V. Coloration des figures caryokinétiques
La mise en évidence des figures caryokinétiques réclame une technique spéciale, tant au point de vue de la conservation que de la coloration.
Tout d'abord, il faut que le fragment à examiner soit prélevé immédiatement après la mort et placé aussitôt dans le liquide fixateur. On l'y portera au plus tard une demi-heure après la mort ou après son ablation sur l'organisme encore en vie. Dans le cas contraire, le processus disparaît sans laisser de traces.
Seconde règle : le fragment a fixer sera aussi 7nince que possible; il ne dépassera pas 4 millimètres. Cette observation est d'autant plus importante que la plupart des liquides fixateurs pénètrent lentement dans les tissus.
Ceux-ci, fixés à l'état frais et en coupes très minces, par l'alcool ou le liquide de Millier, peuvent présenter les figures mitosiques, mais on obtient
de meilleurs résultats avec d'autres liquides. Le liquide doit dépasser notablement en volume celui du morceau à fixer, et sera renouvelé lors- ([u'il se troublera. Voici quels sont ces liquides spéciaux.
Liquide de Flemming, mélange chromo-acèto-osmifiue.
Préparation :
Solution aqueuse d'acide osmique à 2 0/0 4 pai-ties.
Solution aqueuse d'acide chromique à 1 0/0 15 —
Acide acétique 1 —
Si l'on employait cette liqueur pour la recherche de la graisse, il sullirait d'y ajouter une faible quantité d'acide acétique (0,3 à 0,5) pour rendre le protoplasma moins transparent.
Mode cC emploi [V).
A) 1*^ Séjour des fragments dans le li(£uide pendant 1 à 3 jours reposant sur un coussinet d'ouate placé au fond du récipient] ;
2'' Lavage dans l'eau pendant 3 à G heures ;
3" Durcissements successifs, clia([ue fois pendant un jour, dans l'alcool à 30'^, 60" et W ;
En général, inclusion dans la celloïdine.
B) Coloration dans la safranine.
1" Séjour d'une demi-heure à 24 heures dans la solution aqueuse de safranine à 1 0/0, puis lavage rapide à l'eau ;
2" Lavage dans l'alcool absolu acidifié (à 1 0, 0) avec quelques gouttes d'acide chlorhydrique ;
3'' Lavage dans l'alcool absolu et pur jusqu'à coloration rouge brun clair des coupes ;
■4° Huile. Baume de Canada.
La méthode de Flemming, avec coloration consécutive à la safranine, a l'avantage de colorer d'une façon très paie les noyaux en repos, mais d'une façon très vive ceux qui sont en mitose. Puis, il est possible de recimnaitre sous un faible grossissement, rapidement et avec une certitude sulhsante, les cellules en division, et de juger de leur situation et de leur nombre approximatif. Les ligures chromatiques prennent un ton rouge vif, alors que l'ensemble de la préparation se colore en lilas pâle. La plupart des autres colorants ne montrent pas de dilïérence entre les noyaux au repos et la structure des noyaux en division. Babès recommande la safranine dissoute dans l'huile d'aniline, qui agit plus rapidement : à 2 parties d'aniline il ajoute 100 parties d'eau avec un excès de
(1) L'acide osmicjuese vend, par quantité d'un demi-gramme ou un gramme, dans de petits tubes scellés à la lampe. Il est bon de préparer la liqueur chaque fois qu'on s'en sert; elle so décompose au bout de (pielque temps à l'air et à la lumière, et il faut la renouveler loi^que les pièces y ont séjourné assez longtemps.
poudre de safranine, il chauffe à 60'' et filtre; la solution se conserve pendant deux mois. Si l'on avait quelque motif de ne pas employer la safranine, on recourrait à la solution aqueuse de violet de gentiane ou à la fuchsine phéniquée.
Lorsqu'on veut colorer par Thématoxyline les coupes fixées dans le FlemminGj on emploie la méthode de Benda, qui est une imitation de celle que Weigert utilise pour les faisceaux nerveux à myéline.
Solution d'hématoxyline de Benda.
1° Porter les coupes dans une solution concentrée d'acétate de cuivre et les y laisser 21 heures à la température de l'étuve; Laver complètement;
3° Colorer dans la solution aqueuse d'hématoxyline à 1 0/0 jusqu'à ce que les coupes deviennent noires;
A° Décolorer dans l'acide chlorhydrique à 1/500 jusqu'à ce que les coupes deviennent jaunes ;
5° Neutraliser dans une solution saturée d'acétate de cuivre;
6° Laver;
1° Alcool. Huile. Baume de Canada.
Certains auteurs emploient une solution faible ou une solution forte de liqueur de Flemming, selon la consistance des tissus.
