RÉCOLTE DU SÉRUM

A. Procédé de Koch. — Instrumentation. — Préparer d'avance: 1° Trois à quatre cristallisoirs à cloche, composés chacun de deux

Fig. 26. — (Jristallisoir à cloche.

cristallisoirs de deux litres environ de capacité s'emboîtant l'un dans l'autre (fig. 26).

M I LIEUX DR CULTUKE.

Fig. 27. — Matras répartiteur.

Ces cristallisoirs enveloppés de papier sonL stérilisés à 180" dans le four Pasteur, en ayant soin de chauffer très lentement pour ne

pas les briser.

2° Des matras répartiteurs de Chamherland; les laver, les sécher avec soin, fermer à la lampe l'extrémité effilée, munir le tube B d'un tampon d'ouate placé au-dessus de l'étranglement (fig. 27); stériliser à 180°.

3° Des hallons à long col de contenance de 500 grammes; les boucher à l'ouate et les stériliser à 180°.

4° Des tubes à essai bouchés à l'ouate et flambés.

Opération. — t° L'opérateur se transporte à l'abattoir (de préférence par un temps frais) muni des cristallisoirs stérilisés. Les cristallisoirs sont débarrassés du papier qui les entoure et au moment même où l'on opère la saignée d'un bœuf, l'opérateur soulève le couvercle d'un cristallisoir, expose le récipient au jet de sang et l'emplit aux trois quarts. Le cristallisoir est recouvert de suite. Recueillir ainsi du sang dans plusieurs cristallisoirs.

2° Les cristallisoirs sont déposés dans un endroit frais, où on les laisse au repos pendant environ trente-six heures. Ne pas placer les cristallisoirs dans de la glace, ce qui provoquerait la dissolution de l'hémoglobine et communiquerait une teinte rougeâtre au sérum.

3° Au bout de trente-six heures, le caillot s'est formé; le sérum clair s'est séparé ; briser Ja pointe effilée d'un matras de Chamberland, passer cette extrémité effilée dans la flamme d'une lampe à alcool et, en opérant aussi purement que possible, aspirer le sérum dans le matras ; fermer à la lampe la pointe du matras ;

4° Le caillot a retenu une certaine quantité de sérum, dissocier ce caillot avec un agitateur de verre flambé ;.après quelques heures de repos recueillir à part la nouvelle quantité de sérum qui s'esl séparée. Ce sérum, moins clair que le précédent, pourra néanmoins trouver son utilisation.

Variante recommandée. — L'opération est plus aisée à conduire etdonne un meilleur rendement en sérum si Ton utilise, pour recueillir le sang, à la

place des cristallisoirs stérilisés, l'appareil du Latapie, que nous décrirons plus loin (p. 51) : dans ce cas, on remplace le tube a de l'appareil par un entonnoir stérile dans lequel on reçoit le sang qui jaillit de la saignée; la récolte faite, on enlève l'entonnoir, on lui substitue un bouchon de caoutchouc, puis on termine l'opération selon la technique exposée page 5t. Le sérum obtenu est stérilisé comme ci-dessous.

5° Les matras de Chamberland pleins de sérum sont rapportés au laboratoire. Le sérum, quelques précautions qu'on ait prises, a été plus ou moins souillé au cours des opérations, il reste à le stériliser. On commence par le répartir dans les ballons à long col : pour cela, après avoir flambé dans un bec de Bunsen l'orifice du ballon, on soulève le tampon d'ouate; la tubulure effilée du matras de Cham- I "friand, préalablement passée dans la flamme et dont la pointe a été cassée avec une pince flambée, est introduite profondément dans le col du ballon et en soufflant par le tube B on fait écouler le sérum dans la panse du ballon. Pendant tout ce temps le bouchon d'ouate de celui-ci est tenu entre le pouce et l'index de la main gauche.

6° Le ballon étant aux trois quarts plein, son bouchon d'ouate est replacé et on en porte le col dans la flamme du chalumeau à gaz, de façon à le sceller à quelques centimètres de la panse. On emplit autant de ballons qu'il en faut pour contenir le sérum recueilli.

7° Les ballons ainsi, préparés sont portés dans le bain-marie décrit page 13 et chauffés, comme il a été dit, une heure à 56°-58° pendant huit jours consécutifs.

8° La stérilisation étant ainsi obtenue, il reste à répartir le sérum en tubes. Avec un couteau à verre on raye le col du ballon un peu au-dessous de l'extrémité fermée à la lampe, puis on appuie sur l'encoche produite la pointe effilée d'un tube de verre fondue et portée au rouge blanc : une fêlure se produit. On fait progresser la fêlure en touchant son extrémité avec la pointe de verre chauffée à blanc ; les deux extrémités du trait de fracture se rejoignent bientôt et l'on peut facilement séparer, par un léger choc, un capuchon de verre comprenant toute la partie du col scellée à la lampe : le ballon est ouvert.

