CHAPITRE V

Méthodes d'inclusion

Les méthodes d'inclusion ont pour but de donner aux préparations qui, même à la suite d'un durcissement soigné, n'ont pas acquis une consistance suffisante, la propriété de se laisser tailler en coupes; il y a beaucoup de masses d'inclusion qu'il est inutile d'enlever des coupes lorsqu'on les colore ou qu'on les examine, et qui permettent de rendre fixes certaines parties de tissus ou un contenu anormal, et d'en faire des coupes tout à fait complètes.

I. Inclusion à la eelloïdine. ~ La celloïdine répond à tous les desiderata ; elle laisse les coupes complètement transparentes , cède les routeurs au lavage et n'a, par conséquent, pas besoin d'être enlevée. On fait une solution faible et une solution forte; cette dernière a une consistance sirupeuse et se prépare en dissolvant la celloïdine coupée en moreeaux dans l'alcool et l'éther, mélangés à parties égales.

Les préparations doivent avoir été, au préalable, complètement déshydratées dans l'alcool absolu, sans qu'il soit nécessaire, comme on le recommande souvent, de les faire ensuite passer par un mélange d'alcool et d'éther.

Soit, pour la solution faible ou de consistance huileuse : parties égales de celloïdine, coupée en petits tubes, d'alcool et d'éther, et, pour la solution forte ou de consistance sirupeuse : celloïdine, 3; alcool, 3; e'ther, 2. Conserver dans des flacons à bouchon de verre et à large ouverture. Si la solution s'épaissit, on ajoute de nouveau de l'alcool et de l'éther; si elle se trouble, on laisse évaporer ces liquides. Couper en morceaux la masse qui reste et dissoudre de nouveau.

En général, les coupes paraffinées sont plus fines, mais elles se colorent laioins bien qu'en inclusion celloïdinée.

Les pièces ne doivent pas avoir plus de 0"',01 d'épaisseur; on les fait passer de l'alcool dans la solution faible, pendant vingt-quatre heures au moins, et pendant autant de temps dans la solution forte de celloïdine. Lors(|u'il s'agit d'objets difficiles à traiter et que l'on en a le temps, on prolongera le bain dans les deux solutions pendant plusieurs jours, car

MÉTHODES d'inclusion 25

riiiclusioli réussit d'aiitaut mieux que les préparations ont été pénétrées pendant plus lonji,tenips.

Au sortir de la solution forte, on porte les pièces sur de petites plaques de verre, si elles doivent être coupées au microtome à congélation, ou directement sur bouchon, s'il s'agit de les couper au microtome ordinaire à traîneau. On verse encore una certaine quantité de celloïdine concentrée sur la plaque de verre ou sur le bouchon si l'objet n'y adhère pas suffisamment. On fait sécher à l'air la préparation ainsi entourée de celloïdine, puis on la baigne pendant vingt-quatre heures dans l'alcool à 80° où la masse d'inclusion se solidifie complètement. Le degré de consistance obtenu varie avec la rapidité plus ou moins grande avec laquelle la celloïdine a séché à l'air; il est plus élevé si la dessiccation a été opérée lentement. Mais, si l'on emploie le i)r()cédé de la congélation, il suffit d'une demi-heure de séjour des morceaux à l'air pour obtenir une consistance suffisante : autrement, les morceaux seraient ti'op durs et se détacheraient de la pla([ue de rinstrunu'ut.

Lors(ju'on fait usage d'autres microtomes, il est très utile de ralentir le ])lus possible la dessiccation, en mettant la i)ièce à l'abri de l'air sous une cloche de verre. Pour cela, on ne se contentera pas de porter sous la cloche la i)ièce baignant dans la celloïdine et placée sur bouchon, mais on entourera ce dernier d'une bande de pai)ier carton fixée au moyen d'uiu' aiguille. C'est dans le récipient ainsi formé (ju'on verse une mince couche de celloïdine : on y place ensuite le fragnuMit qu'on recouvre abondamment de la même substance. Il faut une couche d'environ deuxmilliniètres d'épaisseur entre le bloc et le l)ouchon sur lequel on évitera de comprimer la pièce. Ainsi enveloppée d'une couche épaisse de celloïdine, la préi)aration sèche très lentement, en un, deux ou trois jours, et acquiert une consistance aussi solide qu'avec la parafline.

