COLORAT/ON SIMPLE

La coloration simple d'un frottis ou d'une lamelle de sang peut être obtenue à l'aide d'une des solutions colorantes indiquées au chapitre vin.

La solution la plus généralement employée est la thionine phéniquée (p. 139). On procédera de la façon suivante :

1° La lamelle étant tenue avec la pince de Cornet ou de Debrandt,

verser sur sa face enduile, de manière à la recouvrir complètement, une grosse goutte de thionine phéniquée.

Laisser en contact trente à soixante secondes.

2° Laver à l'eau distillée.

3° Porter la lamelle sur une lame, la lace enduite regardant la lame. Examiner dans l'eau (Obj. 1/12; Oc. 11).

4° Si la préparation est bonne et qu'on veuille la conserver, sécher la lamelle à l'air libre ou à une douce chaleur, puis monter dans le baume du Canada.

En résumé :

Colorer, laver à Veau, sécher, monter dans le baume.

On opérerait d'une façon analogue pour la coloration des frottis sur lame. La lame étant tenue avec la main gauche ou la pince de Debrandt, verser sur le frottis une grosse goutte de solution colorante; lavera l'eau; sécher; monter en déposant une goutte de baume sur le frottis, puis en recouvrant d'une lamelle.

On peut se dispenser de recouvrir le frottis avec une lamelle. Après avoir lavé à l'eau, on sèche, puis on dépose sur le frottis une goutte d'huile de cèdre et on examine directement avec l'objectif à immersion sans interposer de lamelle.

Outre la thionine phéniquée, on emploie, dans certains cas, les violets phéniqués, les bleus de Kùhne, de Lôffler, de Roux, la

Particularités de l'examen du sang. — Dans la coloration des lamelles de sang, on peut se débarrasser du fond et éviter d'avoir

fuchsine de Ziehl diluée, etc.

En étudiant chaque microbe en particulier, nous indiquerons les solutions colorantes qui conviennent le mieux à la recherche et à l'étude des différentes espèces.

Fig. 131. — Charbon symptomatique. — Frottis de muscle. Coloration simple (fuchsine de Ziehl diluée) (Reich. Obj., 1/12 imm.;. Oc. II).

La méthode de la coloration simple a l'inconvénient de donner une même teinte au fond etaux microbes (fig. 131), ce qui rend souvent ceux-ci peu visibles, surtout quand ils sont peu nombreux et que le frottis est épais. Pour remédier à cet inconvénient, on a recours aux méthodes de différenciation.

HUMEURS ET PULPES

recours à la différenciation. Dans les globules rouges, l'hémoglobine seule fixe les matières colorantes : en dissolvant préalablement cette hémoglobine on a, après action de la solution colorante, un fond incolore sur lequel se détachent vigoureusement les microbes. On obtient ce résultat avec un des deux procédés suivants :

a. Procédé de Gunther. — 1° Déposer sur la lamelle, desséchée à une douce chaleur et non passée à la flamme, une forte goutte d'eau acétisée à 5 p. 100. Laisser en contact pendant trente secondes.

2» Exposer la lamelle pendant quelques secondes aux vapeurs d'ammoniaque.

3° Laver à l'eau.

4° Colorer, laver, sécher, monter.

6. Procédé de Vincent. — 1° Déposer sur la lamelle desséchée à une douce chaleur et non flambée une goutte du liquide suivant :

Solution aqueuse d'acide phénique à 5 p. 100. . . . 6 centimètres cubes.

— — saturée de sel marin 30 —

Glycérine pure 30 —

Laisser en contact une à deux minutes.

2° Laver à l'eau, colorer, etc.

Coloration simple. — Enfin, la coloration simple au bleu de Loffler permet d'obtenir de belles préparations de sang; elle donne immédiatement une différenciation nette en colorant les globules rouges en vert pâle et les microbes en bleu foncé.

//. - DIFFÉRENCIA TION.

