et indigènes. Mais, à la différence de Noël BERNARD, M. BURGEFF ne se préoccupe pas de leurs affinités ; il les décrit sous le nom générique d’Orcheomyces et adopte, comme nom spécifique de chacun des types isolés, le nom d’espèce de l’Orchidée qui l’hébergeait.

Tout récemment, MM. CosranTin et Durour [14] ont apporté une confirmation nouvelle des travaux de Noël BEr- NARD enisolant le Champignon encore inconnu d’une Orchidée acelimatée dans nos contrées, le Goodyera repens. En semant les pelotons extraits des racines de cette plante sur des milieux nutritifs variés, ces auteurs ont obtenu une grande proportion de cultures pures d’un Rhizoctonia appartenant à une

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espèce nouvelle, qu’ils décrivent sous le nom de Rhzzoctonia Goodyeræ repentis. | | :

La découverte de Noël BERNARD a été féconde en résultats ; elle a fourni le moyen d’appliquer à l’étude de la symbiose chez les Orchidées les méthodes les plus précises et de varier largement les conditions expérimentales. En révélant chez les Rhizoctones des variations d'activité comparables aux variations de virulence des Bactéries, elle a permis de répéter, dans le cas des Orchidées, les expériences classiques par lesquelles PAsTEUR a établi les lois deil’infection bactérienne chez les animaux. |

44. L'endophyte du « Calluna vulgaris ». — Les endophytes d’Orchidées sont restés les seuls que l’on sût obtenir en cultures pures, jusqu’au jour où M. RAYNER [38, 39] réussit à cultiver le Champignon symbiotique du Calluna vulgaris. On sait que la symbiose n’est pas moins constante dans le groupe des Éricacées que dans telui des Orchidées. M. RAYNER essaya d’abord d'isoler le Champignon des Bruyères en semant sur des milieux nutritifs convenables des fragments de racines infestées ; il ne réussit par ce moyen qu’à cultiver les moisissures banales que ces racines portent à leur surface. Mais, par une circonstance heureuse, le commensal du Calluna ne reste pas strictement localisé dans les racines ; il envahit les tiges et pénètre jusque dans les carpelles, si bien qu’on le retrouve à l’état de pureté dans la cavité des fruits mûrs et dans le tégument des graines. On peut de là le transporter aseptiquement sur des milieux gélosés additionnés d'extrait de Calluna et obtenir son développement en culture pure. Le Champignon ainsi isolé est un Phoma; M. RAYNER a vérifié qu'il s'agissait bien de l’endophyte spécifique en l’inoculant à des semis aseptiques de graines de Calluna vulgaris et en reproduisant ainsi l'infestation caractéristique.

45. L'endophyte des « Solanum». —Si la question de l’isolement et de l'identification des Champignons de mycorhizes était résolue ‘pour les Orchidées et les Bruyères, elle restait entière pour les autres groupes de végétaux, qui, en

nombre immense, sont soumis à la symbiose. Aussi, lorsque Noël BERNARD, à la suite de ses recherches sur les Orchidées, reprenait l'étude de la symbiose chez les Solanum, son pre- .mier souei fut-il de tenter l’isolement de l’endophyte de ces plantes [9].

Les semis, sur gélose au salep ou au jus de Pomme de terre, de fragments infestés de racines de Douce-Amère, lui ont fourni, à plusieurs reprises, parmi des moisissures sans intérêt, une Mucorinée qui a retenu son attention par ses -caractères morphologiques et par l’action favorisante qu’elle ‘exerçait sur la germination des graines de Solanum Dulcamara. Le Champignon dont il s’agit est constitué par des filaments rampants, vésiculeux, formant un voile épais ; plus tard, il développe des sporanges, qui parfois avortent, formant alors de véritables vésicules qui germent en donnant directement du mycélium. Enfin, les filaments aériens qui retombent sur le verre humide ou la gélose donnent en abondance des rameaux ramifiés, grêles, rappelant les arbuscules.

L'étude de ce Champignon a été interrompue avant que l’auteur en ait pu tenter l’inoculation à des plantules de Solanum. Aussi, en l’absence du critérium fourni par l’infestation expérimentale, Noël BERNARD s’abstient-il de conclure à son identité avec l’endophyte.

46. Le « Mucor Solani». — J’ai tenté d'isoler à nouveau cette Mucorinée à partir de racines infestées de Solanum. Malheureusement la technique élégante employée par Noël BERNARD pour l'isolement des Rhizoctones s’est montrée inapplicable

. Si l’on peut, au prix d’une certaine dextérité, extraire sous le microscope les pelotons bien distincts qui occupent les cellules des volumineuses racines d’Orchidées, il n’en est pas de même des arbuscules, qui forment dans les plus fines radicelles de la Douce-Amère et de la Pomme de terre un chevelu inextricable. Il est possible, néanmoins, d'éliminer les saprophytes superficiels au moyen d’un brossage mécanique des racines dans du sable humide stérilisé. Des coupes, pratiquées avec des instruments flambés dans des racines infestées ainsi traitées, ont été transportées sur des milieux

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nutritifs gélosés (1). Elles y sont restées indéfiniment stériles, et le mycélium spécifique qu’elles renfermaient ne s’est pas plus développé que les moisissures banales (2).

