IL — PATHOLOGIE GÉNÉRALE

ET MICROBIOLOGIE

Etudes sérologiques dans un cas de typhus exanthématique (3)

J’ai eu l’occasion, en collaboration avec M. Lisbonne, dans un cas sporadique et fatal de typhus exanthématique, de pratiquer la recherche de l’agglutination du Protéus X.19, réaction dite de Weil Félix. Le résultat fut positif, au 11 e jour de la maladie, au taux de 1/200. Six sérums témoins (1 typhoïde — 2 pneumonies — 1 pleurésie — .2 syphilis) donnèrent un résultat négatif.

Le sérum du malade agglutinait aussi un Protéus isolé par nous d’une urine, au taux de 1/100; il n’agglutinait pas les bacilles d’Eberth, Para A, au taux de r/30, Para B au taux de 1/50.

Nous avons recherché la présence d’une précipitine spécifique en mettant le sérum du malade en contact avec une culture filtrée de Protéus X. 19. On obtient, aux^doses optima de IV à VIII gouttes de sérum, pour L gouttes de culture filtrée, un précipité floconneux, blanchâtre, qui.se dépose le long des parois et au fond du tube. Le chauffage du sérum, à 56°, pendant 30 minutes, ne détruit pas cette propriété.

La culture chauffée à 56°, pendant 30 minutes, garde la propriété d’être précipitée ; à 70°, cette propriété est atténuée.

Etude des phénomènes de bactériolyse transmissible (14, 15, 20, 21, 28)

Ces recherches constituent un travail poursuivi pendant près de deux ans, dans le laboratoire de microbiologie; elles ont fait l’objet de notes publiées en collaboration avec M. Lisbonne ; j’en ai condensé une plus grande partie dans un Mémoire qui a été couronné

par l’Académie des Sciences et Lettres de Montpellier (Prix Jaumes).

Le phénomène de bactériolyse transmissible, vu pour la première fois par Twort, étudié ensuite par d’Herelle, présente les caractéristiques suivantes :

Dans certaines conditions, une culture en bouillon d’un microbe est susceptible d’être détruite par dissolution, par « lyse».

Une quantité très minime de cette culture, ainsi détruite, appelée lysat, transportée directement, ou après filtration sur bougie Chamberland, dans une culture récente en bouillon du même microbe, produit la lyse de celle-ci.

Une trace de ce deuxième lysat transportée dans une nouvelle culture lyse cette dernière... et ainsi de suite.

Il y a donc dilution de plus en plus grande du principe lytique, tandis que son action, semble-t-il, devient de plus en plus intense.

On obtient une lyse microbienne en série soüs l’action d’une cause qui doit se reproduire, se régénérer, et qui est susceptible de passer à travers les filtres.

Pour expliquer ce phénomène, deux théories sont en présence : D’une part, la théorie émise par d’Hérelle, qui admet l’existence d’un ultra microbe, hôte normal de l’intestin de l’homme et des animaux, des lieux souillés par leurs déjections, capable de parasiter toutes les bactéries pathogènes, de se reproduire à leur intérieur et de les détruire par des lysines.

D’autre part, la théorie qui admet que le principe lytique est un ferment formé par les microbes eux-mêmes, primitivement sous l’action de causes diverses, se reproduisant, héréditairement selon Bordet et Ciuca, par transformation d’un proferment inactif en ferment actif pour O. Bail, Weinberg, Kabeshima.

D’Hérelle objecte aux partisans de la théorie du ferment que toutes leurs expériences sont faussées par la présence d’éléments qui avaient été en contact avec le tube digestif ; en particulier, que le principe lytique obtenu par Bordet et Ciuca, dans l’expérience qui consiste à injecter un B. Coli dans le péritoine d’un cobaye immunisé contre ce bacille, est dû au passage du bactériophage intestinal dans l’exsudât péritonéal.