Placer le ballon sur un valet de paille de telle sorte que son col ait une position presque horizontale.

Ramber dans un bec Bunsen la tubulure effilée d'un matras de

Fig. 28. — Ballon dont le col a été effilé et fermé à la lampe.

48 MILIEUX dk CULTURE.

Gharaberland stérilisé, en casser la pointe avec une pince flambée, introduire l'effilure dans le ballon en touchant presque le fond et aspirer le sérum dans le malras. Arrêter l'aspiration de façon à laisser dans le ballon la couche superficielle du liquide, couche qui sVsl

trouvée au contact de l'air et a pu être souillée par les poussières atmosphériques (lîg. 29).

9° A l'aide du matras répartir le sérum dans des lubes Ilambés : passer rapidement dans la flamme la tubulure effilée du matras, flamber l'orifice d'un tube avant d'en enlever le bouchon d'ouate, faire pénétrer l'effilure dans le tube et faire couler dans celui-ci environ 10 centimètres cubes de sérum; replacer le bouchon d'ouate du tube.

Le sérum est alors prêt, soit pour servir à l'état liquide après observation de quarante-huit heures à l'éluve à 30°), soit pour être gélatinisé.

Dans ce dernier cas, la gélafinisation doit être opérée le plus rapidement possible: si quelques germes avaient pénétré dans les tubes pendant la répartition, ils risqueraient fort d'être détruits par la chauffe de coagulation.

B. Procédé de Roux et Nocard. — Ce procédé a sur b1 précé-

Fig. 29. — Répartition du sérum.

dent l'avantage de fournir un sérum beaucoup plus clair el plus favorable aux cultures; il devra être mis en usage chaque fois que les circonstances le permettront.

Instrumentation. — Préparer :

lu Un trocart de Nocard (fig. 30), sur la canule duquel, le mandrin

Trocarl de Nocard.

étant enlevé, peut s'adapter un ajutage métallique qui porte un tube de caoutchouc rouge long de 50 centimètres environ et terminé à son extrémité inférieure par un tube de verre de 15 centimètres de

longueur

Le trocart et le tube de caoutchouc muni de son ajutage sont enveloppés séparément dans du papier filtre et stérilisés à l'autoclave, ou plus simplement plongés pendant dix minutes dans de l'eau bouillante, au moment de l'opération ;

2° Un ciseau courbe sur le plat et un bistouri également aseptisés par ébullition ;

3" Un ou deux flacons à large ouverture de 3 litres environ de capacité.

Ces flacons, bien lavés, sont séchés, puis on coiffe leur orifice avec deux ou trois doubles de papier qu'on assujettit sur le col à l'aide d'une licelle; par-dessus ce premier bouchage on en fait un second identique mais fixé avec une ficelle plus bas que le précédent, de telle sorte qu'on puisse enlever le capuchon extérieur sans louchera celui placé au-dessous (fig. 31).

Les flacons ainsi préparés sont stérilisés au four Pasteur;

4° Des matras de Chamberland et des tubes à essai stériles.

Opération. — On recueille d'ordinaire le sérum sur un cheval ou -ni' un une; dans ce cas l'animal est laissé debout, on peut au besoin lui couvrir les yeux et le maintenir au moyen d'un serre-nez.

Besson. — Techn. microb., 2« ôdit 4

Fig. 31. — Bocal pour recueillir le sang.

La partie droite du premier capuclion a été supprimée pour montrer le second capuchon.

Si l'on utilise un bovidé, il sera avantageux de coucher l'animal sur la table à inoculations vaccinales. On devra s'adresser de préférence a un animal a jeun.

1° Opérer comme si l'on voulait pratiquer la saignée de la jugulaire. Faire comprimer et saillir la veine du cou ; au-dessus du point comprimé, sur le trajet du vaisseau, pratiquer au bistouri une petite incision longitudinale de la peau.

2° Par l'incision, enfoncer le trocart entre la veine et la peau sur une longueur de 2 centimètres environ, puis piquer la veine et y faire pénétrer le trocart parallèlement à l'axe du vaisseau.

3° La canule restant en place, retirer le trocart et y substituer l'ajutage mélalliqueportantle tube de caoutchouc ; pendant ce temps l'aide comprime la veine un peu au-dessus de la canule et empêche le sang de s'écouler. Faire vile.

