EXAMEN EN CELLULE
L'usage des cellules permet de conserver longtemps la vitalité des microbes soumis à l'examen et d'étudier leur développement.
Pour cultiver un microbe dans une cellule, il est indispensable de placer celle-ci à la température qui convient le mieux au développement du microbe (37° d'ordinaire), ce qu'on obtient en déposant la cellule dans une étuve d'où on la retire fréquemment pour la porter sous le microscope. Il est préférable de maintenir la cellule à la température optima sur la platine même du microscope en utilisant la chambre chaude de Vignal (fig. 94) ou la platine chauffante de Ranvier, véritables petites étuves dans lesquelles on observe la préparation par une ouverture circulaire découpée dans l'appareil.
La platine chauffante de Pfeiffer est plus simple et répond aux mêmes besoins; elle est constituée par une boite rectangulaire en verre dont la face supérieure, creusée d'une cellule, sert de porte-objet;
l''ig. 94. — Chambre chaude de Vignal.
on dispose l'appareil sous le microscope comme une lame ordinaire. Enfin on peut placer la partie inférieure du microscope dans une
petite étuve (Zeiss, Plehn)constituéepar une boite entourant lestatif, munie d'une fenêtre pour l'éclairage et de clapets latéraux permettant de manipuler la pré-
Fig. 96.— Coupe suivant AB de la platine chauffante de Pfeiffer. paration . L'appareil ,
pourvu d'un régulateur, est chauffé par un brûleur à gaz. On ne peut dépasser une température de 45° sans endommager le microscope.
Les cellules utilisées sont de plusieurs modèles.
A. Cellule de Koeh. — Procédé recommamh:. — La cellule de Koch est une lame porte-objet de dimensions ordinaires, creusée en
EXAMEN SANS COLORATION
son centre d'une dépression circulaire en cupule mesurant envir lo millimètres de diamètre. On stérilise cette lame au moment l'usage en la passant plusieurs fois rapidement dans la flamme bec de Bunsen ou d'une lampe à alcool. La lamelle destinée à couvrir la cellule est également stérilisée par ilambage au moment du besoin.
a. Pour étudier les microbes dans une culture antérieurement développée, on dépose au centre de la lamelle flambée et refroidie une gouttelette de cette culture ; on retourne alors la lamelle sur lacellule : la goutte de liquide adhérant à la face inférieure de la lamelle se trouve suspendue dans l'atmosphère de la cellule. On a soin de recouvrir avec un peu de vaseline les bords de la lamelle pour empêcher l'évaporation du liquide.
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Fisr. 97.
La goutte déposée au centre de la lamelle doit être assez petite pour ne pas toucher les bords de la cellule, sans quoi la capillarité ferait passer le liquide entre la lamelle et la lame et la goutte suspendue disparaîtrait.
Au cours de l'examen microscopique, il faut effectuer très prudemment le mouvement
d'abaissement du tube du microscope : la lamelle ne portant que par ses bords, la moindre pression suffit à la briser. Se servir de l'objectif 8 ou 9 et de l'oculaire I ou II.
6. Le plus fréquemment on utilise la goutte suspendue pour observer le développement d'un microbe : il faut alors que la culture se fasse dans la cellule même. Pour cela on dépose sur la lamelle une
Étuve de Zeiss pour observations au microscope.
goutte de bouillon stérile ou d'humeur aqueuse de L'œil prélevée purement et on ensemence cette goutte avec le microbe à examiner. Il est capital que l'ensemencement n'apporte à la goutte qu'un
très petit nombre de germes;
on peut prélever une trace de culture à l'extrémité d'un fil de platine droit et toucher très fc^^;^/^^^^^ légèrement la goutte avec ce
Fig. 98. — Cellule de Kooh. fil, mais il est préférable de
recourir à la méthode des dilutions ; on porte une ose de culture dans un tube de bouillon I, on agite; avec une ou deux gouttes du tube 1, on ensemence un nouveau tube II, et c'est une goutte de bouillon prélevée dans ce tube qui sera déposée sur la lamelle.
Si le tube 11 renfermait encore trop de microbes, on ensemencerait avec quelques gouttes de son contenu un tube 111 où l'on prélèverait la goutte à examiner.
Nous résumerons ainsi les temps successifs de l'opération : 1° Flamber la lame et la lamelle; laisser refroidir ; 2° Porter au centre de la lamelle une goutte de bouillon stérile et ensemencer avec une trace de culture (ou mieux déposer sur la lamelle une goutte du milieu nutritif ensemencé par la méthode des dilutions) ;
3° Renverser la lamelle sur la cellule; luterles bords à la vaseline ;
4° Examiner sur une platine chauffante ou porter à l'étuve et examiner fréquemment sur la platine ordinaire; se servir de l'objectif 8 ou 9 et de l'oculaire 1 ou II. S'assurer au commencement de l'épreuve que chaque champ du microscope contient au plus deux ou trois germes.
L'observation peut être poursuivie pendant un à trois jours; la quantité d'air contenue dans la cellule autour de la goutte suspendue suffit d'ordinaire à assurer le développement du microbe.
B. — Cellule improvisée. - Découper dans une feuille de
carton un rectangle d'environ 3 centimètres de long sur 2 de large et 1,5 à 2 millimètres d'épaisseur; enlever au centre v .^^w,Jm^ un petit carré de 15 milli-
Fig. 99. - cellule improvisée. mètres de côté ; stériliser Le
morceau de carton par ébullition dans l'eau ou dans l'autoclave à 115°, le placer avec une pince flambée sur une lame passée à la flamme : on obtient ainsi une
EXAMEN APRES COLORAT [I >.\
Fig. 100. — Cellule de Bœtteher.
cellule sur laquelle on appliquera la lamelle portant la goutte pendante.