La double coloration d'une préparation est aisément obtenue quand on se trouve en présence de microbes colorables par là méthode de Gram ; mais quand la bactérie à étudier ne prend pas le Gram, il faut avoir recours à des procédés plus délicats et qui donnent souvent des résultats moins satisfaisants. Enfin l'étude et la recherche de certains microbes, tels que les Bacilles de la tuberculose et de la lèpre, exigent l'emploi de méthodes de coloration spéciales dont le type est la méthode d'Ehrlich et que nous étudierons dans le chapitre consacré au Bacille de Koch.

A. Méthode de Gram. — La méthode décrite par Gram a subi de nombreuses modifications dont nous passerons en revue les plus importantes; mais nous tenons à mettre en garde le débutant contre les dangers qu'il y a à utiliser un trop grand nombre de procédés; on s'expose ainsi à des erreurs et à des insuccès qui découragent vite même les plus opiniâtres ; il est indispensable de posséder à fond un procédé que Ton puisse employer en toute sécurité : nous recommandons spécialement celui que nous décrivons en b.

o. Procédé de Gram. — 1° Déposer sur la face enduite de la lame ou de la lamelle une grosse goutte de violet de gentiane aniline (p. 140). Laisser en contact deux à quatre minutes.

2° Rejeter la solution colorante et la remplacer, sans lavage préalable, par quelques gouttes de la solution iodée de Gram. Laisser en contact une à deux minutes, jusqu'à ce que la préparation prenne une teinte noirâtre.

3° Laver à l'eau distillée.

4° Décolorer avec l'alcool absolu ' comme il a été dit page 445, jusqu'à obtention d'une teinte gris pâle. 5° Laver à l'eau distillée.

6° Déposer sur la préparation une forte goutte de solution aqueuse d'éosine :

Êosine soluble à l'oau 1 gramme.

Jiau distillée 100 centimètres cubes.

Laisser en contact une à deux minutes.

7° Laver, sécher, monter dans le baume.

Avant le montage la préparation peut être examinée dans l'eau ; on pourra ensuite l'éclaircir, après dessiccation, par l'essence de girofles et le xylol.

Dans la préparation ainsi obtenue le fond est coloré en rose, les

microbes en violet. La décoloration doit être poussée jusqu'à ce que le fond ne présente aucune teinte violette (fig. 132).

Les lamelles de sang, traitées par la méthode de Gram, donnent de très jolies préparations. Quand on observe du sang d'oiseau, on ne laisse pas agir l'alcool jusqu'à décoloration complète du fond; on s'arrête quand les noyaux seuls des globules rouges restent violets ; après l'action de l'éosine, le protoplasma des hématies est rose tandis que leur noyau et les microbes sont colorés en violet.

b. Procédé recommandé. — Nous avons insisté, au chapitre mu, sur les inconvénients de l'emploi de la solution de violet de gentiane aniliné ; on lui préférera le krystall violet phéniqué.

Fig. 132. — Frottis préparé avec du mucus buccal. — Bactéries diverses. — Coloration par la méthode de Gram ; fond teinté à l'éosine (Reich. Obj. 1/12 imm.; Oc. II).

HUMEURS ET PULPES

1° Déposer sur la face enduite de la lame ou de la lamelle une grosse goutte de krystall violet phéniqué (p. 139). Laisser en contact trente à cinquante secondes.

2° Remplacer, sans lavage préalable, la solution colorante par la liqueur iodée de Gram ; laisser en contact une à deux minutes.

3° Laver à l'eau distillée.

4° Décolorer par l'alcool absolu.

On peut accélérer la décoloration en lavant d'abord à l'alcool absolu, puis à l'huile d'aniline et en terminant par l'alcool absolu. L'huile d'aniline est un décolorant très énergique, très brutal, et ne doit rester que quelques secondes en contact avec la préparation.

5° Laver à l'eau.

6° Colorer le fond à l'éosine aqueuse, comme plus haut. 7° Laver; sécher et monter après éclaircissement facultatif à . essence de girofles et au xylol.

c. Procédé de Nicolle. — 1° Colorer au violet de gentiane phéniqué (p. 139) pendant dix à vingt secondes.

