IV. MÉTHODE DE Bl'NGE
1° Solution d'acide taniiique 3 parties
Solution de sesquiclilorure de fer au 1/20 i »
Prendre de ce mélange 10 c. c. et ajouter solution aqueuse concentrée de fuchsine, 1 c. c.
Laisser à l'air pendant quelques semaines, filtrer au moment de l'usage, y baigner les lamelles séctiées, pendant 5 minutes (au besoin chauffer légèrement).
2° Laver, sécher.
3° Colorer à chaud la lamelle par la fuchsine phéniquée, quelques minutes.
En terminant ce paragraphe, nous estimons qu il est utile de ne pas perdre de vue que de nombreux bactériologistes, très versés dans la technique, n'ont pu obtenir des résultats aussi nets que les auteurs dont ils mettaient les procédés en pratique. Si la pureté des couleurs joue évidemment un rôle dans quelques cas, l'explication de ces échecs laisse souvent à désirer.
B. Examen des microbes dans les coupes.
L'étude des microbes dans les coupes se pratique presque toujours après coloration préalable.
On porte, en général, les coupes directement de l'alcool absolu dans le bain colorant, qui est, dans la plupart des cas, au violet de gentiane.
Le plus souvent, on recourt aux méthodes des préparations par frottis, auxquelles on apporte pourtant, avec avantage, certaines modifications.
a) Il est presque toujours nécessaire de laisser les coiqm jjli/s lonf/temps dans le haiii colorant que les préparations sèches correspondantes.
h) Il est souvent utile de renforcer la coloration par la chaleur soit à fétuve, soit à la lampe à alcool : on laisse la préparation exposée à la llamme, jusqu'à dégagement de vapeurs de la surface du bain colorant.
c) Lorsque les noyaux ont été décolorés ou sont devenus moins nets. le procècU de la double coloration les mettra de nouveau en relief. Le carmin picro-lithiné, le picro-carmin et le brun de Bismarck sont alors indicjués.
d) Pour éviter ou diminuer la décoloration partielle des coupes, déterminée par la déshydratation dans l'alcool, on dissoudra dans l'alcool de déshydratation une petite quantité de la couleur employée. Mais, en général, cela est inutile si on colore au préalable assez énergiquement pour qu'une décoloration partielle soit même plutôt à souhaiter.
e) L'huile d'œillet, dissolvant les couleurs d'aniline, ne convient pas pour éclaircir les coupes, auxquelles elle donnerait une nuance sale. L'huile d'origan vaut mieux, mais le xylol mérite la préférence pour éclaircir les coupes renfermant des microbes.
Méthodes de coloration des coupes renfermant des microbes.
MÉTHODE DE LOEFFLER.
1° Coloration dans le bien de méthyle de Lœiller, 3 à o minutes;
10 à 30 secondes dans l'acide acétique de 0,5 0/0 à 1 0/0 ; 3*^ Déshydratation dans l'alcool; xylol, baume de Canada; Pour renforcer la coloration, on peut ajouter à l'acide acétique une (Quantité suflisante de tropéoline qui le rend ronge jaunâtre.
Coloration ai; violet de gentiane.
1" Coloration dans la solution aqueuse à 2 0 0, ou alcoolique forte de violet de gentiane, jusqu'à ce que la coupe soit violetfoncé; 2° Lavage dans l'alcool absolu jus([u'à coloration violet clair; 3° Xylol, baume de Canada.
Cette méthode donne en général de très ])ons résultats, surtout dans les coupes renfermant le bacille du cliarJK)n. Les bacilles ont une teinte foncée et se distinguent clairement des noyaux, qui sont nettement violet clair.
Il convient parfois de ])orter les cou])es, au sortir du bain colorant, et avant leur lavage dans l'alcool, dans l'acide acéti(iue à 0.5 0/0 pendant 10 à 20 secondes.
MÉTiiODi-: DK Gram.
Elle est plus longue que dans les préparai ions sur lamelles séchées. i*our em|)ècher le recoquevillement des coupes, on les porte avec une spdiule dans la solution d'iode, soit directement au sortir du l)ain coloi-anl, soit a[)i'ès leur passage pendant quehiues instants dans la solution de sel de cuisine; à 0,0 0 0.
On peut ensuite, avec avantage, faire la double coloration, de préférence au brun de Bismarck.
l" La c()u[)e décolorée dans l'alcool est portée, pour 2 à 5 minutes, dans la solution aqueuse ou alcoolique de brun de Bismarck;
2" On lave dans l'alcool absolu, jusqu'à ce que la coupe soit brun jaunâtre ;
3° Xylol, baume de Canada.
Méthode de Wfkjert.