Ces essais infructueux suggéraient que les arbuscules, ainsi que l’avait prévu Noël BERNARD, représentaient des formes beaucoup plus étroitement adaptées à la vie parasitaire que les.pelotons des Orchidées, et qu'ils étaient sans doute incapables de se développer à l’état autonome. Mieux valait donc, malgré les risques de contamination par la flore saprophyte superficielle, tenter de bouturer le mycélium extérieur pris au moment de sa pénétration dans les racines.

A cet effet, des racines infestées de plantules de Solanum Dulcarama ont été lavées au pinceau dans plusieurs bains successifs d'acide tartrique à 0,5 p. 100, puis découpées en menus fragments qui ont été transportés sur des tranches de Pommes de terre stérilisées, enfermées dans des tubes de Roux. Les fragments semés ne tardent pas être envahis par une multitude de Bactéries et de moisissures. Au cours de très nombreux essais, j'ai isolé, à trois reprises, parmi ces impuretés banales, un Mucor présentant le caractère du Champignon décrit par Noël BERNARD. Transporté sur des milieux gélosés, ce Mucor donne d’abord des cultures incluses dans la gélose (3), puis développe des filaments aériens, dressés, portant des sporanges. Les gros troncs mycéliens inclus dans le substratum donnent naissance à des arbuscules et à des vésicules semblables à ceux que l’on observe dans les mycorhizes. Les arbuscules, portés latéralement par les

(1) Le milieu employé pour cet essai était une gélose additionnée d’un extrait obtenu par macération dans l’eau à 80° de fragments de tubercules de Pomme. de terre. Avant la répartition dans les tubes de gélose, l'extrait était stérilisé par filtration sur porcelaine.

(2) J'ai pu m’assurer de l’inertie complète des endophytes intracellulaires en semant en cellule de Van Tieghem de petits groupes de cellules infestées découpées aseptiquement, sous le microscope, dans des thalles de Fegatellæ conica. Les fragments semés ont été dessinés à la chambre claire, et des examens répétés chaque jour pendant un mois ont montré que les pelotons mycéliens ne subissaient pas le moindre changement.

(3) La gélose additionnée d’une décoction de tubercules d’ robe eue permet au mieux de mettre en évidence les caractères morphologiques ee plus intéressants de ce Champignon,

filaments principaux, sont formés de rameaux d’une ténuité extrême, ramifiés dichotomiquement et formant des enchevêtrements complexes (PI IX, fig. 1). Les vésicules sont des Sporanges avortés, capables de germer en filaments mycéliens.

Ce Champignon, qui paraît appartenir à une espèce nouvelle et que je désignerai sous le nom de Mucor Solani, répond à la diagnose suivante :

Mucor Solani. — Sporangiophores dressés, le plus souvent non ramifiés (exceptionnellement ramifiés près du sommet). Gazon de 2 à 4 centimètres de haut, serré et fin, blanc cotonneux. Sporanges sphériques de 36 y de diamètre moyen (dimensions extrêmes : 30 à 57u), ou subsphériques (25 X 244 à 45 X 424), gris ou brun jaunâtre, Membrane laissant une collerette. Columelles sus-jacentes, sphériques ou légèrement aplaties à la base, de 16 y, 5 de diamètre. Spores lisses ellipsoïdes, rarement rondes, ordinairement de 46,5 X 3 y (dimensions extrêmes : 3 X 3uà7 x 5).

Zygospores inconnues.

Le Mucor Solani est une espèce voisine du Mucor hiemalis Wehmer ; il en diffère par ses columelles sus-jacentes et par la forme de ses spores, qui sont moins allongées.

47. Inoculations expérimentales. — Dans les mois qui ont suivi son isolement, ce Mucor a été inoculé par piqûre au voisinage de plantules aseptiques de Pomme de terre, développéès soit dans de la terre stérilisée, soit dans des solutions nutritives gélosées. Les radicelles exercent une attraction manifeste sur le Champignon qui, alors qu’il croît faiblement dans la profondeur du milieu environnant, prend autour d'elles un développement exubérant. Elles apparaissent en coupe entourée d’un épais réseau mycélien qui forme une sorte de mycorhize ectotrophe. Au contact de la racine, le mycélium différencie d'énormes dilatations vésiculeuses enkystées, qui rappellent de très près les formes de pénétration de l’endophyte. Ces vésicules sont découpées par des incisures en digitations dirigées vers la racine (PI. IX, fig. 2); plus tard, il se développe des disques adhésifs appliqués contre la paroi de l’assise subéreuse, qu'ils invaginent au moyen de bourgeons en forme de coin (PI IX, fig. 3).

À un stade ultérieur, le mycélium pénètre dans la racine, et, au lieu de croître en droite ligne à travers tous les tissus, à la manière des impuretés banales, il se localise dans les cellules corticales, où il forme des pelotons très comparables à ceux de l’endophyte (PI. IX, fig. 4). Il développe même des

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ébauches d’arbuscules (PL IX, fig. 5) et donne naissance à des vésicules intracellulaires parfaitement caractérisées (PL IX, fig. 6). Par ses figures de pénétration très particu- Jières et par son mode de développement intracellulaire, ce Champignon ressemble donc à l’endophyte des Solanum : des expériences plus complètes sont encore nécessaires pour décider s’il doit lui être identifié; mais il existe déjà de fortes présomptions en faveur de cette identité.