<; __ Cellule de Bœtteher. — Cette cellule est constituée par une lame de verre sur laquelle est collé un petit anneau de verre de 15 à 20 millimètres de diamètre et de S millimètres de hauteur. Sur l'anneau on applique la lamolle portant la goutte suspendue. Placer un peu d'eau au fond de la cellule pour éviter l'évaporation de la goutte suspendue.
D. — Cellule de Ranvier. — Dans les appareils précédents, la goutte suspendue présente une face^ inférieure sphérique; il en résulte une perturbation des rayons lumineux qui traversent le système, perturbation qui apporte une certaine gène à l'observation. Dans les recherches délicates, il est préférable que le liquide examiné présente deux faces parallèles ; cette disposition est réalisée dans la cellule de Ranvier.
Elle est constituée par une lame de verre un peu épaisse creusée à son centre d'une rainure circulaire de la à
20 millimètres de diamètre, délimitant un plateau qu'elle entoure de tous côtés. La face supérieure de ce plateau est moins élevée que celle de la lame d'un dixième de millimètre. La goutte de liquide étant déposée sur le plateau, on couvre avec la lamelle; la goutte écrasée entre la face supérieure du plateau et la lamelle forme une couche d'un dixième de millimètre d'épaisseur, entourée de tous côtés par l'air retenu dans la rainure; on lute les bords de la lamelle et on opère pour le reste comme avec les appareils précédenls.
Fig. 101. — Cellule de Ramier.
Article IL — EXAMEN APRÈS COLORATION.
Les méthodes de coloration permettent d'étudier la morphologie des microbes, et fournissent des données importantes pour le diagnostic des espèces.
Les différentes espèces bactériennes, en effet, ne se comporlenl pas de la même façon vis-à-vis des matières colorantes; les unes fixent facilement les couleurs et ne se laissent pas décolorer par
l'alcool; d'autres au contraire abandonnent à l'alcool les matières colorantes qu'elles ont fixées; d'autres encore se colorent difficilement, mais résistent à l'action des décolorants les plus énergiques.
Les bactéries sont des cellules végétales où le noyau occupe la plus grande place (Bùtschli) ; elles fixent les colorants du noyau des cellules végétales, c'est-à-dire les couleurs basiques d'aniline.
Matières colorantes. — Ehrlicha divin-, au point de vue de leur action sur les cellules, les matières colorantes en deux groupes : les couleurs basiques et les couleurs acides.
Les couleurs basiques sont celles dont le principe colorant est une base combinée à un acide incolore. On les appelle encore couleurs à élection, car elles ont une électivité marquée pour les noyaux et particulièrement les noyaux des cellules végétales. Ces couleurs sont les véritables colorants des microbes; les plus employées d'entre elles sont les suivantes :
Violets.
Krystall violet.
Violet de Laulh (thionine).
Violet de gentiane.
Violet de méthyle B (violet de Bàle).
Violet de méthyle 6 B.
Violet de Paris.
Violet dahlia.
( Bleu de méthylène.
Bleus j Bleu Victoria."
' Bleu de quinoléine.
( Fuchsine.
Rouges < Ruhine.
' Safranine.
Verts. * Vert de mét,iy1e-
'. Vert malachite.
Brun de Bismarck ; Vésuvine.
Noir Colin ; Induline.
Dans les couleurs acides, au contraire, le principe colorant est un acide combiné à une base colorée ou non. Ce sont des couleurs sans élection, colorant les différents protoplasmas. La fluorescéine (éther phtalique de la résorcine), Véosine (fluorescéine tétrabromée), Vaurantia, la coccinine, la fuchsine acide, le picro-carmin sont les plus employées de ces couleurs.
Remarque. — Les couleurs d'aniline possèdent une puissance de coloration intense; elles tachent le linge, les doigts, etc.; on doit les manier avec précaution ; éviter d'agiter les couleurs pulvérulentes (bleu de méthylène, violet de gentiane, etc.). Les mains tachées par les couleurs d'aniline seront décolorées assez facilement par l'alcoolé de savon.
Mordants. — En teinture, quand on veut fixer plus solidement une couleur sur un tissu, on emploie un agent intermédiaire, le mordant, qui, se combinant à la fois avec la matière colorante et le tissu, les réunit intimement l'un à l'autre.
Dans la coloration des microbes, on utilise également les mordants ; ils augmentent les affinités des matières colorantes pour les cellules et rendent la coloration plus rapide et plus durable; les mordants ordinairement employés sont les suivants :
EXAMEN VPHÈS COLORATION.
Acides. — Acide acétique, acide oxalique.
Phénol, créosote.
Tanin.
Iode, en solution iodo-iodurée.
Bichlorure de mercure.
Alcalins. — Potasse caustique, ammoniaque, borate de soude, carbonate d'ammoniaque, alcalis organiques (aniline, phènylamine, toluidinc).
Mélange de deux matières colorantes dont l'une joue le rôle de mordant par rapport à l'autre.
Action de la chaleur. — On peut encore augmenter la rapidité et la solidité de la coloration en chauffant entre 60° et 100° la préparation immergée dans le bain colorant.