Pour nous mettre à l’abri de cette critique, avec MM. Lisbonne, Boulet (14), nous avons essayé d’obtenir un principe Shigaphagique en mettant en contact, in vitro, quelques gouttes d’exsudats leucocytaires aseptiques, de provenance sous-cutanée et pleurale, avec une culture en bouillon de Bacille de Shiga. Les exsudats leucocytaires étaient obtenus chez le chien ou chez le lapin par injection sous-cutanée de térébenthine ou de Mellins food, par injection intra-pleurale de Mellins food.

Dans ces conditions, l’élaboration du principe lytique ne peut guère s’expliquer par l’intervention du Bactériophage intestinal, on doit tenir pour vraisemblable que la lyse transmissible est, comme le veut Bordet, la résultante d’une viciation de la nutrition du- bacille, .déclanchée par l’interaction des leucocytes et du microbe.

Nos expériences montrent, en outre, que cette action leucocytaire n’est pas nécessairement liée à un acte de défense de l’organisme. Les leucocytes agissent simplement comme « agents provocateurs» de la lyse. La lyse peut être obtenue en mettant en contact une macération aqueuse filtrée de leucocytes et le Bacille de Shiga. A notre interprétation, d’Hérelle objecte que le Bactériophage étant normalement phagocyté — comme l’ont indiqué Bruynoghe et Maisin — il est naturel de le rencontrer dans les exsudats leucocytaires, d’où nous l’avons extrait, et que, c’est par conséquent lui encore, dans nos expériences, qui est la cause de la lyse du Bacille de Shiga.

Sans vouloir discuter la valeur contestable de l’argumentation de d'Hérelle, avec M. Lisbonne nous avons apporté un appoint de plus à notre manière de voir en instituant une série de nouvelles expériences ( 15 ).

Nous sommes parvenus, à tout coup, à obtenir la lyse transmissible du Bacille de Shiga, par une technique originale qui met exclusivement en jeu l'antagonisme microbien in vitro, et dont voici le principe : une culture en bouillon de Bacille de Shiga est ensemencée: avec une trace de culture de B. Coli. Après un temps variable de séjour à l’étuve à 37 0 , on filtre sur bougie Chamber-

land L s . A io cc de bouillon on ajoute XX gouttes du filtrat obtenu et une émulsion suffisamment épaisse de Bacille de Shiga. Séjour de cinq jours à 37®, nouvelle filtration. On répète la série de ces opérations avec les filtrats successifs ; au troisième ou quatrième passage on observe la lyse totale du Bacille de Shiga.

Nous avons fait des expériences en partant de diverses souches de Coli (4 isolées d’urines, 1 des selles). Nous avons employé différentes combinaisons ; quel que soit le procédé que nous ayons utilisé, après un certain nombre de passages, la lyse totale et transmissible est obtenue.

Une expérience semblablement conduite, en remplaçant le B. Coli par un Proteus X 19, nous a donné des résultats identiques.

. Dans ces expériences, on peut remarquer l’absence d’extraits de matières fécales, de leucocytes ou de tissus ; nous nous mettions ainsi à l’abri des critiques de d’HérelIe. Il y avait là, deux bacilles vivant en communauté ; les actions fermentatives de l’un peuvent amener une viciation dans le métabolisme de l’autre et déclancher ainsi la lysé transmissible, qui en est la conséquence.

Ces premières recherches permettaient de penser, en ce qui concerne la lyse du Bacille de Shiga, que le principe lytique contenu dans les matières fécales de dysentériques pouvait résulter d’une action microbienne intestinale, analogue à celle que nous avions réalisée in vitro ; point n’était besoin d’un ultra microbe autonome.

En publiant les résultats, nous terminions par ces mots : « Une dernière interprétation, il est vrai, restera toujours aux partisans de la théorie du Bactériophage : c’est que tous les microbes, B. Coli, Proteus, Shiga etc..., issus du contenu intestinal, sont originellement parasités par le bactériophage. Elle est trop en contradiction avec ce que nous savons actuellement de la biologie générale des Bactéries pour que nous puissions la prendre" en considération ».

Nos contradicteurs nous reprochèrent immédiatement d’être partis de souches de Colibacilles lysogènes, vecteurs du Bacterio-

pliage. Cette objection ne pouvait viser le Proteus X 19. Pour y répondre, nous avons soumis un B. Coli des eaux à nos contradicteurs qui, spontanément, nous ont répondu qu’il n’était pas lysogène.