2° Remplacer, sans lavage préalable, la solution colorante par le liquide de Gram modifié :

Iode 1 gramme.

Iodure de potassium 2 grammes.

Eau distillée 200 centimètres cubos.

Laisser en contact quatre à six secondes en renouvelant une ou deux fois le liquide à la surface de la préparation. 3° Laver à l'eau distillée.

4° Décolorer par l'alcool-acétone au tiers.

Alcool absolu 2 parties.

Acétone 1 partie.

5° Laver à l'eau distillée.

6° Colorer rapidement le fond avec la solution alcoolique d'éosine:

Solution saturée d'éosine dans l'alcool à 95". 1 volume. Alcool à 95° 2 volumes.

7° Laver, sécher et monter dans le baume.

d. Procédé de Mérieux. — 1° Colorer par le violet phéniqué comme en c.

2° Faire agir pendant quatre à six secondes, en renouvelant une à deux fois le liquide, la solution suivante :

Iode 1 gramme.

Iodure de potassium 2 grammes.

Solution saturée d'éosine dans l'alcool à 50° 20 centimètres cubes.

Eau distillée 200 —

3° Laver à l'eau distillée.

i° Décolorer par l'alcool-acélone au sixième :

Alcool absolu Acétone

volumes.

1 volume.

5° Laver, sécher et monter dans le baume.

Ce procédé ne nous a jamais donné de préparations aussi nettes que celles que nous obtenons par les procédés a, b, c.

e. Procédé de Kùhne. — ifl Colorer pendant plusieurs minutes avec le bleu phéniqué (p. 139) ou le bleu ammoniacal (p. 140).

2<> Laver à l'eau distillée.

3° Faire agir la solution iodée de Gram pendant deux à trois minutes. 4° Laver à l'eau distillée.

5° Décolorer avec une solution saturée de fluorescéine dans l'alcool absolu.

6° Quand la teinte bleue du fond a disparu, laver à l'alcool absolu, puis à l'essence de girofles, au xylol, et monter dans le baume.

Les bactéries apparaissent en violet sur le fond légèrement teinté par la fluorescéine.

B. Méthode de Claudius. — La méthode de Claudius, telle qu'elle est décrite page 146, s'applique à la coloration des frottis.

C. Méthodes pour les microbes se décolorant par le Gram. — a. Sang. — Pour la double coloration des lamelles de sang contenant des microbes ne prenant pas le Gram, on utilise la propriété que possèdent les hématies de fixer énergiquement l eosine, tandis que les bactéries ont une électivité marquée pour les couleurs basiques d'aniline.

a. Procédé recommandé (Laveran). - 1° Déposer sur la lamelle une forte goutte de la solution aqueuse d'éosine (p. 216). Laisser en contact environ une minute.

2° Remplacer l'éosine par une solution aqueuse saturée de bleu de méthylène; laisser agir environ trente secondes.

3° Laver à l'eau distillée.

4° Sécher; monter dans le baume.

Les hématies sont colorées en rose ; les bactéries et les noyaux des globules blancs, en bleu. Avec le sang d'oiseau les noyaux des hématies sont également bleus.

6. Procédé de Chenzinsky. — 1° Déposer la lamelle, la face enduite regardant en bas, dans un petit cristallisoir à couvercle rodé contenant un peu'de la solution suivante, récemment préparée :

Solution aqueuse saturée de bleu de mélbylône. . -10 centimètres cubes. Solution à 1/2 p. 100 d'éosine soluble à l'eau dans

l'alcool à 70» 20 —

Fau distillée 40 ~

HUMEURS ET PULPES. 219

Porter le cristallisoir dans l'étuve à 37» ; faire durer le contact trois à six heures.

2° Au sortir du bain colorant, laver la lamelle dans l'eau distillée, sécher et monter dans le baume.

c. Procédé de Romanowsky. — 1° Après dessiccation et fixation dans la flamme, porter la lamelle, pendant environ une heure, dans l'étuve sèche à i05°-110°.