Yoici la méthode que nous avions vu employer au laboratoire de M. Van Bambeke et que nous avons employée nous-même avec le plus grand succès.
a {Préparation des pièces. — 1" Fixation dans la liqueur de Flemming ou de Hermann, pendant huit à dix jours ou plus :
Liqueur de Flemming :
Acide osmique à 2 0/0 4 parties.
Acide chromique àlO/0 16 —
Acide acétique glacial 1 —
Liqueur de Hermann :
Acide osmique à 2 0/0 4 parties.
Chlorure de platine àlO/0 16 —
Acide acétique glacial i —
2® Lavage des pièces pendant deux jours à Feau courante; 3" Alcool absolu pendant un jour;
4® Vinaigre de bois (acide pyroligneux) pendant un jour;
5° Lavage des pièces pendant un jour cà l'eau courante;
6<> Alcool absolu, un jour. Renouveler l'alcool absolu le lendemain. Les pièces peuvent y séjourner indéfiniment;
7"^ Solution d'alcool absolu et d'éther sulfurique à parties égales, un quarî d'heure ;
8° Solution faible de celloïdine dissoute dans un mélange d'alcool et d'éther à parties égales, quatre à huit jours;
9" Solution plus concentrée de celloïdine, quatre à huit jours;
10° Fixation avec orientation convenable des pièces sur un petit socle (en bois), en les entourant de la solution épaisse de celloïdine;
11° De'pôt du socle surmonté de la pièce sous une cloche de verre, 20 à 30 minutes;
12° Alcool à 82° : un jour suffit pour le durcissement;
13° Couper en mouillant le rasoir et les pièces avec l'alcool à 82°.
b) Coloration des pièces. — 1* Laver dans l'eau distillée ;
2° Coloration pendant une ou plusieurs heures dans un bain de :
Safranine, 1 gramme \ ^ partie
Alcool absolu, 100 grammes j ^ '
Eau distillée 2 —
3° Alcool absolu : quelques secondes (aussi longtemps que des nuages de safranine sortent des coupes) ;
4° Alcool absolu, 100 grammes; acide chlorhydrique, 1 goutte; quelques secondes;
5° Alcool absolu, quelques secondes;
6° Essence de girofle (qui dissout la celloïdine):
7° Baume de Canada.
Slblimé.
La solution aqueuse saturée de sublimé est aussi un bon moyen de fixation des figures nucléaires. On pratique surtout la méthode de Biondi- Heidenhain, qui colore en bleu violet les noyaux au repos, et en vert ceux qui sont en mitose.
Les pièces de un tiers de centimètre y sont fixées au bout de 1 à 3 heures ; on peut aussi se contenter de les plonj^er pendant quelques minutes dans une solution à 65°, mais l'action est moins régulière. Pour le traitement ultériear, voir chapitre m.
Les solutions fixatrices de sublimé sont modifiées par les auteurs de très nombreuses façons. A part le liquide de Lang, que nous signalons à la fin de ce chapitre, nous citerons les mélanges de Nikiforofî, de Rabl et de Mayer.
Solution de Nikiforoff (1) :
Solution saturée de bichlorure de mercure dans le sérum artificiel. . / ^ Solution de bichromate de potasse à 5 o/° i
La solution saturée de sublimé additionné d'acide acétique, donne des fixations nucléaires très précises, mais elle est inférieure à celle-ci au point de vue de la coloration ultérieure des vibrions; elle mordance moins les tissus. Les fragments sont pénétrés au bout de quelques heures, mais il est préférable de prolonger le bain jusqu'à un jour. Du liquide la pièce est portée directement dans les alcools à 70°, à 90° absolu, chaque fois pendant 24 heures.
Les coupes sont collées au moyen de l'alumine glycérinée de Mayer. (1) Cantacuzène, Destruction des vibrions cholériques. Paris, 1894, p. 28.
Solution de Rabl :
Solution aqueuse concenti'ée de sublimé 1
Solution aqueuse concentrée d'acide picrique 1
Eau distillée 2
1 vol.
Bain de 12 heures à quelques jours ; lavage à l'eau; alcool faible.
Tjquide fixateur de Mayer :
Bichlorure de mercure
Acide acétique
Eau distillée
7 grammes 2 volumes 100 grammes
1° Séjour des fragments, 24 heures; 2*^ Lavage à l'eau distillée;
3° Bain de 24 heures dans l'alcool à 70°, et de 24 heures dans l'alcool absolu;
4** Xylol 24 heures; mélange à parties égales de xylol et de paraffine àl'étuve à 55** pendant 12 heures ; bain de paraffine à 55° pendant 24 heures.
Les coupes faites par séries sont placées dans un bain d'eau tiède à la surface de laquelle elles s'étalent entièrement; puis on les prélève avec une bande de papier buvard placé au-dessous, et on les attaque sur la plaque de verre préalablement enduite d'eau albumineuse. Traitement consécutif par l'alcool absolu, le xylol, etc. (1).
