PRÉPARATIONS MICROSCOPIQUES

Les petits animaux, certaines larves, les dilacérations, les coupes histologiques sont conservées sur une lame de verre, le porte-objet , dans une goutte de liquide conservateur approprié, recouverte d’une lamelle, le couvre-objet. Une collection de pareilles préparations est de la plus grande utilité. Chaque naturaliste doit pouvoir en faire soi-même. Nous indiquerons, par conséquent, les données essentielles qui y sont relatives :

Les deux liquides conservateurs les plus usuels, sont : le baume de Canada et la glycérine .

Le baume de Canada se trouve dans le commerce, en masse visqueuse et transparente. On choisira celui dont l’indice de réfraction avoisine celui du verre, de telle sorte qu’une baguette de cette

GENERALITES SUR LA TECHNIQUE

substance qu’on y plonge devienne invisible. Le baume se dissout dans l’essence de thérébentine, la benzine et le chloroforme. Ces deux derniers dissolvants ont l’avantage de s’évaporer très vite, le baume qui y est dissout sèche donc plus rapidement que dans l’essence de thérébentine. On préférera cependant, dans la plupart des cas, la benzine au chloroforme, l’évaporation de ce dernier étant si prompte, qu’une goutte se fige déjcà à la surface, avant qu’on ait eu le temps d’y étaler l'objet qu’on prépare.

Les pièces que l’on conserve dans le baume doivent être préalablement privées d’eau, ce liquide ne se mélangeant pas au baume. Il s’agit pour cela de les plonger dans l’alcool ordinaire, puis dans l’alcool absolu, pendant quelques heures. Après avoir renouvelé l’alcool une ou deux fois, on égoutte l'objet sur un morceau de papier à filtrer ou simplement sur le bout du doigt, puis on le dépose à la surface d'une certaine quantité d’essence de thérébentine, d’essence de girofle, ou de créosote. L’alcool précipitant le baume, il faut que l’un de ces derniers liquides l’ait complètement remplacé dans l’objet, pour pouvoir immerger celui-ci dans le baume. La créosote, toujours acide, ne sera pas employée pour les préparations renfermant des formations calcaires. Pour les tissus très délicats, l’essence de girofle rendra de meilleurs services que l'essence de thérébentine, qui les ratatine beaucoup par un trop long séjour.

L'objet, devenu transparent dans la thérébentine, la créosote ou l’essence de girofle, est introduit dans le baume, dont on dépose une goutte au centre de la lame de verre, puis recouvert du couvre-objet. Si on a laissé s’introduire quelques bulles d’air, on les chassera en faisant agir, au moyen d’un ressort ou de tout autre manière, une pression légère, mais continue, sur la lamelle.

Le durcissement du baume est très lent à l’intérieur. Il peut être sec et solide sur les bords depuis des semaines, alors qu’il est encore liquide au centre; il faudra donc, pendant quelques mois, manier avec précaution ces préparations qui, du reste, n’ont pas besoin d’être lutées. Lorsque l’excès de baume qui difflue en dehors de la lamelle a séché, on l’enlève avec la lame d’un couteau, puis on essuie avec un linge imbibé d’essence de thérébentine.

Quant aux objets solides (os, dents, spiculés, etc.), on peut les préparer au baume dur, que l’on ramollit momentanément par la chaleur. On chauffe modérément la lame, on y dépose une goutte de baume, puis l’objet, et l’on couvre avec une lamelle également chaude. Ces préparations sont rapidement solidifiées, mais il est important de chasser les bulles d’air avec une aiguille chaude, avant de couvrir, car la solidification est tellement prompte, que la près-

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ol

sion ne les fait pas partir. Ce dernier mode d’emploi du baume est, du reste, le plus souvent abandonné.

Le baume rendant les tissus extrêmement transparents, on n’y conservera que ceux qui auront été préalablement colorés ou injectés. Il est bien rare, à l’exception peut-être de l’hématoxyline, que les matières colorantes y palissent.

La résine de Dammar dissoute dans l’essence de thérébentine, est employée dans les mêmes conditions que le baume; elle présente, sur ce dernier, l’unique avantage d’être plus généralement incolore, mais elle devient cassante en séchant. Les meilleurs résultats sont obtenus en mélangeant à partie égale le baume et la résine de Dammar, cette dernière éclaircit le baume.

On peut encore employer d’autres vernis, tels que : le mastic en larmes, la colophane, etc. ; mais ils ne présentent pas, sur les précédents, de bien grands avantages.

La glycérine est d’un usage constant en microscopie. On peut l’employer pure ou additionnée d’eau. Pure, elle ratatine, en absorbant leur eau, les tissus frais et délicats; on fera bien de les placer d’abord dans une solution aqueuse de glycérine, dont on augmente ensuite la teneur en glycérine. Pour éviter les bulles d’air, on ne couvrira pas immédiatement la préparation. Les coupes et les tissus colorés pâlissent peu à peu et perdent leurs couleurs dans la glycérine. On retardera cette décoloration, en acidulant légèrement le liquide avec une goutte d’acide acétique pour 30 grammes de glycérine. La glycérine ne séchant jamais, les préparations doivent être fermées par une bordure de paraffine, de bitume de Judée, etc., dont nous parlerons plus bas. Mais il est essentiel, pour que cette fermeture soit solide, que les bords de la lamelle soient parfaitement débarrassés de glycérine. On retire l’excès de ce liquide avec un fragment de papier à filtrer, puis on essuie les bords avec un fin pinceau imbibé d’alcool.

