PREPARA TION DE LA TOXINE

Conditions de formation. — La toxine est obtenue en cultivant un bacille virulent au contact de l'air.

A. — Le bacille employé doit avoir subi l'épreuve de l'inoculation : un bacille favorable tue le cobaye de 300-400 grammes en vingtquatre ou trente-six heures, à la dose d'un centimètre cube de culture en bouillon injecté sous la peau. Un bacille très virulent peut ne pas produire une toxine active, aussi est-il bon de commencer par éprouver le pouvoir toxigène du bacille qu'on se propose d'employer pour la production en grand de la toxine.

Pour conserver un Bacille diphtérique toxigène, on l'ensemence dans des

tubes de bouillon de Martin. Après séjour d'une semaine à l'élu vo à •'i30-35o, les tubes sont retirés de l'étuve et places à l'abri de la lumière. Les vieilles culturéB ainsi conservées, rajeunies par deux ensemencements successifs, donnent un bacille u-ùs toxigène,

B. — La production do la toxine est liée à la composition et surtout à la réaction du milieu de culture.

Nous avons dit que, sous l'influence du développement du Bacille diphtérique, le bouillon primitivement alcalin devient acide pendant les premiers jours de la culture, puis redevient alcalin par la suite. La toxine se forme au moment où l'acidité diminue, son activité augmente en même temps que l'alcalinité du milieu, et d'autant plus vite que le bouillon devient plus rapidement alcalin ; quand on empêche l'acidité de se produire, la toxine se forme plus rapidement et en plus grande quantité.

Aussi a-t-on cherché le moyen de diminuer ou de supprimer la période d'acidité ; plusieurs solutions ont été proposées. Houx, Yersin et Martin ont diminué la durée de la période d'acidité en faisant la culture en présence d'un courant d'air ; leur procédé a Jongtemps été employé pour la préparation en grand des toxines.

Les sucres (glucose, lévulose, saccharose, glycérine, galactose) favorisant la production de l'acidité, de nombreux savants ont cherché à les éliminer dans les milieux de culture : Nicolle a obtenu une bonne toxine en employant de la viande fraîche où le glycogène n'est pas encore transformé en glucose (le glycogène ne favorise pas l'acidité) ; Spronck, au contraire, a proposé l'emploi de viande fermentée dans laquelle les sucres ont disparu ; Park et Williams ont cultivé le bacille dans du bouillon préalablement alcalinisé par la soude; Macé, dans du bouillon additionné de carbonate de chaux.

Tous ces procédés sont inférieurs au mode de culture indiqué par Martin ; cet auteur a trouvé un milieu dans lequel la période acide ne se produit pas et qui donne des cultures extrêmement toxiques.

Procédé de Roux et Martin. — La culture est faite en présence d'un courant d'air. Pour cela on utilise des ballons de Fernbach légèrement modifiés (fig. 197). Chaque ballon reçoit 400 à î>00 centimètres cubes de bouillon de veau qui ne doivent former qu'une couche de 2 à 3 centimètres d'épaisseur. On place un bouchon d'ouate dans la tubulure latérale D. Le ballon est stérilisé à l'autoclave ; après refroidissement, on ensemence par la tubulure supérieure et on porte à l'étuve à 37°.

Lorsque le développement est bien commencé, que le bouillon est trouble, c'est-à-dire vers la vingt-quatrième heure, on organise le dispositif permettant de faire passer un courant d'air à la surface de

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la culture. Pour cela, on place sur la tubulure supérieure, au-dessus du tampon d'ouate, un bouchon de caoutchouc portant un tube qui relie le ballon à un flacon barboteur A contenant un peu d'eau ; d'autre part, on relie, par un tube de caoutchouc, la tubulure latérale D à la trompe à eau ; dès que celle-ci est mise en fonctionnement, l'air appelé dans le ballon traverse le flacon barboteur, s'y humidifie ol vienl lécher la surface de la culture; avec une pince de Mohr

Fig. 197. — Dispositif pour la préparation de la toxine diphtérique.

placée sur le tube qui relie le ballon au barboteur, on règle aisément le débit du courant d'air de sorte que les bulles crèvent continuellement mais non tumultueusement à la surface du liquide du barboteur (1).

Pour préparer de grandes quantités de toxine, on dispose plusieurs ballons identiques ; il serait simple de relier la tubulure supérieure du premier ballon à la tubulure latérale du second, dont la tubulure supérieure ellemême serait reliée à la tubulure latérale du troisième, etc., la tubulure latérale du premier ballon étant reliée à la trompe. Mais l'expérience montre qu'il est préférable d'utiliser une rampe de cuivre reliée à la trompe et portant autant d'ajutages qu'il existe de ballons. Chaque système constitué par un ballon et son barboteur est relié à un des ajutages.

Au bout de trois à quatre semaines, la culture est suffisamment riche en toxine; sur le fond des vases, on voit un dépôt de microbes et à la surface un voile formé par les bacilles plus jeunes ; la réaction est fortement alcaline.

