C. — Préparation des coupes de cultures sur gélatine

On a, dans ces dernières années, recommandé plusieurs méthodes de préparation des coupes de cultures sur gélatine.

Pour cela, on extrait par piqûre la culture sur gélatine ou sur gélose ; on peut aussi chauffer légèrement le tube à réactif, ou bien le briser. Le bloc de gélatine ou d'agar est porté dans Talcool de 85° à 95% durci, fixé sur bouchon et coupé au microtome.

Xeisser recommande de porter les tranches pendant 1 à 8 jours, d'après leur volume, dans la solution à 1 0/0 de chromate double de potasse, et de les exposer à l'action de la lumière. On lave alors soigneusement dans l'eau, et on durcit dans l'alcool à 70°, puis à 95°.

On colore dans les solutions ordinaires d'aniline. La gélatine et l'agar [u'rdent leur coloration, aussi bien dans l'alcool que dans l'huile d'aniline. On agit de la même façon pour les cultures sur plaques que pour celles en piqûre.

Coloration de la capsule des microbes.

1! ne faut pas perdre de vue que les bactéries encapsulées perdent leur membrane lorsqit elles se multiplient en dehors de l'organisme ; ainsi, le pneumocoque de Friedlaender, le bacille te'tras'ène, celui du charbon bactéridieii, en culture, sont dans ce cas. On peut mettre la capsule en relief par un séjour prolongé de la préparation dans un bain colorant; on peut aussi décolorer eu partie les préparations sur lamelles par Tacide acétique dilué, de façon à n'atteindre que le protoplasma des microbes, en respectant leurs noyaux.

I. Méthode de Johne. — Les lamelles sont préparées avec du sang de rate (charbonneux) :

l'' Coloration dans la solution aqueuse de violet de gentiane à 2 0/0, 1/4 à 1/2 minute ;

2° Décoloration dans une solution aqueuse d'acide acétique à 1/2 ou mieux à 1 0 /O, 6 à 10 secondes ; T Lavai^e et examen dans Feau.

II. Méthode de Gratia. — Les décolorants faibles, tels que Falcool, l'eau chaude, Féosine en solution aqueuse ou alcoolique, ont fourni de bons résultais dans les préparations de bactéridie charbonneuse :

1" Coloration rapide des lamelles séchées à la fuchsine à 1 0/0 ;

Décoloration pendant quelques secondes dans Falcool de ^0." à 70°; Lavage et examen dans Feau ou la glycérine.

I^XAMEX DES MICROBES lOi

Voir plus loin la méthode de Ribhert pour la coloration de la capsule du microbe de Friedlaender. Voir aussi celle qui est relative au microbe de Fraenkel.

• I). — Coloration des spores.

Les spores constituent des granulations claires, très brillantes, soit à l'intérieur soit aux extrémités des bacilles. Elles se distinguent de ceuxci en ce qu'elles prennent les couleurs beaucoup plus difficilement et acquièrent, si l'on emploie les méthodes ordinaires de coloration, l'aspect de granulations incolores. Par contre, la couleur une fois fixée, elles la cèdent plus difficilement. C'est sur ces faits que repose la méthode de coloration des spores.

On les colore pendant un temps plus long par la chaleur, dans la fuchsine à l'eau d'aniline ou la fuchsine pliéniquée, puis on les traite rapidement par un acide minéral qui décolore le corps du bâtonnet, mais fient la spore colorée. En lavant ensuite dans l'eau et en employant une coloration de contraste pour les microbes déjà décolorés, de préférence le Ijleu de méthyle, les spores qui, comme les bactéries, n'ont pas pris la coloration bleue, restent rouges. Mais, actuellement, cette méthode ne réussit bien que pour les préparations sur couvre-objet.

Résumé des manijJidafions.

1" Frotter le liquide à examiner sur un couvre-objet. Sécher à l'air et I)asser trois fois à la flamme ;

2° Colorer pendant 20 à 40 minutes dans la solution de fuchsine à l'eau d'aniline chaufl'ée ou dans le carbol-fuchsine ;

3'' Décolorer dans l'acide nitrique à 5 0/0, 1 minute ;

4^ Laver dans l'eau ;

Colorer dans le bleu de méthyle de Loefïler, 2 minutes ;

6° Laver à l'eau ;

7° Sécher sur papier à filtrer ;

H" Baume de Canada.

