CULTURES SUR MILIEUX STÉRILES

Une série d'opérations commence alors ; il faut :

1° Choisir les milieux de culture.

2° Les préparer.

3° Ensemencer ces milieux purs et stérilisés.

4° Les mettre dans les meilleures conditions pour le développement des semis.

5° S'assurer que la végétation obtenue appartient bien à l'espèce semée.

a. — Choix des milieux. — Ceux-ci devaient être : nombreux pour augmenter les chances de variation; très différents les uns des autres pour la même raison ; les mêmes pour chaque espèce essayée afin d’avoir des résultats comparables ; absolument stériles pour n'avoir que l'espèce typique ; faciles à ensemencer, à examiner et à conserver purs après l'usage.

Les semis ont été faits sur environ 80 milieux différents :

Les uns solides : pomme de terre (milieu-type), carotte, fragments de bois de peuplier blanc, gélose nutritive {avec peptone et chlorure de sodium suivant la formule ordinaire employée en bactériologie), gélatine nutritive (mêmes observations), moût de bière gélatiné (employé avec succès par Laurent et autres pour les cultures de champignons).

Les autres liquides, comprenant :

1° Des solutions identiques à celles d’où j'étais parti, pour me rapprocher le plus possible des conditions normales.

2° Des solutions de substances à réactions très différentes, telles par exemple que la soude à 1 p. 100 et l’acide sulfurique faible (1 p. 100).

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3° Des substances de composition voisine, mais différant par un point, la proportion de base par exemple (acide glycérophosphorique et glycérophosphates mono et disodique).

4° Des sels assez nombreux de la même base (sodium).

5° Des liquides très riches en substances nutritives (bouillon peptonisé), d’autres très pauvres (eau distillée).

6° Des substances toxiques (arséniate de sodium).

7° Des alcaloïdes (quinine).

8° Des substances complexes (liquide de Raulin).

9° Des substances spéciales (gomme, dextrine, etc., etc.).

Une première série de solutions ou milieux solides (une cinquantaine) comprend :

Pommes de terre, carottes, bois, gélose, gélatine, moût gélatiné.

Bouillon, mannite (5 p. 100), sucre interverti, eau glycérinée (10 p. 100), gomme {solution assez épaisse), dextrine (10 p. 100), eau distillée pure.

Eaux distillées de cannelle, mélisse, menthe, oranger, rose, tilleul.

Acides borique (5 p. 100), citrique (1), gallique (1 p. 100), sulfurique (1 p. 100), tartrique, glycérophosphorique (8 p. 100). |

Soude (1 p. 100).

Glycérophosphates mono et disodique (5 p. 100), biphosphate de calcium, lactophosphate de calcium, phosphate acide de sodium (5 p. 100).

Liquide de Raulin.

Chlorure (5 p. 100), bromure {5 p. 100), iodure (5 p. 100), arséniate (1 p. 100), carbonate, acétate de sodium.

Arsénite (1 p. 100), ferrocyanure de potassium, alun.

Chlorure d’ammonium (5 p. 100), sulfate de magnésium, chlorure de baryum.

(1) Les solutions dont la proportion n’est pas indiquée sont des solutions de laboratoire variant de 5 à 40 p. 100, et dans lesquelles des moisissures s'étaient développées et avaient servi aux semis d'origines.

Sulfate de quinine (1 p. 100), chlorhydrate de cocaïne (4 p. 100).

Créosote (0,50 p. 100), gaiacol (0,50 p. 100).

Plus tard, les quatre espèces choisies pour une étude plus approfondie ont été ensemencées sur une nouvelle série de milieux :

1° Milieur solides (pommes de terre, bois, fragments d'éponge), imprégnés par macération de liquides ayant donné les résultats les plus intéressants (acide gallique, acétate de sodium, glycérophosphate monosodique, mannite, etc.).

2° Quelques solutions à des doses diverses pour étudier l’action de la viscosité plus ou moins grande ou de la proportion de substance minérale.

3° Quelques milieux nouveaux, voisins par leur composition ou leur fonction chimique de ceux que la première expérience avait montrés intéressants.

On a ainsi constitué les milieux suivants (une quarantaine) : acétate de sodium à 1 à 5 et à 10 p. 100, soude à 0,25 et à 0,50 p. 100, acide gallique à 0,50 p. 100 et à 1 p.100, dextrine à 5 et à 20 p. 100, mannite à 1, à 5 et à 10 p. 100. Acide pyrogallique à 1 p. 100, tannin à 1 p. 100, acide picrique à demi-saturation, liqueur de Fowler normale, à demi-dose et à dose double d’arsénite de potassium, sucrate de chaux à saturation, urée (2 p. 100), glucose (5 p. 100), gomme à 3 consistances, eau distillée de cannelle ordinaire et étendue de moitié.

Avec quelques-unes de ces solutions et avec le glycérophosphate monosodique, on à de plus imprégné, par macération, 3 substances solides : pommes de terre, bois, éponge. |

b. — Préparation des milieux. — Elle est des plus simples. Les cultures sont faites en tubes à essais, assez grands, bouchés au coton et stérilisés à l’autoclave si le milieu le permet. S'il y a danger d’altération, on emploie les chauffages successifs à 70°. En tout cas, il est bon de

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conserver longtemps les tubes avant l'usage, car le développement des organismes peut être très lent dans les milieux chimiques.

ce. — Ensemencement. — Il n'offre d'ordinaire aucune difficulté. Toutes les précautions seront prises comme pour les cultures bactériologiques.

Quel que soit le nombre de tubes à ensemencer, 1l faut que l'opération soit faite en une fois et avec le même tube. On peut d’ailleurs, quand on à un semis à faire, ensemencer d'abord une boîte de Pétri, qui donnera, sur une large surface, une quantité suffisante du champignon.

d. — Conservation des semis. — Elle doit être longue. Il est vrai que diverses espèces se multiplient assez vite, et qu'il est bon de ne jamais perdre de vue les semis. Mais cela est vrai, surtout pour les cultures sur milieux nutritifs ou spécialement favorables; sur d'autres, au contraire, le champignon végète très lentement, et l’on doit attendre plusieurs semaines ou même plusieurs mois.

On évitera les excès de sécheresse ou d'humidité, et en hiver on laissera à l’étuve à 27 ou 28°.