CHAPITRE

Les cultures des microbes aérobies doivent être contenues dans des vases permettant l'accès de l'air, mais les protégeant contre les poussières atmosphériques.

Les vases de culture peuvent être variés : tubes à essai, matras Pasteur, fioles diverses, cristallisoirs de Pétri, boîtes de Soyka, etc.

Les bouchons d'ouate, les capuchons de papier, les cloches en verre sont les moyens de protection les pins ordinairement employés.

Tout ensemencement sera pratiqué selon les règles suivantes : 1° Utiliser pour prélever la semence un instrument stérile; 2° Prélever purement la semence;

3° Reporter purement la semence dans le milieu à ensemencer.

Article I. — INSTRUMENTATION.

Les instruments utilisés pour les ensemencements sont la pipette Pasteur, le fil de gélatine, V aiguille de verre.

A. Pipette Pasteur. — La pipette Pasteur se compose d'un tube de verre de 5 à 7 millimètres de diamètre intérieur, effilé et fermé à la lampe à une de ses extrémités, ouvert et muni d'un tampon d'ouate à l'autre; la pipette a une longueur totale de 20 à 25 centimètres.

On aura toujours une provision de pipettes préparées d'avance.

Fabrication. — 1° Prendre un tube de verre de o à 7 millimètres de diamètre intérieur; avec le couteau à verre y pratiquer des traits déterminant des fragments de 25 centimètres environ de longueur (le tube de verre que l'on trouve dans le commerce a environ I mètre de long et fournit 4 fragments).

2" Séparer les fragments en rompant le tube tenu entre les mains,

INSTKl'MENTATlo.N.

CM

les pouces étant appuyés de part et d'autre de chaque côté du Irait du couteau.

3o Passer les deux extrémités de chaque fragment dans la llamme du chalumeau à gaz pour émousser les arêtes de section.

i Munir les deux extrémités de chaque tube d'un petit tampon d'ouate enfoncé complètement dans le tube qui doit le déborder de quelques millimètres (fig. 38); pour cela enfoncer dans le tube un

Fig. 38. — Préparation des pipettes de Pasteur.

fragment d'ouate en serrant modérément à l'aide d'une pointe mousse (l'extrémité effilée d'un tiers-point convient très bien).

b° Porter la partie médiane du tube ainsi préparé dans la flamme d'un chalumeau (flamme moyenne), ramollir le verre en tournant constamment le tube entre les pouces et les index; quand le verre est devenu malléable, sortir rapidement le tube de la flamme et l'étirer de façon à produire une effilure longue d'environ 30 centimètres (fig. 38, A . Couper l'efiilure par le milieu dans la pointe de la flamme du chalumeau : on obtient ainsi deux pipettes dont les extrémités effilées se trouvent scellées.

Cette manipulation exige un certain tour de main. Avoir soin d'étirer le tube en position bien rectiligne : pour cela, les coudes de l'opérateur doivent être appuyés sur la table. Toujours étirer hors de la flamme ; ne pas produire une effilure trop mince et par conséquent trop fragile.

6° Les pipettes ainsi préparées sont placées dans un panier en toile métallique, leur grosse extrémité reposant sur le fond du panier, et stérilisées à 180° dans le four Pasteur. Elles sont alors prêtes à servir.

Utilisation. — 1° Casser, avec une pince à dissection ou entre l'ongle du pouce et la pulpe de l'index, l'extrémité scellée de l'efiilure.

2o Passer dans la flamme d'un bec Bunsen ou d'une lampe à alcool l'effilure de la pipette pour détruire les germes qui ont pu se déposer à la surface.

3° Plonger l'extrémité de cette effilure dans le liquide à ensemencer, celui-ci monte dans le tube par capillarité ou par une aspiration pratiquée avec la bouche à l'autre extrémité de la pipette.

Dans cette manœuvre avoir soin que le liquide aspiré n'atteigne pas le bouchon d'ouate de l'orifice supérieur de la pipette

62 ENSEMENCEMENT ET DISPOSITION DES CÙtTURSS A.ÉROBIES.

4° Porter rapidement la pointe de lu pipette au contact du milieu à fertiliser et y laisser tomber — par l'action de la pesanteur ou en souillant légèrement par l'orifice supérieur - - une ou plusieurs gouttes du liquide semence.

5° On peut conserver indéfiniment à l'abri de toute contamination le liquide aspiré dans la pipette; pour cela on porte l'extrémité effilée dans une petite flamme (veilleuse du bec de Bunsen par exemple) en inclinant un peu la pipette pour que le liquide reflue vers la partie large ; quand le verre est ramolli par la chaleur on élire avec une pince à dissection, jusqu'à fermeture complète, l'exi renie point»1 de l'effilure.

B. Fil de platine. — Le fil de platine doit être préféré à lou! autre fil métallique à cause de son inaltérabilité qui permet de le porter au rouge sans en produire l'oxydation. Par suite de sa grande conductibilité il ne peut être tenu avec les doigts, il faut l'emmancher avant de l'utiliser.

Le fil de platine ainsi emmanché, ose des Allemands, répond à

tous les besoins. On trouve dans le commerce trois types de fil, Je gros, le moyen, le fin ; chacune de ces sortes de fil trouve son utilisation.

Le fil de platine fin est le plus commode, car il se refroidit très rapidement, ce qui esl une condition importante de réussite dans la pratique des ensemencements; mais il esl très peu résistant, très flexible et ne convient pas pour prélever une culture adhérente sur milieu solide ou ensemencer un milieu rugueux , tel que la pomme de terre.