On peut aussi obtenir une coloration isolée des microbes en passant la préparation sur couvre-objet un grand nombre de fois à travers la flamme (10 à 30 fois), ou en la portant à l'étuve à 200", puis en la colorantdans une solution aqueuse de bleu de méthyle de préférence. Les noyaux et les microbes perdent par le chaufî'age leur propriété de coloration, tandis que les spores se colorent plus facilement.

MÉTUODE de Moeller. — Elle est basée sur ce fait que la capsule se laisse imprégner plus facilement par la macération.

1° Passage de la lamelle séchée 3 fois dans la flamme ou fixation dans l'alcool absolu ;

102 EXAMEN DES MICROHES

2° Bain de chloroforme, 2 minutes ; 3° Lavage à l'eau;

4° Bain d'acide chromique à 5 0/0, 1/2 minute à 1 minute ; 5° Lavage à l'eau ;

6"" Coloration dans le carbol-fuchsine, chauffage au-dessus de la flamme et ébullition pendant 1 minute ;

T*' Décoloration dans l'acide sulfurique à 50/0, et lavage soigné à l'eau ;

8° Coloration, pendant 30 secondes, dans la solution aqueuse de bleu de méthyle ou dans le vert de malacliite et lavage à l'eau. Baume.

La méthode de Loeffler pour la coloration des cils est aussi applicable dans l'espèce.

Czapleîcsici se sert de cultures un peu âgées, colore pendant plusieurs heures dans le Ziehl chaufïc, décolore dans le bisulfite de soude, et colore à nouveau dans le bleu de méthylène phéniqué. Les spores sont rouges.

E. — Coloration des différentes espèces de microbes pathogènes. Microcoques de la suppuration.

Les difîérentes variétés de cocci qui se rencontrent dans le pus sont les staphylocoques 2^1/ofjenes doré ^ritrin, jaune et Nanc, et le streptocoque ^njogène^ qui se colorent fort bien par les solutions aciueuses d'aniline, surtout avec le violet de gentiane et le bleu de méthyle de Loeffler.

Ils prennent également le Gram, ce qu'il est important de rechercher pour les distinguer des nombreux corpuscules du pus qui afiectent la forme de ces cocci, mais sont décolorés. Cette méthode de difTérenciation est aussi applicable à d'autres cocci qui ont le même aspect.

On traitera aussi les coupes par le Gram suivi de l'application du brun de Bisiuarck ou de la solution de Weigert, avec coloration préalable au carmin lithiné.

Il faut remarquer que les cocci existent non seulement dans les abcès et les phlegmons, mais aussi dans les foyers d'ostéomyélite, de pyémie. d'endocardite aiguë, de périmétrite, de méningite suppurée, etc.

Streptocoque de l'érysipèle.

Morphologiquement, il est analogue au streptocoque pyogène et se comporte d'une façon identique vis-à-vis des colorants. Il prend également le Gram.

Bacille pyocyanique.

C'est uu bâtonnet ^'rèle, qui se caractérise surtout par ses re'actions colorantes dans les milieux de culture.

Mirroroquc tétragùne.

On le rencontre dans les- cavernes tuberculeuses, les abcès, etc. Il prend le lira ni.

Gonocoques.

Les gonocoques se rencontrent surtout à l'intérieur des globules dsi pus ; cette localisation caractéristique simplifie le diagnostic. L'examen se fait sur un couvre-oi)jet sur lequel on a étendu le pus de la muqueuse urétbrale, cervicale de l'utérus, tubaire ou conjonctive.

On colore avec les solutions aqueuses. Les gonocoques ne prennent pas le Gram, ce qui est important pour le diagnostic difTérentiel (1).

On obtient une doudie coloration par la méthode suivante :

1° Colorer pendant "2 à 3 minutes dans la solution alcoolique d'éosino, et même à chaud ;

"l" Absorber l'excès d'éosine avec du papier à filtrer ;

3° Colorer dans la solution alcooli(pie de bien de méthyle, 1/2 minute ;

i° Lavera l'eau ;

5'' Sécher sur papier à filtrer. Baume de Canada; Les cocci sont bleus, les cellules rouges. J. Schiictz recommande la méthode suivante .

I" Cob^rer la préparation sur couvre-objet dans une solution saturée de bbui (k^ méthyle additionnée d'acide carbolir[ue à 5 0/0, o à 10 minutes;

2" Passer pendant 3 secondes par l'eau acéti(£ue ; acide acétiqu(i dilué 5 gouttes, eau 20;

3° Laver complètement à l'eau ;

1° Colorer consécutivement dans la solution très diluée de safranine.