On évitera la production de huiles d'air trop nombreuses dans l'enveloppe de celloïdine en versant lentement celle-ci sur la pièce et en pratiquant quelques piqûres d'épingle au moment de l'enveloppement. La pièce ainsi préparée est placée pendant quelques heures sous une cloche en verre, légèrement soulevée d'un côte' pour permettre l'évaporation de l'alcool et de l'éther.

On est parfois obligé de fixer la pièce, lorsqu'il s'agit de morceaux de membrane par exemple, sur le bouchon à l'aide d'aiguilles ou d'une goutte de collodion.

On enlève l'anneau de papier lorsque l'objet est devenu complètement solide; on donne alors au bloc de celloïdine, à l'aide d'un scalpel, la forme rectangulaire qui se prête le mieux à l'action du microtome (1).

(l) On peut aussi former «les blocs »le celloïdine ou de parafline à l'aide du cadre métal-

4() MÉTHODES d'inclusion

Lorsqu'on veut conserver aux coupes leur enveloppe de celloïdine, on se garde de les laisser trop longtemps dans l'alcool absolu, employé pour les déshydrater, car celui-ci dissoudrait la celloïdine. Aussi porterat-on les coupes, après coloration et lavage, dans l'alcool à 96*" qui leur enlèvera une grande partie de leur eau; puis, pour les en débarrasser complètement, très rapidement dans l'alcool absolu. Nikiforoff recommande, pour conserver le manteau de celloïdine, la déshydratation dans l'alcool absolu et l'éther à parties égales, c'est-à-dire l'addition à l'alcool d'un liquide qui s'y mélange bien, ne renferme pas d'eau et ne dissout pas la celloïdine.

L'essence de girofle dissout la celloïdine et est contre-indiquée ; on emploie en revanche les huiles de bergamote, de cèdre ou d'origan. Mais il est souvent nécessaire d'enlever d'abord la celloïdine de la préparation avant de colorer les coupes, surtout si l'on veut opérer avec l'aniline. On les porte alors, de l'eau ou de l'alcool dilué où on les avait placées après leur section, dans l'alcool absolu, puis pendant dix à quinze minutes dans un mélange d'alcool absolu et d'éther à parties égales, ou dans l'huile d'œillette; de nouveau dans l'alcool absolu, et finalement dans l'eau. Alors seulement on fait agir le colorant. Mais, comme les coupes celloïdinées offrent une certaine lenteur à l'action des colorants, on aura recours de préférence aux bains légers et prolongés.

Résumons les manipulations de l'inclusion dans la celloïdine et le traitement consécutif des pièces :

1° Durcir ou achever de durcir dans l'alcool absolu;

2° Laisser séjourner deunàcinq jours danslasolution faible de celloïdine ;

3° Laisser séjourner de un à cinq jours dans la solution forte de celloïdine;

4° Dessécher à l'air sur bouchon ou sur plaque de verre ;

5° Baigner dans l'alcool à 80^ vingt-quatre heures;

6° Faire les coupes ;

T*' Colorer, laver;

8° Déshydrater dans l'alcool à 96°, puis, pendant une à deux minutes, dans l'alcool absolu ou dans un mélange à parties égales d'éther et de chloroforme ;

9'^ Éclaircir dans l'huile de bergamote [de préférence], de cèdre, d'origan, ou dans le xylol [ou dans la créosote] (1);

lique de la station de Naples, dont les bras mobiles servent, par rapprochement ou par écartement, à constituer des rectangles de différentes grandeurs.