1° Durcir la préparation dans l'alcool absolu ;
2° Colorer dans la solution saturée de violet de gentiane dans l'eau d'aniline, 5 à L5 minutes ;
3" Laver rapidement dans le sel marin àO,G 0/0;
4" Sortir la coupe- de la solulioii salée sur une spatule ou un purle-()l)jet, et la sécher avec précaution avec le papier à filtrer ;
5" La porter sur la spatule ou sur le porte-objet dans la solution i(xloi()durée pour 1 à 2 minutes ;
G" Sécher au papier à filtrer ;
7" Décolorer dans Thuile d'aniline, jus(j[u'àce qu'elle ne prenne plus la couleur ;
8° Enlever l'huile d'aniline à l'aide du xylol ; 9^ Baume du Canada.
Cette méthode fournit de belles images. Seules les bactéries, et quelque peu la fibrine, deviennent bleu foncé. Pour mettre le tissu en évidence, on colore pendant 3 minutes dans le carmin lithiné, on sort la coupe de l'eau qui a servi à enlever l'alcool chlorhydrique, pour la passer dans le violet de gentiane à l'eau d'aniline. Il faut au préalable colorer au carmin lîthiné, la méthode de Weigert souffrant de la déshydratation dans l'alcool.
Méthode de Kuhne au ulei: de métuyle.
1° Porter la coupe de l'alcool dans une solution composée de
pendant une demi-heure à 2 heures (^2 heures pour le bacille de la lèpre): 2" Laver rapidement dans l'eau ;
3" Laver dans l'eau acétihée : 2 gouttes d'acide chlorhydrique j)()ur 100 grammes d'eau jusqu'à coloration bleu pâle :
4" Laver dans une solution de carbonate de lithine : 6 à 8 gouttes de la solution concentrée de lithine pour 10 cent, cubes d'eau :
T)" Séjour dans l'eau pure, 3 à o minutes ;
0° Passer rapidement dans l'alcool absolu ;
7" Passer dans l'huile d'aniline au bleu de méthyle (on dissout la valeur d'une pointe de couteau dans 10 grammes d'aniline; avant l'usage, ou ajoute une quantité sulïisante de cette solution à l'huile pure d'aniline, pour lui donner la nuance désirée) ;
8° Huile d'aniline pure;
0' Passer par une huile éthérée, telle que le térébène; 10^ Xylol;
11» Baume du Canada.
Cette méthode au bleu de méthyle de Kiihne, un peu compliquée, est applicable à un assez grand nombre d'espèces microbiennes: en outre, les bacilles dilïiciles à colorer ressortent mieux par son usage. Si l'on [)eut
Bleu (le méthyle
Alcool absolu
Eau cai'bolique à o U/o
1 gr. n 10 aranuiies.
obtenir, outre cette coloration des microbes, une coloration plus nette encore des noyaux, on aura soin de ne pas laver dans l'eau acidifiée, mais d'employer, à la place de celle-ci, une solution aqueuse très diluée de bleu de chlorhydrine.
Méthode d'U.nna.
Comme la déshydratation dans l'alcool décolore complètement ou partiellement les microbes, Unna recourt au procédé suivant :
La coupe est portée du liquide décolorant dans l'eau et étalée sur porteobjet. L'eau est enlevée à l'aide du papier buvard et le porte-objet chauffé au-dessus de la flamme jusqu'à dessiccation. Après refroidissement, on inclut dans le baume de Canada.
Procédé de Letulle (l .
Cette méthode, fort simple et très sûre, est surtout commode pour la recherche du bacille de Koch dans les coupes.
i" Passer la lamelle par le Ziehl à chaud (eau d'aniline bouillante dans un ^îodet, ajouter solulion de Zielil, q. s. pour une teinte foncée). Laisser baigner la lamelle 10 à 20 minutes ;
2" Passer la lamelle dans un bain de permanganate de potasse à 1 gr. oO pour 100;
> La plonger aussitôt dans un bain de solution aqueuse concentrée d'acide sulfureux, fraîchement préparée ; 4" Laver largement à l'eau ;
I)" Renouveler autant que nécessaire ces deux bains successifs de permanganate et d'acide sulfureux fraîchement préparés ; G" Bain de bleu de méthyle (solution aqueuse; ;
7'' Passer un instant dans l'alcool absolu (ou dessécher simplement à l'air);
8" Passer au xylol ;
11" Monter dans le baume au xylol.
Ce procédé offre l'avantage de colorer vivement les bacilles tuberculeux et de ne pas laisser de poussières colorées dans le champ de la préparation. Les autres microbes sont vivement teintés en bleu.
Méthode de la tjiiomne imiémquée.
Llle a donné à son auteur de bons résultats dans certains cas. La thiouiue ou violet de Lauth est une tliioindamine.
Prcparalion :
Tliionine 0 gr. 50
Alcool al).,o;ii 10 »
Faire dissoudre et ajouter peu à peu :
Acide phéniqne 1 gr.
Eau 100 .»
(I: M. Lbtl'i.i.e, Pus et suppurai Ion. l*aris, 1894.
EXAMIiN DES MICROBES
Mode (V emploi :
1" Faire séjourner les coupes dans la solution pendant une minute ; 2° Déshydrater dans l'alcool absolu. Xylol. Baume de Canada. La chromatine se dessine avec une extrême netteté; le protoplasma ne se surcolore pas. Les microbes sont colorés en violet.