Méthode de Legrain. — On colore avec la solution d'Ehrlich, puis on passe par le l^ugol, et par l'alcool. Ce dernier de'colore d'abord les cellules e'pithéliales, puis les noyaux des cellules du pus, ceux des cellules épithéliales, les gonocoques, et finalement les saprophytes de l'urèthre. Si on dépose une seule goutte d'alcool sur la lamelle, seules les bactéries restent colorées. On examine alors un point de la préparation et l'on fait passer un peu d'alcool entre la lame et la lamelle; on voit que les gonocoques, dans le cas où ils existent, se décolorent et disparaissent.

Tonton recommande de colorer les coupes par la fuchsine carbolique et de laver ensuite à l'alcool.

i l) On trouvera dans V Allas d'Eisenberg les procédés qui permettent de diagnostiquer les espèces autres que le gonocoque, et que Ton rencontre le plus souvent dans le pus des blennorrhagiques.

Pneumocoque de Fraenkel-Weichselbaum.

J.c (liplocofjue lancéolô do Fraonkol-Woichsell)aiim se inoiilrc le plus souvent clans la pneumonie ; il est entouré d'une capsule ([ui ne se colore pas par les méthodes ordinaires. Mais il n'existe pas seulement dans le poumon atteint de pneumonie croupale, mais souvent aussi dans les végétations de l'endocardite récente et dans le pus de la méningite cérébrospinale. Il se colore avec les solutions aqueuses ordinaires. La fuchsine carbolique (fuchsine 1, acide carbolique à 5 0/0 100) réussit aussi fort bien. Un séjour prolongé de plusieurs heures dans la solution colore les cocci en rouge vif et donne à la capsule une légère teinte rougeàtre.

Le pneumocoque de Fraenkel-Weichsell)aum prend aussi le Gram, ce qui le distingue de celui de Friedlaender.

Le procédé le plus simple et le plus efficace pour co/orer la capsule est le suivant : « On laisse le liquide de métal 2 minutes en contact avec la lamelle enduite de crachats pneumoniques. On lave à l'eau et on décolore rapidement, en plongeant à plusieurs reprises la lamelle dans l'eau acidulée par l'acide acétique (i goutte d'acide pour un verre de montre plein d'oau).

11 se colore très bien avec les solutions aqueuses, mais ia capsule reste incolore. Il ne prend pas le Gram.

Pour colorer la capsule dans ces coupes, on procède comme suit : 1° Colorer pendant 24 heures à chaud dans le mélange de :

2° Laver dans l'acide acétique à I 0/0 ; 3** Alcool ;

4^ Baume de Canada.

La capsule se colore ainsi en bleu pâle, la partie centrale en bleu foncé. Lorsque le degré de décoloration n'est pas suffisant, la capsule est également bleu foncé.

Friedlaender a imaginé la méthode suivante pour les préparations sur lamelles :

1° Passer la préparation trois fois à la flamme, et la placer pendant quelques minutes dans l'acide acétique ;

2° Enlever l'acide par l'insufTlation avec un tube en verre, et sécher rapidement à l'air ;

Bacille encapsulé de Friedlaender.

Solution alcool, concentrée de violet de genliane

Eau distillée

Acide acétique

50 grammes

3° Colorer pendant quelques secondes dans la solution saturée de .gentiane anilinée ;

4° Laver dans l'eau; sécher sur papier à filtrer; l)aume de Canada. MÉTHODE de; Ribbert (pour la coloration de la capsule). 1° Colorer pendant quelques minutes dans la solution saturée à chaud de :

Dahlia.

Eau 100 grammes.

Alcool oO »

Acide acétique 12 gr. o.

Laver dans l'eau, sécher. Baume de Canada. Les bacilles deviennent bleu foncé, la capsule bleu clair. Si la solution colorante agit trop longtemps, la capsule devient également bleu foncé, et la distinction d'avec les cocci n'est plus possible.

Sarcina ventriculi.

On colore avec les solutions aqueuses d'aniline. La surcoloration se l)roduisant facilement, on recourra au brun de Bismarck en solution diluée.

Il existe plusieurs variétés : jaune, blanche et rouge. Par la solution di' chlorure de zinc iodée, les capsules deviennent violet rouge ^Friedlaender-Eberth).