A partir de cette souche, en employant des souches de Bacille de Shiga de provenances diverses (Lyon, Toulouse), nous avons refait nos expériences ; toutes ont été positives.

Il nous a encore été objecté que nos souches de Bacille de Shiga étaient sans doute lysogènes ; nous avons purifié ces souches par isolements successifs ; les expériences nouvelles ont confirmé nos premiersrésultats.

Nos expériences n’étaient donc pas entachées d’erreurs grossières, et leur valeur est incontestable.

L’interprétation du « primum movens », qui, d’une culture nor^ male de Shiga aboutit à la bactériolyse de ce bacille par simple contact avec un B. Coli ou un Proteus, n’est pas facile. On peut, cependant, admettre une action fermentative, analogue à celle décrite pour les leucocytes in vivo et in vitro j exercée sur le bacille de Shiga qui ainsi modifié se détruit par autolyse.

Notre conception a été acceptée par certains auteurs, et P. Fabry a confirmé nos données en obtenant la lyse transmissible pour un staphylocoque par conctact avec un B. Coli.

Nous avons, tout récemment, ( 28 ) modifié notre interprétation première à la suite de nouvelles expériences. Au lieu de mettre en conctact B. Shiga et B. Coli pendant un certain nombres de jours à l’étuve, suivant la technique établie, nous avons obtenu le principe lytique en faisant agir une culture filtrée de B. Coli sur le germe à lyser.

Le résultat de ces expériences permet de • modifier ce qu’il v y a d’inexact dans le terme «antagonisme microbien ». Ce n’èst pas par une action vitale que le B. Coli exerce son action sur B. Shiga, puisqu’il n’est pas nécessaire qu’il y ait « vie en commun » des deux germes. C’est par ses produits solubles, excrétés dans le millieu qu’il agit. Des expériences en cours nous permettront, peut-être, d’établir dans quelle fraction chimique d’un bouillon, où s’est développé le B. Coli, se trouve l’agent actif, provocateur de la lyse de B. Shiga.

Dans le Mémoire ( 21 ) qui a été couronné par l’Académie des Sciences et Lettres de Montpellier (prix Jaunies 1923), j’ai étudié le phénomène de bactériolyse transmissible et donné de nombreuses expériences qui viennent à l’appui de notre conception sur la nature du principe batériolytique.

Après avoir exposé succinctement les caractéristiques du phénomène et rappelé les deux théories émises sur la nature de l’agent de la bactériolyse transmissible, je rapporte les expériences que j'ai faites à l’appui de notre hypothèse sur Y antagonisme microbien, facteur de lyse.

Dans un deuxième chapitre, j’étudie une condition de milieu indispensable à la production de la bactériolyse en série : la nécessité des sels. Pour d’Hérelle, « le Bactériophage est indéfiniment cultivable en série dans une solution légèrement alcaline ; le sel n’est même pas indispensable... ». Contrairement à cette opinion, j’ai montré qu'en eau bi-distillée, alcàlinisée à 25 mgr. de soude par litre, des principes actifs, vis-à-vis de B. Shiga, de B. Coli, d’un Staphylocoque, n’agissent pas sur ces microbes, a la condition d’éviter la cause d’erreur qui provient de l’introduction de sels par l’intermédiaire du lysat lui-même. Dans du bouillon au Liebig, privé de sels, la lyse ne peut se produire. L’adjonction de peptones ne la provoque pas. Par contre, non seulement le chlorure de sodium, mais les autres sels (Kl, KBr. Na Br. Nal) déclanchent le phénomène. Les sucres sont impropres à la production de la bactériolyse.

La présence d’un électrolyte est donc indispensable. Dans un milieu privé d’électrolyte, l’inactivité du principe est due à sa non absorption par les microbes.