La culture doit alors être filtrée sur la bougie Chamberland ; celte Qltration sera opérée à l'aide d'un des dispositifs décrits pages 19 et 21. Le filtrat tue le cobaye adulte à la dose de 1 /10e decentimètrecube.

. (I) Il est indispensable de disposer un barboteur pour humidifier le courant d'air, sans quoi li' bouillon de culture s'évaporerait rapidement.

Besson. — Tecltn. ynicrob., 2' édil. 25

Procédé de Martin. — Ce procédé supprime l'obligation du courant d'air et par conséquent tout appareillage compliqué; il est plus expéditif que le précédent et donne une toxine plus active, tuant le cobaye à la dose de l/200(î de centimètre cube.

Martin emploie le bouillon de veau peptonisé (Bouillon peptonisé de Martin : Voy. p. 31) stérilisé par fillration (1) et réparti dans de larges ballons. Le bacille s'habitue très vite à ce milieu, s'y régénère et y produit une toxine active.

Caractères de la culture. — Vers la vingt-quatrième heure il se forme un voile qui, dès le deuxième jour, est continu et épais. Rejeter tout microbe qui ne donne pas de voile. Quand la culture marche bien, le voile tombe au fond par lambeaux le troisième jour; un nouveau voile remplace le premier, s'immerge vers le sixième jour, puis il ne s'en reforme plus. Le milieu n'est jamais acide au tournesol; du deuxième au quatrième jour il devient alcalin à la phtalléinc.

Le maximum de toxicité se produit vers le cinquième ou septième jour ; puis l'activité de la toxine n'augmente plus et diminue vers le dixième jour. C'est donc vers la fin de la première semaine qu'il convient d'opérer la filtration.

Procédés divers. — Les procédés de Spronck, Park et Williams, Nicolle, Macé, employés dans quelques laboratoires, sont moins fidèles que les précédents.

Premier procédé de Spronck. — Basé sur la disparition du glucose dans la viande vieillie (2).

Avec de la viande conservée pendant plusieurs jours jusqu'à ce qu'elle prenne une légère odeur, on prépare selon les règles ordinaires un bouillon peptonisé à 2 p. 100; après alcalinisation, on ajoute 0,5 p. 100 de chlorure de sodium et un peu de carbonate de chaux. Le bouillon est versé dans des flacons de 500 grammes que l'on emplit aux trois quarts ; après stérilisation et refroidissement, on pratique l'ensemencement. Les cultures sont filtrées après un séjour de trois à quatre semaines à l'étuve à 37°.

Second procédé de Spronck. — Basé sur le fait que la levure aurait une action favorisante sur la production de toxine.

Ensemencer dans Yeau de levure peptonisée (Voy. p. 3G) le bacille toxigène rajeuni par une culture sur sérum coagulé suivie d'un passage dans un tube d'eau de levure peptonisée. La culture doit être faite dans un large matras, en couche peu épaisse; dès la vingt-quatrième heure apparaît un voile continu; à la fin de la première semaine la culture a atteint son maximum de toxicité. Elle tue le cobaye à la dose de 1/200» de centimètre cube.

(1) Le bouillon de Martin stérilisé à 120° donne de moins bons résultais; à défaut de bouillon filtré sur porcelaine, il vaut mieux employer le milieu stérilisé par trois chauffages à 100".

(2) Roux a montré que l'on obtenait des résultats plus constants en ajoutant de la levure à la macération de viande ; dans la préparation de son bouillon, Martin a supprimé l'addition de levure et est arrivé à de bons résultats par le séjour de la macération à l'étuve à 35° pendant vingt heures.

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Spronck ne filtre pas sur porcelaine, il ajoute à la culture 3 grammes d'acide phénique par litre et filtre sur papier.

Procédé de Nicolle. — De la viande de bœuf tué le matin même est hachée et mise à macérer une heure à 10° ou 12° dans le double de son poids d'eau. La macération, additionnée de 2 p. 100 de peptone et de 0,5 p. 100 de sel marin, est portée à l'ébullition, filtrée, alcalinisée « assez fortement » et portée dix minutes à 120°, puis filtrée de nouveau et répartie dans des vases quelconques, que l'on bouche à l'ouate et stérilise quinze minutes à 115°.

Après sept jours d'exposition à l'étuve à 37°, sans courant d'air, la culture filtrée serait aussi active que la toxine obtenue par Roux et Martin.

Procédé de Macé. — Macé a recommandé l'emploi de bouillon peptouisé ordinaire additionné de 10 p. 100 de carbonate de chaux, réparti dans des ballons de 1 à 2 litres et stérilisé à l'autoclave. Après un séjour de quatre à six semaines h 37°, les cultures dans ce bouillon fourniraient une toxine aussi active que celle de Roux et Martin.

Procédé de Park et Williams. — Ces auteurs emploient un milieu largement alcalinisé : c'est le bouillon peptonisé ordinaire additionné, après neutralisation, de 7 centimètres cubes de solution normale de soude par litre (Voy. p. 29).