Bacille du charbon.

Ce ])acille se colore fort bien dans les solutions aqueuses ordinaires. Il [U'cnd également bien le Gram.

C'est par cette dernière méthode ([u'on colorera les C()up(*s. ([ui seront ensuite traitées parle brun de Bismarck, ou la solution de Weigei-t, avec application préalable du carmin lithiné. Mais c'est surtout dans les préparations en coupes de ce microbe (jue la solution acjueuse concentrée de violet de gentiane, avec lavage consécutif dans l'alcool absolu, donne de très bonnes images. Les noyaux sont bleu clair, et le bacille bleu foncé.

La coloration des spores se fait de la manière indiquée plus haut. ^Nous avons exposé les méthodes de coloration de la capsule de la bactéridie charbonneuse].

Bacille de l'œdème malin.

11 est plus grêle que celui du charbon, auquel il ressemble beaucou[). Il se colore dans les solutions aqueuses de violet de gentiane, mais ne prend pas le Gram.

FAAMEN DES MICROBES

Bacille de la diphtérie.

Dajis les membranes diphtériques on trouve de no'mbreuses espèces (le cocci ('( de bâtonnets, qui prennent fort bien les couleurs ordinaires. I. (je nier a (h'crit un bacille, court et légèrement recourbé, qui se colore (rès facilement par le bleu de méthyle de Loeffler, et qui a une grande importance étiologique. Il se décolore plus ou moins par le Gram (1).

Roii.v et Ycrsin ont imaginé une méthode qui donne les meilleurs résultats; ils conseillent le bleu composé de violet dalhia et de vert de me'Lhyle. On mélange 1 partie d'une solution aqueuse à 1 0/0 de violet h. 3 parties d'une solution aqueuse de vert à i 0/0, et on ajoute assez d"eau pour avoir une belle teinte bleue, pas trop foncée. Cette liqueur se conserve limpide pendant très longtemps; elle ne donne pas de précipité. — Cependant, tous les colorants dilués donnent de bons résultats. Il suffit de frotter le tampon chargé de débris sur une lamelle ou un fragment de fausse membrane, de sécher, de passer à la llamme, puis dans un réactif dilué, et de laver à l'eau.

Bacille du rhinosclérome.

Le bacille qu'on a trouvé dans le rhinosclérome possède une capsule semblable à celle du microbe de Friediaender, d(mt il se distingue en ce qu'il prend le Gram.

Méthodes de Wolkowitscii.

A. Coloration des coupes.

Bain de 2i à 48 heures dans le violet de gentiane à l'eau d'aniline;

2" Lavage à l'eau ;

3'^ Solution iodo-iodurée, 1 à 4 minutes; A" Alcool absolu ;

5" Essence de girofle, qui dissout assez bien la matière colorante.

Au lieu de la solution iodo-iodurée, on peut aussi employer la solution aqueuse alcoolique d'acide picrique; on n'y fait séjourner les coupes que (quelques secondes, parce qu'elles se décolorent plus rapidement.

Mais les capsules ne se colorent bien que dans les préparations durcies à l'alcool.

D'après Wolkowitsch, les masses hyalines du rhinosclérome se colorent

(() Le diagnostic se pratique au moyen de plaques de Pétri contenant soit de Tagar gl}'- C(^riné, soit de l'agar ordinaire. L'examen de la plaque se fait dans le microscope et peut ctre pratiqué déjà dix heures après l'ensemencement. En ce qui concerne l'ensemencement, on se sert, pour la pratique ordinaire, de flacons de sérum et de petits tampons stérilisés contenus dans des enveloppes de papier fort. Comme tampon, on emploie « des parcelles d 'éponge fine, de la grandeur d'un pois. On saisit le tampon entre les mors d'une pince, rapidement stérilisée, on promène doucement à la surface des parties malades, qu'on évite de faire saigner par une application trop brusque. Le tout est remis sous enveloppe et envoyé aussitôt au laboratoire, où l'examen est pratiqué au moyen de plaques d'agar. « (Funck.)

d'une manière intense avec le J)leii de méthyle et la fuchsine, fai])lenieii( avec lasafranine, très bien avec l'éosine, mais sont insensi})les à riiématoxyline. Par contre, la double coloration à l'hématoxylinc et à Téosine donne de très bons résultats.