2° Plonger la lamelle dans le bain suivant, récemment préparé :

Solution aqueuse saturée de bleu de méthylène 2 parties.

— — d'éosine à 1 p. 100 5 —

Laisser en contact pendant une à dix heures.

3° Laver à l'eau distillée.

4° Sécher, monter dans le baume.

p. Frottis, lamelles de pus, etc. — a. Procédé de Kuhne. — 1° Colorer pendant quelques minutes avec le bleu phéniqué (p. 139). • 2° Laver à l'eau.

3° Laver à l'acide chlorhydrique dilué jusqu'à obtention d'une teinte bleu pâle (temps délicat, de durée variable suivant l'épaisseur du frottis).

Acide chlorhydrique dilué.

Acide chlorhydrique pur 1 centimètre cube.

Eau distillée 1 000 centimètres cubes.

4° Enlever de suite l'excès d'acide par un lavage avec la solution lithinée :

Solution aq. saturée de carbonate de lilhine 5 centimètres cubes.

Eau distillée 100 —

5° Laver à grande eau.

6° Sécher; éclaircir par l'essence de girofles, le xylol et monter dans le baume.

Le fond est coloré en bleu très pâle, les microbes en bleu foncé. b. Procédé de Nicolle. — Procédé recommandé. — 1° Colorer pendant quelques minutes avec le bleu phéniqué. 2° Laver à l'eau.

3° Faire agir pendant deux à trois secondes quelques gouttes de la solution suivante :

Tanin pur 10 grammes.

Eau distillée 100 —

4° Laver à l'eau.

5° Traiter rapidement par l'alcool absolu, l'essence de girofles et le xylol ; monter dans le baume.

Le fond est bleu violacé très pâle, les bacilles sont colorés en bleu foncé.

Article II. — COUPES.

La coloration des microbes dans les tissus nécessite la préparation de coupes très lines. Les coupes pratiquées à la main sont inutilisables pour les recherches bactériologiques, et l'on doit recourir aux microtomes mécaniques dont l'emploi exige Vinclusion préalable de l'objet à couper.

Les inclusions à la gomme, à la cire, au savon, à la celloïdine et au collodion, employées en histologie, ne permettent pas d'obtenir des coupes assez minces. Restent deux procédés : la congélation et l'inclusion à la paraffine.

Nous ne décrirons que ce dernier procédé, la congélation étant rarement usitée et donnant des résultats peu satisfaisants.

§ le. — INSTRUMENTATION.

Microtomes. — La plupart des microtomes mécaniques conviennent à la confection des coupes bactériologiques ; le modèle Rocking, construit par Dumaige, celui de Malassez, construit par Verick, ceux de Miehe, de Minot, etc., sont ordinairement utilisés.

Nous n'insisterons pas sur le fonctionnement de ces divers appareils; il suftit d'en avoir un modèle entre les mains pour se rendre compte de son mécanisme.

Rappelons que les microtomes, véritables instruments de précision, doivent être maniés avec le plus grand soin ; l'appareil sera nettoyé toutes les fois qu'on en aura fait usage et il sera conservé à l'abri des poussières et de l'humidité sous une cloche de verre ou dans une caisse en bois.

Rasoirs. — Un bon rasoir est indispensable pour la réussite des coupes. Le rasoir doit avoir une face plane (face inférieure) ; il aura assez de tranchant pour couper un cheveu maintenu entre le pouce et l'index ou un poil du, dos de la main.

Avant chaque opération, le rasoir doit être passé sur le cuir (d'abord sur la face munie de pâte, puis sur la face sèche) en observant les règles ordinaires : le rasoir est repassé, le dos en avant et toujours en allant du talon vers l'extrémité de la lame; on passe alternativement chaque face de la lame en tournant toujours sur le dos.

Il est bon également de savoir passer le rasoir sur la pierre; on évitera aussi d'envoyer fréquemment l'instrument au coutelier et

COUPES

l'on s'en trouvera beaucoup mieux. Le repassage à la pierre doit être pratiqué le tranchant en avant et en allant toujours du talon vers l'extrémité ; la pierre ne sera pas huilée, mais mouillée avec de l'eau simple ou mieux avec le liquide suivant :

Eau distillée 30 centimètres cubes.