4° Le tube de caoutchouc mis en place est comprimé entre le pouce et l'index de la main gauche de l'opérateur, l'aide cesse la pression au-dessus de la canule, mais continue toujours à comprimer au-dessous.

5° Un second aide approche le flacon stérilisé, détache et soulève le capuchon extérieur, enfonce le tube de verre terminant le caoutchouc à travers le deuxième capuchon ; les doigts de l'opérateur cessent de comprimer le tube et le sang s'écoule dans le flacon.

Le premier flacon étant aux trois quarts plein, l'opérateur comprime à nouveau le tube de caoutchouc, l'aide retire du col du flacon l'ajutage de verre, recouvre rapidement le flacon avec le capuchon de papier et assujettit celui-ci autour du col. On opère de même pour emplir le deuxième flacon.

Un cheval peut ainsi fournir, sans que sa santé ultérieure en souffre, de 5 à 6 litres de sang ; sur de jeunes génisses nous n'avons jamais retiré plus de 3 litres.

6° Les bocaux sont portés dans un endroit frais; au bout de trente-six heures le sérum surnage ; il a une belle couleur citrineet est transparent. Aspirer purement le sérum avec un matras de Chamberland et le répartir immédiatement dans des tubes stérilisés comme il a été dit page 48.

C. Appareil de Latapie. — Usage recommandé. — Cel appareil simplifie la technique du procédé de Roux et Nocard; il permet d'éviter toute contamination et assure un rendement en sérum de 700 centimètres cubes environ par litre de sang, au lieu du rendement ordinaire de 400 à 450 centimètres cubes.

Description. — Il se compose d'un flacon de plusieurs litres de capa-

oi

cité, à large goulot, fermé par un bouchon en caoutchouc L>, percé de trois trous (fig. 32). Dans le flacon, on dépose une certaine quantité de tiges de verre creuses, ouvertes aux deux bouts et percées de nombreux trous. Le bouchon perforé reçoit trois tubes ; le premier, a, est destiné à l'entrée du sang. Un ajutage en caoutchouc relie son extrémité libre au trocart de Nocard ; le tube 6 assure la communication avec l'air atmosphérique, son extrémité supérieure est munie d'un tampon d'ouate, son extrémité inférieure pénètre assez profondément dans le flacon et est fortement recourbée; le tube o, enfin, sert à l'écoulement du sérum, son extrémité inférieure recourbée s'arrête à quelques centimètres du bouchon, son extrémité supérieure est reliée par un ajutage de caoutchouc à un tube de verre effilé et scellé à la lampe ; une pince à pression peut être placée sur le caoutchouc, en p, et intercepte toute communication entre les deux

de verre.

mm

segments de tube

Fis

32. — Appareil de Lalapie pour la récolto du sérum (grands animaux).

Enfin l'appareil est disposé sur

un support spécial, non représenté dans la figure, et qui permet de l'incliner à volonté de telle sorte que le goulot se trouve dirigé en haut ou en bas (1).

Opération. — 1° L'appareil est stérilisé à l'autoclave. Avoir soin d'humecter l'ouate du tube b, d'envelopper le flacon dans du papier filtre et de chauffer lentement. Après stérilisation et refroidissement luter le bouchon à la paraffine.

2° Faire la ponction veineuse comme dans le procédé de Roux et Nocard; relier la canule au tube a. Laisser le sang s'écouler dans le flacon en ne le remplissant qu'à demi sans atteindre l'extrémité du tube à air 6. Fermer le tube d'introduction avec une pince à pression. (Le flacon est placé le goulot en haut pendant toute cette partie de l'opération.)

3° Laisser reposer l'appareil pendant douze heures pour permettre la formation du caillot.

(1) Nous décrirons au chapitre xi un appareil du môme auteur utilisable pour la récolte du sérum chat les petits animaux.

MILIEUX DK CULTURE

4° Le cailloL formé et rétracté autour des baguettes de verre, incliner doucement l'appareil sur le support de façon à placer le goulot vers le bas; le sérum tombe dans la partie du flacon voisin*.* du goulot.

5° Placer une pince à pression en p, briser la pointe de l'el'Uluie et enfoncer celle-ci dans le vase stérile où l'on désire recueillir le sérum. Enlever la pince, le sérum s'écoule. On arrête ou modère à volonté refoulement du sérum à l'aide de la pince

L'orifice intérieur du tube d'écoulement étant à quelque distance du bouchon, il reste dans le flacon un peu de sérum contenant les globules rouges précipités; la courbure du tube empêche ces globules d'être entraînés pendant l'écoulement d.u sérum.