B. Coloration des préparations de culti res.

1° Sécher, etc;

2° Acide acétique à 1 0/0, quelques secondes; S*^ Sécher ;

-4" Solution forte de violet de gentiane à l'eau d'aniline, 1 minute; 5" Laver à l'eau ;

6" Quel([ues secondes dans la solution d'éosine à 1 ou i 0/0 ; 7" Bain d'alcool à GO"; 8° Eau ;

9° Sécher. Baume de Canada.

Méthode de Stepanow pour les coi i'es.

P Colorer pendant J i à 1 heure dans le violet de gentiane phéniqu('>, ou pendant 24 à 36 heures dans le bleu de méthyle de Lœfïler ;

2° Décolorer très rapidement dans l'alcool acétique à 1/4 ou J /5 0/0, ou simplement dans l'alcool.

Bacille de la morve.

Les préparations de frottis sur couvrcî-objet se colorent, mais d'une façon peu intense, dans les solutions aqueuses simples d'aniline. Les solutions alcalines valent mieux ; de même la sokition de violet de gentiane à l'eau d'aniline, à laquelle on ajoute son volume de la solution de potasse à 1 p. 10 000. Le mélange doit toujours être préparé « extempoi anément ». Avant de laver, on peut passer rapidement par une solution faible d'acide acétique (1 0/0), additionnée d'un peu de tropéoline, ce qui décolore complètement le protoplasma cellulaire, en partie au moins les noyaux, et fait ressortir d'autant mieux les microbes. Ce bacille ne prend pas le Gram.

MÉTHODE Ï)E LOEEiaER.

1'' Colorer pendant 5 minutes dans la solution alcaline de bleu de méthyle ou dans la solution de violet de gentiane anilinée et additionnée dépotasse;

2^ 1 seconde dans l'acide acétique coloré en jaune clair par la tropéoline ;

3° Laver rapidement dans l'eau distillée ; 4" Alcool, huile, baume de Canada.

Les coupes sont colorées de la même manière ; mais, pour la décolora-

lion partielle, on les porte pendant 5 secondes, non pas dans la (ropéoline acétique, mais dans cette solution :

Eau distillée 10 grammes.

Acide sulfureux con(;entri' 2 gouttes.

Acide oxalique à 5 0/0 1 goutte.

Il est aussi très utile de placer, avant coloration, les coupes, pendant quelques minutes, dans la solution de potasse à 1 p. 10 000.

Mais cette méthode ne donne pas une coloration tout à fait isolée du bacille de la morve.

KuiiNE recommande celle du bleu de méthyle. On peut la combiner avec une double coloration en ajoutant un peu de safranine à l'huile de téré- J)enthine employée comme éclaircissant.

MÉTHODE DE ScilUTZ POUR LES COUPES :

I" Colorer pendant 24 heures dans :

Solution alcoolique conc. do bleu de méthyle.. ) .• . -, Lessive de potasse \ ^^'^''^

2" Laver dans l'eau acidifiée ; 3^ 5 minutes dans l'alcool à 50° ; A° 5 minutes dans l'alcool absolu; 5° Huile de cèdre. Baume de Canada.

Mais toutes ces méthodes ont l'inconvénient de colorer simultanément les tissus avec excès ou de décolorer les microbes d'une manière trop intense. Le procédé suivant remédie à ces désavantages.

MÉTHODE DE NONIEWICZ :

1° Colorer pendant 2 à 5 minutes dans le bleu de méthyle de Loefiler : 2" Laver dans l'eau distillée ;

3° Décolorer pendant 1 à 5 secondes, selon l'épaisseur de la coupe, dans une solution de :

Acide acétique à 1 0/0 75 parties

Solution aqueuse de tropéoluie à 1/2 0/U 25 »

4" Laver dans l'eau distillée;

5" Étaler sur porte-objet, déshydrater la coupe d'abord avec du papier à filtrer, puis à l'air ou au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool:

6" Eclaircir par le xylol, versé goutte à goutte; l'essence de girofle et les huiles d'origan et d'aniline sont contre-indiquées ;

7° Baume de Canada.

Les bacilles de la morve prennent une teinte bleu sombre ou noir, et les tissus deviennent bleuâtres.

La méthode de Nikiforoff pour la coloration du spirille de la fièvre récurrente convient aux coupes de la morve.

Bacille du tétanos.

Il se colore bien par les di{férenLes couleurs d'aniline, et par la mé- 11 10 de de Gram.