Le troisième chapitre du Mémoire traite de quelques propriétés du principe lytique :

i° Action delà chaleur. — Je montre, contrairement à certains auteurs, qu’il ne s’agit pas uniquement d’une question température, mais que la résistance du principe à la chaleur est aussi facteur des conditions de milieu. C'est ainsi que j’ai pu me rendre compte

qu’un même lysât très actif, qui est complètement détruit par chauffage direct à ioo° pendant cinq minutes, résiste à ce chauffage, si on le dilue préalablement dans de l’eau distillée.

Bien que les expériences soient encore en cours, on peut, dès maintenant, tenir pour acquis ce résultat : la résistance à la chaleur du principe lytique varie avec les conditions de milieu; en particulier, cette résistance est augmentée par la dilution en milieu privé d’électrolytes.

2° Action des rayons ultra-violets. -- Connaissant l’action bactéricide intense de ces rayons, j’ai soumis à leur influence divers principes lytiques.

J’ai trouvé qu’un principe lytique pour B. Shiga était complètement détruit après quatre heures d’exposition à la lumière d’une lampe de quartz, tandis qu’un principe actif sur un B. Coli résiste six heures et qu’un principe lytique pour un Staphylocoque est détruit en cinq heures. En deçà de ces limites, on note une atténuation du principe qui récupère son activité, après un certain nombre de passages.

De plus, mes expériences me permettent de conclure qu’un lysat provenant d’une souche microbienne donnée, actif sur plusieurs souches, paraît posséder deux propriétés dissociables par l’action des rayons ultra-violets : une propriété lytique principale, une propriété lytique secondaire. La première est plus résistante, elle esta peine atténuée quand la seconde déjà est détruite.

3° Diffusibilité du principe lytique.— J’ai pu montrer, en expérimentant avec différents principes, que la diffusion de l'agent de la bactériolyse, dans les milieux solides, l’agir en particulier, était incompatible avec l’existence dun ultra microbe. Le principe lytique est, en effet, capable, séparé d une colonie microbienne, par 4 ou 5 mm. d’épaisseur d’agar, d’agir sur cette colonie, de provoquer sa lyse et de régénérer ainsi une nouvelle quantité de principe. Il est difficile d’admettre qu’un être vivant puisse traverser une telle épaisseur d’agar pour atteindre la colonie au niveau de laquelle il proliférera.

4° Adaptation du principe lytique. - Pour d’FIérelle, le bactériophage est doué d’une véritable virulence vis-à-vis de tous les germes pathogènes ; cette virulence est variable, mais elle est ' susceptible de s’exalter par passages successifs, de telle sorte qu'aucun microbe ne saurait finalement résister au bactériophage. En réalité, il n’en est pas ainsi ; mes expériences me permettent d’affirmer que, par exemple, si un principe, actif sur B. Shiga, peut agir sur des souches de B. Flexner ou B. de Hiss, il ne peut, même après de nombreux passages, agir sur B. Coli ; par contre, un principe actif sur B. Coli agit toujours sur B. Shiga : nous trouvons là une confirmation de notre opinion : le déclanchement de la lyse transmissible de B. Shiga est dû à l’action exercée sur ce bacille par les produits solubles de B. Coli.

Un lysat actif sur un staphylocoque n’arrive pas à lyser un B. Coli et vice-versa. Si donc, il est possible, à partir d’un principe actif sur une souche microbienne, d’obtenir, par passages successifs, l’adaptation de ce principe à une nouvelle souche microbienne, la condition sine qua non est qu’il s’agisse d’un microbe très voisin, par exemple B. Coli et B. Para B et Para A.

5° Applications. ■— Tout en étudiant la nature du principe • bactériolytique, je me suis demandé de quelles applications il pouvait être l’objet.

Du point de vue thérapeutique, l’expérimentation sur les cobayes et lapins m’a donné des résultats trop inconstants pour qu’il en soit tenu compte.

Dans le laboratoire, on peut utiliser certaines propriétés du principe lytique pour le diagnostic d’une espèce bactérienne, la purification des cultures, l’isolement des germes. De nouvelles recherches doivent être tentées, et, peut-être obtiéndrait-on des procédés techniques permettant de déceler la présence dans l’eau ou les selles du B. d’Eberth ou des paratyphiques.