Alcool à 93° 50 —

Glycérine 50 —

Après chaque opération le rasoir sera essuyé avec un linge fin, passé sur le cuir et replacé dans son étui.

Pour couper les objets inclus dans la paraffine, la lame du rasoir doit être sèche et aborder obliquement l'objet à couper. Les coupes sont recueillies sur le rasoir avec un fin pinceau ou un morceau de papier de soie, jamais avec un corps dur (aiguille, scalpel) qui pourrait endommager le tranchant de l'instrument.

§ 2. — INCLUSIONS A LA PARAFFINE.

A. Procédé à l'éther. — Procédé recommandé. — Les pièces à couper, fixées et durcies suivant une des méthodes exposées au chapitre précédent, sont, au sortir de l'alcool absolu, traitées de la façon suivante :

1° Immersion dans l'alcool-éther pendant vingt-quatre heures;

2° Immersion dans l'éther pendant douze à vingt-quatre heures ;

3° Immersion pendant vingt-quatre heures, dans l'étuve à 37°, dans de l'éther saturé de paraffine molle (fusible à 43°) ;

4° Immersion pendant douze à vingt-quatre heures dans de la paraffine molle liquéfiée, dans l'étuve à 45°.

Ces différentes immersions seront faites dans de petits flacons, à farge ouverture, bien bouchés; au sortir d'un bain l'objet à inclure est immédiatement plongé dans le suivant. La paraffine moite doit se maintenir absolument liquide à 45°; on trouve aisément cette paraffine dans le commerce.

5° Au sortir de l'étuve, les pièces sont retirées de la paraffine avant que celle-ci ne soit solidifiée : on les laisse refroidir à l'air et quand elles sont devenues dures on les enrobe de la façon suivante :

On choisit un bouchon cylindrique entrant aisément dans la pince du microtome. Autour du bouchon on enroule une bandelette de papier filtre maintenue par une épingle fixée dans le liège, de manière à déterminer un petit cylindre creux de 2 à 3 centimètres de hauteur et dont le fond est constitué par la face supérieure du bouchon il est bon d'avoir, au préalable, pratiqué, avec un scalpel, quelques cannelures sur cette face du bouchon pour en

augmenter l'adhérence avec la paraffine. Avec un pinceau on huile la face interne de la bandelette de papier en évitant «le porter de l'huile sur le liège qui constitue le fond du cylindre.

La pièce à couper étant maintenue en bonne orientation dans le moule, à l'aide d'une aiguille emmanchée, on verse autour d'elle de la paraffine dure (fusible à 52°-!ii0) fondue dans une capsule en porcelaine et qu'on a laissée refroidir jusqu'à formation d'une pellicule à la surface ; on remplit le moule de paraffine en ayant soin que cette substance dépasse de plusieurs millimètres en bauteur l'objet à inclure, à cause delà rétraction qu'elle subit en se solidifiant.

Dès que la paraffine commence à se solidifier, on retire l'aiguille qui maintenait la pièce et on abandonne le moule jusqu'à complet refroidissement. Lorsque la solidification de la paraffine est complète, on enlève l'épingle et on déroule la bande de papier ; on obtient ainsi, adhérent au bouchon, un cylindre de paraffine dans lequel est incluse la pièce à couper. Après que la surface de la paraffine a été égalisée avec un scalpel, on fixe le bouchon dans la pince du microtome et on peut pratiquer les coupes.

G. Procédé au xylol. — 1° Au sortir de l'alcool absolu les pièces sont portées dans le xylol pendant une dizaine d'heures.

2° Les pièces sont ensuite maintenues pendant six à douze heures dans une solution saturée de paraffine molle dans le xylol, à la température de 37°.

3° Immerger pendant le même temps la pièce dans la paraffine molle, dans l'étuve à 45°.

4° Au sortir de la paraffine molle la pièce est montée, comme nous venons de l'exposer, dans la paraffine dure.