Bacille du charbon symptomatlque.

Il se colore également bien par les couleurs d'aniline; il ne ])rend pas le Grani.

Bacille de la septicémie des souris. — Bacille du rouget du porc.

Ces deux microbes présentent des caractères presque identiques au point de vue de la morphologie et de leurs réactions vis-à-vis des colorants. Ils se colorent facilement dans les solutions aqueuses et prennent le Gram.

Bacille de l'influenza. B. de PfeifTer.

C/csL un petit bâtonnet, ressemblant à un diplocoque, trouve' dans les expectorations bronchiales, dans les sécre'tions des muqueuses nasale et pliaryii;L,'ée des malades atteints d'iniluenza. Il ne prend pas le Gram et la plupart des cololants a^'issent diliicilement.

Coloration, i" Colorer pendant quelques heures à 37", ou toute une nuit à la température ordinaire, les préparations de sang sur lamelles enlerni<''csdans un récipient, par la solution de Chenzinsky :

Solulion a.f|ueuse concentrée ^\^^ bleu de méthyle iO grammes.

Solution IVaiclie deosine ii 12 (>/() dans l'ali ool ù "ÎOo. 20 » l-'au distillée iO »

2" Laver à l'eau ;

.'i" Sécher. Baume.

Aulri; liquide de coloration :

lo Solution au 2 millième de sublimé 10 cent, cubes.

Solution alcaline au 10"^ de violet île luélliyleou de luclisine. 1 cent. cube.

2" Laver à l'eau ; 3° Sécher. Baume,

Bacille de la rougeole.

11 a été trouvé dans le sang et dans le nuicus du nez et de la conjonctive, ('/est un bacille ayant parlois la grandeur d*uu microcoque, et parfois celle d'un jj:lobule rou;;e ; plusieurs points restent souvent incolores.il prend le (iram. Pour le colorer, on plonge la lamelle pendant deux ou trois secondes dans le mélange de :

Solution aqueuse concentrée de bleu de méthyle. Solution d'éosnie à 1/4 0/0 dans l'alcool à lO»

80 grammes.

KXAMEN DES MICROBES

Beaucoup d'auteurs contestent la spe'cificité des microbes de la rougeole et les rattachent à des infections secondaires ou accidentelles.

Microbes de la coqueluche. — On trouve un grand nombre de microbes dans les crachats des coquelucheux, mais leur importance étiologique n'est pas prouvée.

Bacille de l'ozène.

Pour Loewenberg, on retrouve constamment dans le mucus nasal des ozéneux un cocco-baoille (nous avons eu l'occasion de faire des réserves à cet égard) ressemblant à un pneumobacille de Friedlaender. Si l'on colore à la fuchsine une couche mince de sang des animaux morts à la suite de l'injection, les capsules restent généralement blanches, tandis que la solution de Ribbert les teint presque toujours admirablement. Tls ne se colorent pas par le (iram.

Bacille typhique.

Un le renr.ontre chez les typhiques dans la muqueuse intestinale, dans l'appareil folliculaire, dans les glandes mésentériques, dans la rate, dans le foie, dans les déjections, etc. Il ne prend pas le Gram.

Les préparations sèches sur couvre-objet se colorent facilement dans les solutions aqueuses ordinaires, surtout dans la fuchsine. On lave à l'eau, et non à l'alcool. Dans les coupes, le bacille typhique se distingue d'une série de bacilles de la putréfaction, avec lesquels il présente une U'ès grande ressemblance morphologique, mais il ne se colore pas d'une façon aussi intense qu'eux. Les meilleurs colorants des coupes sont le bleu de méthyle de Loeffler et la fuchsine carbolique. Il faut laisser les coupes pendant 21 heures dans le bain colorant et laver simplenienl à l'eau, l'alcool décolorant facilement. Ou bien il faut laver pendant plusieurs heures, dans l'eau faiblement acétique, 1 0/0 ; le bacille est coloré en rouge foncé sur fond rose; souvent il existe au centre un espace ovoVde ou rond, non coloré, contrastant avec les extrémités teintées : foi-me de navette.

On prend parfois, dans les coupes de tissus, des masses bacillaires de la putré faction pour des colonies de bacilles typhiques. Mais il suffit de soumettre les coupes au procédé de Gram qui décolore ceux-ci et colore ceux de la pulre'faction Les cils sont très nombreux ; les méthodes de coloration ont été exposées plus haut.