En pratique, il faudra toujours avoir à portée de la main :

Un fil de platine fin, rectiligne, pour les ensemencements par pi <l ùre ;

Un fil fin, terminé en boucle, pour prélever une goutte. Un fil moyen, que l'on peut courber à angle droit près de son extrémité;

Un fil gros dont l'extrémité est écrasée en forme de spatule.

Préparation de Vôse. — \ ° Prendre une baguette de verre de !6 à 7 millimètres de diamètre, la diviser en fragments de 20 à 2fd centimètres de longueur (faire un trait au couteau à verre, puis rompre entre les doigts au niveau de ce trait).

Fig. 39. — Oses de platine.

[NSTRUM ENTÂT ION.

2o Co.uper avec de forts ciseaux des morceaux de fil de platine longs de 5 à 7 centimètres.

:j° Saisir de la main gauche un fragment de baguette, en ramollir une extrémité dans la flamme du chalumeau, en faisant constamment tourner la baguette entre les doigts. Pendant ce temps la main droite de l'opérateur tient, à l'aide d'une pince, le morceau de fil de platine à environ lti millimètres d'une de ses extrémités, elle porte cette extrémité dans la flamme et la chauffe au rouge blanc.

4° Quand l'extrémité de la baguette de verre est ramollie, y introduire bien droit l'extrémité chaude du fil de platine et l'y faire pénétrer sur une longueur d'un centimètre et plus. Chauffer le tout quelques instants, puis laisser refroidir.

5° Porter rapidement l'autre extrémité de la baguette de verre dans la flamme pour en émousser l'arête tranchante.

6° Avec une pince à dissection, contourner en boucle, couder à angle droit, ou écraser avec un marteau, suivant le cas, l'extrémité libre du fil de platine.

Utilisation. — 1° Tenir la baguette de verre par son tiers supérieur, en passer très rapidement l'extrémité inférieure (où se trouvele fil de platine) dans la flamme d'un bec de Bunsen, pour détruire les germes déposés à la surface du verre.

Ce flambage doit être très rapide, la surface lisse du verre se stérilisant rapidement et ne devant d'ailleurs pas entier en contact immédiat avec la culture; en chauffant trop fortement on risquerait de faire éclater le verre au point où est soudé le fil de platine.

2° Porter ensuite au rouge le fil de platine, le sortir de la flamme et le laisser quelques secondes à l'air pour qu'il refroidisse.

L'exposition du fil à l'air doit être limitée au temps strictement nécessaire à son refroidissement, sans quoi ce fil risquerait d'être souillé par les poussières atmosphériques; c'est pourquoi le fil fin, se refroidissant rapidement, est ordinairement employé.

3° Porter rapidement le fil de platine sur le produit à ensemencer, puis le faire pénétrer dans le milieu à fertiliser.

4° L'ensemencement terminé, le fil de platine doit être porté au rouge pour être débarrassé des germes qui y sont restés adhérents.

Celte précaution est particulièrement indispensable quand on manie les microbes pathogènes ; si on omettait de la prendre on souillerait la table et les divers objets au contact desquels pourrait se trouver l'ôse.

C. Aiguille de verre. — Étirer une baguette de verre de la même fayon que l'on étire le tube dans la préparation des pipettes

U ENSEMENCEMENT ET DISPOSITION DES CULTURES AÉROBIES. Pasteur. Avec le couteau ù verre, couper carrément, par son, milieu, la partie effilée. On prépare ainsi des aiguilles aussi fines qu'on le désire.

Ces aiguilles, moins maniables que le lil de pluline, ont sur celui-ci l'avantage d'être rigides : elles conviennent très bien pour pratiquer les ensemencements en piqûre profonde (gélatine).

Flamber ces aiguilles au moment de les utiliser.

Article 11. — ENSEMENCEMENTS.

Les ensemencements peuvent être pratiqués à l'aide d'une culture préalable ou encore d'eau, de poussières, de sang, etc., mais toujours leur technique reste la même, seul le mode de prélèvement de l'échantillon à ensemencer varie avec les différentes substances. Nous apprendrons plus lard a faire ces divers prélèvements; pour le moment supposons que nous ayons à pratiquer des ensemencements à l'aide d'une culture préalable et prenons comme type une culture en bouillon de la Bactéridie charbonneuse.

L'opération se décompose en trois temps : [-. Ouvrir le tube où doit être prélevée la semence. 11. Prélever la semence.

111. La reporter dans le milieu à fertiliser. Ici plusieurs cas peuvent se présenter; on peut ensemencer :

a. En bouillon ou dans tout autre milieu liquide ;

b. En strie sur gélose, gélatine, sérum inclinés ou pomme de terre ;

c. En piqûre en gélatine ;

d. En colonies séparées (isolement); ce dernier cas fera l'objet d'un chapitre spécial.

A. Ensemencements dans un milieu liquide. — .Nous prendrons le tube de bouillon comme type du milieu liquide.

1° Prendre un tube de bouillon stérilisé et le tube contenant la culture à réensemencer ; flamber le bouchon d'ouate qui ferme l'orifice de chacun de ces tubes pour détruire les poussières qui s'y sont déposées; saisir successivement les bouchons entre le pouce et l'index de la main droite et les dégager légèrement en les tournant sur eux-mêmes par un mouvement de vrille.

2° Placer les deux tubes côte à côte dans la main gauche, dans une position presque horizontale, le fond des tubes reposant dans le creux de la main, leur partie postérieure étant maintenue entre le pouce, l'index et le médius.

3° Prendre entre l'index et le médius de la main droite l'ose lil à boucle) et la flamber comme il a été dit.