Solution d'acide cuhomique.
On l'emploie en concentration de 0,3 à 1 0/0; les pièces y séjournent de 1 il plusieurs jours. L'acide chromique pénétrant très lentement, les morceaux doivent être fort minces.
Acide chromo-formique de Rarl.
FréjM ration. — Ajouter à 200 centimètres cubes d'une solution d'acide chromique à 0, 3 0/0, 4 à 5 gouttes d'acide formique concentré.
Fixation pendant 12 à 24 heures. Lavage soigné. Durcissement successif dans l'alcool à 30°, G0° et 96°.
Liquide fixateur de Fol :
Acide osmique à 1 0/0 2 volumes.
On emploie aussi l'acide osmique à ïétat de vapeurs pour fixer les petits objets : on place à cet effet, au fond d'un flacon, quelques gouttes d'acide osmique, et on suspend la pièce dans le récipient au moyen d'un fil. On peut colorer ensuite avec le carmin aluné ou l'hématoxyline. Les plus belles figures ainsi obtenues sont celles de la rétine.
Acide curomo-picrique :
Solution concentrée aqueuse d'acide picrique 10 volumes.
Acide chromique à 1 0/0 Acide acétique à 2 0/0. .
Eau
xVcide chromi(|ue à 1 0/0 Eau
(1) Zanarelli, Fièvre typhoïde expcrimentalc : Annales de l'Institut Pasteur, n» 4, avril I89i.
Liqueur de Lindsay Johnson :
Bichromate de potasse
Acide osmique à 2 0/0
Chlorure de platine à 2 0/0, Acide formique ou acétique.
65 parties
Henneguy ajoute ce dernier produi!; au moment de l'usage. Bain de 24 à 48 heures et lavage à l'eau. C'est un fixateur de premier ordre.
Méthode d'Altmann.
i° Fixation pendant une heure dans l'acide nitrique à 3 0/0;
2° Lavage soigné ;
3° Durcissement dans l'alcooL
Alcool.
L'alcool absolu est aussi un fixateur suffisant pour les fragments extrêmement fins. A chaud, son action est plus énergique et plus rapide. On colore d'après le procédé de Bizzozero-Vassale :
1° Coloration pendant dix minutes dans la solution d'Ehrlich au violet de gentiane :
\'iolet de gentiane 1 gramme.
Alcool 15 —
Huile d'aniline. ; 3 —
Eau 80 —
2" Lavage rapide dans l'alcool al)Solu:
'S" Séjour des coupes pendant deux minutes dans la solution iodoiodurée ;
4" Alcool absolu pendant 30 secondes ;
,y Acide chromique à 0. J 0/0, 30 à 40 secondes:
0'' Alcool absolu, ^0 à 30 secondes ;
7'^ Acide chromique à 0. 1 0 0, 30 secondes;
8° Alcool absolu, 30 secondes;
9'' Huile d œillet; la renouveler jusqu'à ce qu'elle ne prenne plus la. couleur.
La complexité et le prix élevé de l'huile d'œillet sont les désavantages de cette méthode.
Méthode de Baumgahten.
Elle mérite, comme fixatrice des figures mitosiques, une mentioa particulière, parce qu'elle peut être combinée avec la coloration des microbes.
1° Durcissement, pendant plusieurs semaines, dans la solution diluée d'acide chromique ;
2° Coloration pendant 5 à 10 minutes dans la solution alcoolique concentrée de fuchsine ;
2" Lavage rapide dans l'alcool absolu;
4"* Coloration, pendant 5 à 10 minutes, dans la solution aqueuse de bleu de méthyle.
L'emploi du bleu de méthyle, après celui de la fuchsine, a pour but de lixer le bleu sur la substance inlercellulaire, et de donner aux noyaux et aux figures de division nucléaire une coloration d'autant plus intense.
Si l'on veut colorer en même temps les bacilles, surtout ceux de la tuberculose, on fait séjourner la coupe, pendant vingt-quatre heures, dans l'eau d'aniline au violet de méthyle, on décolore dans l'acide dilué ; celui-ci n'est pas employé pour les autres microbes.
Méthode de Gham.
La coloration des microbes d'après la méthode de Gram est également applicable aux figures caryokinétiques. Les noyaux au repos sont décolorés, mais souvent d'une manière incomplète, tandis que des noyaux en division s'imprègnent vivement. ,
Liquide de Laxg :
Eau distilliie 100 grammes.
Il donne également de bons résultats. Il offre même sur le liquide de Flemming certains avantages appréciables; son prix est modique et on peut le faire agir sur des fragments un peu pins volumineux. Avoir soin de préparer un bain abondant, et de retirer du liquide au bout de vingt-quatre heures (LetuUe).