Colibacille.

il ressemble au bacille d'Eberth morphologiquement et comme lui ne prend pas le Gram, mais il ne porte que quelques cils. On le colorera donc par l'aniline en solution hydro-alcoolique ; il prend bien le bleu de Ivuehne et le rouge de Ziehl-Kuehne.

Bacille de la syphilis.

I. LuTSGARTEiX a précoiiisé la méthode suivante, pour colorer le soidisant bacille de la syphilis [dont la spécificité n'est j)as admise j :

1" Colorer pendant 24 heures à la température ordinaire, puis pendant :2 heures à l'étuve à 40", dans le violet de gentiane à Teau d'aniline ;

±" Laver dans l'alcool absolu, 2 à 3 minutes ; Décolorer dans :

a) une solution aqueuse à 1/2 0/0 de permanganate dépotasse. 10 secondes, puis dans :

h) une solution a([ueuse d'acide pur, quelques secondes; 4° Laver à l'eau ;

5" Alcool, essence de girolle, baume de Canada au xylol.

En général, la coupe n'est pas complètement décolorée après avoir été passée à l'eau; la décoloration doit alors être répétée plusieurs l'ois.

On peut employer une coloration complémentaire à la salranine.

IL MÉTHODE DE GiACOMi. — 1° Colorcr pendant plusieurs nn'nutes à (•haud dans la fuchsine à l'eau d'aniline;

2" Laver dans la solution aqueuse très diluée de perchlorure de ter ((juelques gouttes de la solution de fer dans un récipient rempli d'eau) :

3** Décolorer dans la solution de chlorure de fer concentrée ;

4** Laver dans l'alcool absolu.

Doutrelepont colore pendant i8 heures dans la solution aqueuse de violet de méthyle et décolore delà même manière que Giacomi.

Le bacille de LustgarLen ayant les mêmes réactions que celui de Kocli, Levv y les colore simplement par la même méthode (liquide de Ziehl et acide sulfurique).

Les bacilles qu'on rencontre dans le sinegma preputii se colorent aussi [)ar la méthode de Lustgarten.

D'après Lewy, le bacille du smcgm<i preputii se distingue par plusieurs caractères de celui de la syphilis, et surtout par ce fait qu'il est réfractaire à la me'thode de Doutrelepont. Les bacilles du smegma décrits par Alvarey et Tavel sont décolore's en moins de deux minutes par l'acide acétique glacial, tandis que le bacille de la tuberculose re'siste plus longtemps à son action.

Bacille du chancre mou.

[Ce bacille, découvert par Ducrez (de Naples), se présente en chaînettes composées d'éléments gros et courts, et plus souvent en amas. La

iiH'diodo la plus pratique a été recommandée par Nicolle (Wurtz).

a) Examen dti j)us. — Ou racle légèrement la surface de l'ulcération, en (■'[(Midaut, sans l'écraser, le pus entre deux lamelles. On sèche et on fixe dans le li({uide de Meyer :

Siililinu' 7 irrammes.

t:au .lisiiUre 100 " »

Acide acétique cristallisaljle 1 gramme.

On colore avec le violet de gejitiane pendant 1 /3 ou 1/2 minute. On lave et on examine à l'eau.

Les noyaux et les globules blancs sont c(jlorés en violet, les hématies non teintées, les cocci et les bactéries de la peau fortement violets, et les bacilles de Ducrez (extra et intraleucocytaires).

h\ Col oral ion <lu l>nnlle dans les coiqies. — Immédiatement après l'excision, la j)ièce est laissée pendant 24 heures dans la solution suivante :

Siihlinié 3 gr. 5

l-:a.i (lislillée 100 »

Acide aeéliiiue (-ristallisable 1 gramme.

On lave pendant 24 heures à l'eau courante. On déshydrate la pièce, coupée en morceauxde peu d'épaisseur, dans l'acétone, pendant 48 heures, en renouvelant 3 ou 4 fois le liquide. Séjour des pièces dans le xylol 24 heures, puis 48 heures à 55° dans un mélange à parties égales de xylol et de paratïine, 24 heures dans la paraffine. Les coupes, étant collées, sont laissées 2 à 3 minutes dans la solution de :

lîleu <le toliiiiliiie 50 centigrammes.

Alcool ahsoln 10 grammes.