(1) Comme milieu éclaircissant de la celloïdine, Weigert emploie le mélange de :

Xylol 3

xVcide phénique. . 1 qu'il déshytrate comme l'alcool absolu.

MÉTHODES d'inclusion

10° Baume de Canada.

A cette méthode se rattache l'inclusion dans le collodion. On recouvre la pièce, sortie de l'alcool, d'une goutte de collodion élastique, exempt de traces d'huile de ricin, on la maintient quelques instants sur un bouchon, on verse une nouvelle goutte de collodion; après dessiccation, on porte le bloc dans un bain de vieil alcool, la pièce en bas; le durcissement complet se produit en quelques minutes.

II. Inclusion à la paraffine. — L'inclusion à la paraffine présente de nombreux inconvénients qui n'existent pas pour la celloïdine et qui en rendent l'application plus rare.

D'abord, il faut maintenir pendant quelque temps les coupes à 50°, puis les débarrasser de la paraffine avant de les traiter, de sorte qu'avec ce procédé on perd les avantapjes de l'inclusion, qui sont de maintenir en place les parties de tissus qui tendent à se détacher, et les exsudats. D'autre part, ce procédé se prête moins à la coloration en masse des pièces pathologiques, qui est si fréquemment employée. Il ne convient guère pour les fragments volumineux qu'il risque de désagréger.

On opère comme suit.

On durcit ou on achève de durcir les préparations dans l'alcool absolu [qui sert en même temps à les déshydrater; la durée du bain de déshydratation varie de un à trois jours].

De là elles passent dans un produit dissolvant la paraffine, tel que les huiles éthérées et surtout le xylol (I); puis on les porte dans un thermostat à 30", dans un mélange de paraffines se liquéfiant à cette température [les variétés de paraffine ont despoinls de fusion différents (2). Imprégnée de paraffine liquéfiée, la coupe est portée dans une petite boîte de papier carton ou un cadre formé de deux lames métalliques rectangulaires qui peuvent s'appliquer l'une dans l'autre. La pièce doit être immédiatement orientée dans la situation désirée, ce qui ne serait plus possible après, la paraffine, en se solidifiant, devenant opaque. On accélère cette solidification en immergeant le bloc dans l'eau froide. On fixe celui-ci dans la pince du microtome et l'on en fait des coupes sans mouiller le couteau.

(1) On peut aussi employer l'essence de girofle ou le chloroforme pendant un jour ; celui- (•i pénètre bien, mais rend la pièce légèrement cassante. Du chloroforme, la pièce passe dans le mélange de : Rarafiine 1 gr.

Chloroforme. . 5 »

Séjour : deux à dix heures. Il faut parfois un deuxième et nn troisième bain pour enlever les dernières traces du lirpiide d'imprégnation. Schiefferdecker emploie l'huile de bergamote.

(2) Il est bon d'employer un mélange de ces paraflines: ainsi, 10 gr. de celle fondant à 45o (molle)et 12 de celle à 52o (dure). En général, pourtant, on ne peut guère déterminer la proportion que par tâtonnements. Elle varie du reste aussi avec la température ambiante et la consistance de la pièce.

28 MÉTHODES ij'lNCH SLON

Les coupes sont portées dans lexyloi qui dissout la paraffine, puis dans l'alcool et dans l'eau, et finaleuïent, lorsqu'on n'a pas opéré la coloration en masse, dans les bains colorants.

Rèmmè. — L'inclusion à la paraffine comprend donc lesrègles suivantes :

1° Durcir ou achever de durcir dans l'alcool absolu ;

2° Vingt-quatre heures dans le xylol;

3° Une à douze heures à Tétuve à 50" dans la paraffine liquéfiée; 4° Orienter la pièce et solidifier la paraffine ; 5^ Faire les coupes; fi« Xylol ; 7° Alcool ;

8*^ Eau, colorants, etc.