GÉLATINISATION DU SÉRUM.

Le sérum a la propriété de se coaguler par La chaleur; pour lui conserver sa transparence il faut opérer celle coagulation ou

Fig. 33. — Étuve pour coaguler le sérum.

gélatinisation entre 08 et 70° ; pour que la solidification soit complète, il faut maintenir cette température pendant deux à trois heures.

On donne au sérum, dans les tubes, une disposition en plan incliné semblable à celle qui est adoptée pour la gélose. Pour opérer la gélatinisation on utilise d'ordinaire l'appareil de Koch modifié (fig. 33}.

Cet appareil se compose d'une boite rectangulaire en cuivre, à

double paroi et montée sur des pieds permettant de lui donner une inclinaison plus ou moins accentuée sur l'horizontale. La double paroi est remplie d'eau; l'espace intérieur reçoit une couche mince de sable sur laquelle sont couchés les tubes de sérum ; un thermomètre est placé à côté des tubes. A sa parlie supérieure la boîte est fermée par un couvercle mobile composé de deux lames de verre fixées dans un cadre métallique el séparées par une mince couche d'air. Une rampe à gaz est disposée sous l'appareil; le gaz, pour s'y rendre, lia verse un régulateur de Roux immergé dans l'eau de la double paroi ;~on conduit l'opération ainsi qu'il suit:

1« Les tubes contenant environ 10 centimètres cubes de sérum sont couchés sur le sable; l'inclinaison de l'appareil doit être telle que le sérum ne touche pas les touchons d'ouate des tubes.

2° Allumer le gaz ; quand le thermomètre intérieur atteint 08", régler l'appareil • Voy. chap. iv) de façon à maintenir la température à ce degré.

3° La durée de la chauffe nécessaire pour obtenir la solidification complète varie (de deux à trois heures) avec les différents échantillons ; il faut surveiller la marche de l'opération en retirant de temps en temps un tube pour examiner le degré de coagulation. La gélatinisation est achevée quand on peut redresser le tube sans que le sérum perde sa position en plan incliné. Cesser alors de chauffer. Le sérum gélatinisé doit avoir conservé une teinte jaune ambré el être transparent.

4° Avant de mettre les tubes en service, s'assurer qu'ils ne sont pas contaminés, par une observation de trente-six heures à l'étuve à 30°.

Quand on ne veut gélatiniser qu'un petit nombre de. tubes de sérum on peut se passer de l'appareil de Koch. On dispose alors les tubes dans une petite boite plate en cuivre d'environ 12 centimètres de largeur et dont une

Fîg. 'H. — Plateau pour coaguler le sf-rum.

des parois porte des encoches destinées à recevoir l'extrémité supérieure des tubes : ceux-ci, dont le fond repose sur la paroi inférieure de la boîte, sont ainsi maintenus en position inclinée; on couvre avec une lame de

verre et dispose le tout sur une casserole pleine d'eau que l'on porte a l'ébltllition ; il faut une heure mi deux pour opérer la gelatinisatinn.

SÉROSITÉ DES ÉPA NCHEMENTS .

Les épanchcmenls pleuréliques stériles (pleurésie franche) fournissent souvent un sérum très clair bien coagulable et que l'on peut, dans certains cas, utiliser comme milieu de culture.

Pour recueillir purement cette sérosité, opérer comme pour les ponctions ordinaires, en employant un appareil dcPotain préalablement stérilisé :1e trocart est bouilli; le bouchon en caoutcliouc et le tube d'aspiration sont portés à 115° à l'autoclave; le flacon est llambé au four Pasteur. On distribue ensuite le sérum dans des tubes stériles avec un malras de Cliamberland. On peut obtenir ainsi du sérum absolument pur; cependant, il est le plus souvent nécessaire do tyndalliser le liquide avanl de le coaguler (opérer comme plus haut).

Les épanchements ascitiques ne fournissent d'ordinaire qu'un sérum mal coagulable et par conséquent inul ilisable comme milieu de culture solide

SÉRUM GLYCÉRINÉ.

En mêlant 6 à 8 p. 100 de glycérine pure au sérum on obtient un milieu excellent pour la culture du bacille de la tuberculose.

1° Aspirer dans un matras de Cliamberland llambé 6 à 8 grammes de glycérine pure préalablement stérilisée à l'autoclave.

2° Aspirer ensuite dans le matras 100 centimètres cubes de sérum liquide stérile (pour faciliter celte opération on peut jauger préalablement le matras).

3° Répartir en tubes; gélatiniser à 75<>,ce sérum ne se coagulant qu'aune température plus élevée que le sérum ordinaire.