Faire diss!)udr(^ et ajouter peu à peu :

l'^aii 100 grammes.

Acide i)iiéni(|!ie 1 gramme.

Traiter ensuite les coupes, pendant quelques secondes, par une solution de tannin (jui rend la matière colorante insoluble) :

Taniiin à rélluM- 1 gramme.

l'ail distillée 10 grammes.

Xylol, l)aum(\j

Bacille de la tuberculose.

La méllnxh; de coloration des bacilles de la tuberculose repose sur un principe atudogue à celui que nous avons indiqué pour les spores. Lors- (ju'ils ont été colorés, les bacilles conservent leur coloration, même quand on les traite par les solutions concentrées d'acides minéraux, alors que toutes les autres parties de la préparation, avec les microbes qu'elle ren-

EVAMEN DES MICROBES H 3

ferme, se décolorent. Si Von emploie ensuite une seconde couleur d'aniline en solution aqueuse simple, d'un ton différent, les noyaux et les autres microbes prennent cette dernière teinte, tandis que ceux de la tuberculose conservent la première.

La solution dont Koch faisait usage était composée d'une lessive de potasse. Actuellement, on se sert surtout des solutions où entre l'huile d'aniline ou l'acide phénique. On emploie la fuchsine à l'eau d'aniline ou la fuchsine phéniquée avec application consécutive de bleu de méthyle, ou bien du violet de gentiane dans l'eau d'aniline, ou bien encore le violet de gentiane à l'eau phéniquée, avec coloration consécutive au brun de Bismarck.

Ehrlich à émis l'hypothèse que les bacilles de la tuberculose ont une capsule qui se laisse pénétrer par les solutions alcalines et non par les acides. Si cette hypothèse n'est pas tout à fait exacte, elle rend cependant bien compte de ce fait que ce bacille, après avoir été coloré par les solutions alcalines, devient résistant à l'action des acides.

Il y a quelque temps, on a simplifié la coloration du bacille en mélangeant l'acide minéral à la solution de bleu de méthyle, et en obtenant dans une seule manipulation la décoloration et la coloration de contraste (B. Fraenkel, Gabbet).

On a aussi constaté ([ue, même à froid, la fuchsine carbolique colore très rapidement et d'une façon suffisante le bacille de Koch.

Les mêmes méthodes s'appli([ucnt aux préparations sur lamelles et aux coupes, avec cette différence que ces dernières doivent séjournerdans le bain colorant pendant :ii heures ou au moins être soum ises à la tempéra ture de l'étuve.

En ce qui concerne l'examen des crachats, on prélève avec une pince les parties grumeleuses qu'on étend ensuite en couches très minces sur un couvre-objet; le porte-objet chargé peut être recouvert d'un second (jui sert à étendre la masse en les frottant l'un contre l'autre ; on sèche à l'air, on passe trois fois à la lamelle pour la fixer et la préparer en coagulant l'albumine, le côté de la lamelle non enduit étant tourné du côté de la tlamme, et on colore d'après l'une des méthodes que nous allons exposer.

Pourcueillir des parcelles de crachats de consistance solide nageant dans un liquide clair, il faut parfois les fixer avec une pince. On peut aussi enfoncer l'aiguille de platine chauffe'e dans cette partie solide qui est bridée au centre, mais adhère au fil et entraîne avec elle les parties voisines non brûlées.

On accélère la dessiccation à basse température en insufflant de l'air sur la lamelle à l'aide d'une poire en caoutchouc.

Pour trouver les bacilles éparpillés dans les crachats ou dans les autres

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milieux liquides, on recommande les méthodes de sédimentation. Elles ne sont indi([uées que si l'examen direct et réi)élé des crachats est resté négatif.

ï. MÉ rnODE DE SÉDIMENTATION DE BlEDEIiT.

On mélange dans un récipient 15 ccm. de crachats à deux cuillerées à soupe d'eau et, suivant leur consistance, à (juati'e ou huit gouttes ou plus de lessive de soude; on chauffe en agitant et on ajoute quatre à six cuillerées à café, jusqu'à formation d'une masse liquide. On laisse reposer pendant deux jours dans un verre conique, on décante et on examine le sédiment. Comme celui-ci a perdu de la viscosité des crachats, on fera bien de prélever des traces de ces crachats pour coller la masse à la lamelle. 11 est très avantageux de substituer au procédé du repos celui de l'appareil centrifuge après l'ébuUition.