En -général, les coupes à la paraffine sont trop fragiles pour qu'il soit possible de procéder d'emblée aux diverses manipulations de la coloration et du montage ; il est bon de les coller au porte-objet.

Collage des coupes à la paraffine. — 1. On dépose sur le porte-objet une couche mince du mélange a 3/1 d'essence de girofle et de collodion. Les coupes étant étalées et collées, on met le porte-objet pendant cinq à dix minutes dans un bain d'eau ou àl'étuve à GO'', puis dans un récipient plein de xylol, qui enlève complètement la paraffine [on peut aussi traiter par le chloroforme, après avoir fait sécher avec soin et laisser refroidir le porte-objet]; on monte alors les préparations dans le baume, si l'on a coloré la pièce en masse. Dans les cas où on n'a pas fait cette coloration, on passe le porte-oljjet du xylol dans l'alcool à 9G°, puis successivement dans l'eau (1), le colorant, le liquide de lavage, l'alcool et le xylol ; on monte finalement dans le baume. Outre le collodion à l'essence de girofle, il y a encore d'autres masses de collage.

2. Solution d'albumine. — Préparation : on bat en écume une quantité déterminée de blanc d'œuf et on y ajoute un même volume de glycérine. La masse est filtrée et portée en couche mince sur le porte-objet; on y étale les coupes; le porte-objet est placé quelque temps dans l'eau ou à l'étuve à 60^, pour solidifier la solution et faire adhérer les coupes.

On étend ce mélange avec un pinceau sur le porte-objet en couche très mince, et on y dispose les coupes en rangées, on les étale en les comprimant, pour empêcher l'interpositon de bulles d'air, on coagule l'albumine. On les porte dans le xylol, et ensuite dans Talcool absolu. Ce procédé contre-indique l'emploi de certains réactifs qui détermineraient le décollement: les acides forts et les alcalis. Le picrocarmin dissout aussi l'albumine. On pourra également se servir,

(1) Les récipients contenant les bains colorants où on plonge les porte-objets, sont des cylindres sans cols, à bouchon en verre, d'une hauteur inférieure à celle des porte-objets.

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par exemple, du carmin borate, dont on enlèvera l'excès au moyen de l'alcool chlorhydrique (à jl;^ ;!,'). 11 ne faut pas monter directement ces coupes du xylol dans le baume de Canada xylolé, car, l'albuaiine et la glycérine ne s'amaJgamant pas au xylol, il en résulterait des troubles. Le collage à l'albumine est actuellement d'un emploi très répandu.

3. Solution de gumme-laqce. — On fait une solution concentrée de ^■omnie-la(tue blanche dans l'alcool, on en étend arec une tige de verre une très mince couche sur le porte-objet préalablement chauffé ; on y presse les coupes pour les étaler. On place alors les porte-objets dans une petite boîte où on les expose aux vapeurs d'une petite quantité d'éther.

Traitement consécutif : bain d'eau ou étuve chauff'ée; xylol pour dissoudre la paraffine, etc.

Chun a simplifié le procède' de la manière suivante : il chaufl'e à la flamme le porte-objet et les coupes qui y sont étale'es, jusqu'à fusion de la paraffine ; la laque se liquéfie, de telle sorte qu'après refroidissement, les coupes sont incluses dans cette substance solidifiée. L'essence de girolle n'est pas employée.

Procédé de Gault et d'Allmann. Il est d'cpplication difficile, mais fournit de bons résultats. On étend de l'eau ou de l'alcool faible sur un porte-objet, on étale les coupes paraffinées, puis on enlève avec du papier buvard l'excès du liquide; on sèche la plaque à Tétuve à 35° pendant un jour, puis on la soumet pendant quelques minutes à une température supérieure à celle du point de fusion de la paraffine. Les coupes sont alors à même d'être soumises aux traitements variés.