Les faits que je relate dans ce Mémoire, rapprochés des résultats publiés par C. Delezenneet M l,e Ledebt sur l’activation à o° du suc pancréatique, m’ont [permis d'établir une hypothèse sur la nature et le mode d’action du principe lytique.

Il s’agirait, à mon sens, d’autolysines produites ou excrétées sous l’influence d’un agent perturbateur (ferments leucocytaires, ferments microbiens, diastases diverses....), quand les microbes meurent en dispersant leurs colloïdes. Ces autolysines, en présence de microbes semblables, les lyseront, mais en libérant en même temps de nouvelles quantités d’autolysines. Ces autolysines nous permettent de concevoir les diverses propriétés du principe lytique, sa régénération, sa multiplication, son adaptation.

Si cette hypothèse ne ressort pas nettement de mes expériences, celles-ci cependant m’ont permis et, c’est en cela que réside leur intérêt, d’apporter tout un faisceau de preuves nouvelles en faveur de l’hypothèse qui considère le principe lytique comme un ferment soluble ; ce ferment ne pouvant être produit et régénéré que par le microbe lui-même.

Bacilles de Koch et bacilles acido et alcoolo résistants (7).

En examinant le culot de centrifugation d’urines recueillies par miction, dans un récipient propre, après toilette locale, je trouvais sur les lames colorées par la méthode de Ziel-Nelsen des bacilles gardant la couleur rouge de la fuchsine phéniquée. Il s’agissait d’une jeune femme, qui se plaignait de douleurs lombaires unilatérales.

L’examen renouvelé sur plusieurs lames après la coloration précédente, en insistant sur la décoloration et en prolongeant l’action de l’alcool absolu, permettait de retrouver des amas de bacilles colorés en rouge, dont la forme et les dimensions rappelaient celles du Bacille de Koch.

Les urines de la même personne ayant été recueillies après cathétérisme vésical, on ne décele dans le culot de centrifugation aucun bacille acido et alcoolo résistant ; deux cobayes inoculés sont demeurés indemnes de toute lésion tuberculeuse.

Il s'agissait donc vraisemblablement de bacilles de la secrétion vaginale, et non de bacilles de Koch, provenant d’une cystite et non d’une néphrite tuberculeuse.

Ceci démontre, une fois de plus, que tous les bacilles acido et alcoolo résistants ne sont pas des bacilles tuberculeux. Pour affirmer que l’on a affaire à un vrai bacille de Koch dans les urines, il ne suffit pas de trouver des bacilles acido et alcoolo résistants dans ces urines recueillies par miction, même dans les meilleures conditions de propreté. Il faut, surtout pour la femme, que ces urines aient été recueillies aseptiquement, par cathétérisme vésical ou urétéral, dans des tubes aseptiques que les examens soient pratiqués par des techniciens sûrs. Si le moindre doute subsiste, seule l’inoculation au cobaye donnera la certitude.

Les potentiels de contact en biologie (6;.

En collaboration avecM. Pech, j’ai pu vérifier expérimentalement les faits suivants:

i° De la toxine diphtérique, mise au contact d’un cœur de souris blanche qui vient d’être séparé de l’animal, présente, par rapport à ce cœur, une différence de potentiel de 4 volts environ, la toxine ayant un potentiel négatif par rapport au cœur. Les résultats sont les mêmes avec le foie ou les muscles de la même souris.

2 0 En renouvelant l’expérience, en remplaçant la toxine par du sérum antidiphtérique, la différence n’est plus que de 2 volts dans le même sens.

3 0 Si l’on ajoute à la toxine diphtérique une quantité suffisante de sérum antidiphtérique, on ne constate plus de différence de potentiel entre le mélange et les organes en contact, tout comme lorsqu’on les met en contact avec une solution d’eau physiologique.

4 0 De semblables organes mis en contact de sérum antitétanique présentent un potentiel de 2 volts, avec le sérum; mais, cette différence se maintient, lorsqu’on ajoute à ce sérum de la toxine diphtérique, même en grande quantité.

Ces constatations, faites au moyen de deux électromètres à quadrant, ont permis à M. Pech de poursuivre et d’orienter ses recherches sur les différences de potentiel en biologie.