La liqueur de Farrant tient le milieu entre le baume et la glycérine, en ce sens qu’elle se solidifie moins que le baume, et que cependant elle sèche suffisamment pour permettre de se passer de lut autour de la lamelle. Il faudra toutefois être très prudent en essuyant les préparations faites avec ce liquide. Il se compose de 0 gr. 11 d’acide arsénieux, que .l’on fait dissoudre dans 35 grammes d’eau distillée bouillante. On laisse refroidir, puis on ajoute 35 grammes de glycérine, et l’on dissout dans le tout le même poids de gomme arabique choisie. On peut placer dans ce liquide les objets provenant directement de l'eau ; quant à ceux traités à l’alcool qui précipite la gomme arabique, il faut soigneusement les en débarrasser.

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Glycérine et gélatine. — On fait usage, pour les tissus qui deviendraient trop transparents dans la glycérine pure, d’un mélange à parties égales de gélatine et de glycérine. Pour cela, on fait gonfler la gélatine dans l’eau, puis on la dissout dans la glycérine à chaud. Ce mélange sé solidifie suffisamment pour qu’il soit superflu de luter les préparations.

COUPES

Pour étudier la structure histologique d’un tissu ou les relations des organes d’un petit animal, on a constamment recours à la méthode des coupes. Celles-ci se pratiquent soit à main levée, lorsqu’on n’a besoin que de quelques-unes, soit au microtome lorsqu’on tient à obtenir une série de même épaisseur. Nous ne dirons rien des microtomes, chaque naturaliste a pour ainsi dire son système particulier qui lui fournit de bons résultats, parce qu’il en a l’habitude. Des deux types principaux, nous employons le microtome à main de Ranvier, et le microtome à rabot de Spengel (1).

Les tissus convenablement durcis se coupent directement dans la moelle de sureau, que l’on taille de manière à ce qu’elle soit bien prise dans le microtome ou de longueur convenable pour qu’elle soit solidement tenue entre les doigts. On peut remplacer la moelle par des languettes de foie de mouton ou de veau, que l’on a préalablement durci à l’alcool. Dans ces conditions, la lame du rasoir doit être recouverte d’alcool, de manière à ce que les coupes ne se plissent pas par leur frottement contre elle. Les coupes sont ensuite colorées et préparées.

Pour les objets très délicats qui craignent d’être comprimés, on les fixera dans la moelle de sureau, dont on fend longitudinalement un morceau où l’on creuse une concavité pour loger l’objet, puis on l’enveloppe avec de la gomme arabique, de la gélatine ou mieux encore du collodion, dont on dépose une couche ou deux jusqu'à ce qu’il y soit complètement inclus. On laisse sécher jusqu’à ce que la masse ait acquis la consistance voulue. On coupe, puis on débarrasse les coupes de l’excès de matière, soit avec de l’eau tiède (gomme et gélatine), soit avec l’éther (collodion).

Mais ces méthodes d’inclusion de l’objet, très employées en histologie, ne suffisent pas en Anatomie comparée. Lorsqu'il s’agit de ménager la position des organes dans un animal entier (Amphioxus,

(l) Dans ces derniers temps, on a beaucoup perfectionné ces instruments. Les fabricants anglais et allemands, en particulier, en fournissent de très précis qui assurent des coupes de 1/200 de millimètre. Ne pouvant entrer dans le détail de leur description, nous renvoyons aux journaux de microscopie.

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embryons de vertébrés, par exemple), il faut employer une masse qui pénètre dans la cavité du corps, enveloppe les organes internes et qui, se solidifiant ensuite, les maintient dans leur situation respective. On emploie, dans ce but, un grand nombre de substances solides à la température ordinaire et se liquéfiant à une température un peu plus élevée ou inversement. Nous en signalerons trois :

Inclusion à la paraffine. — Cette substance, très généralement employée aujourd’hui, donne de bons résultats à condition de suivre très exactement la technique appropriée. Supposons que nous voulions inclure un embryon de poulet, par exemple. Après l’avoir fixé dans la liqueur de Kleinenberg ou le sublimé corrosif et coloré in toto , nous le lavons très soigneusement dans l’alcool à 70 pour 100, à 90 pour 100 et absolu. Après un séjour de vingt-quatre heures dans ce dernier, nous le plongeons dans l’essence de girofle (ou la créosote, ou le benzol, etc.) pendant quelques heures, jusqu’à ce qu’il soit devenu transparent, puis nous l’introduisons dans la paraffine préalablement fondue au bain-marie. Il est important que la température de la paraffine ne dépasse pas trop son point de fusion (environ 50° centigrades), sans cela les tissus s’y ratatinent énormément. On s’en assurera en enlevant une gouttelette de paraffine au bout d’une pince, elle doit se figer rapidement; l’estimation de la température la plus convenable est, on le comprend, une question de tâtonnement qu’il est difficile de préciser. L’embryon immergé est laissé dans la paraffine fondue pendant un quart d’heure, une demiheure selon ses dimensions, de manière à ce qu’il en soit complètement imbibé, puis on le transporte dans un verre de montre, un godet en papier ou tout autre ustensile rempli de paraffine fondue qu’on laisse refroidir lentement, après Lavoir orienté de la manière voulue au moyen d’une aiguille légèrement chauffée.

Lorsque la paraffine est solidifiée, elle fait corps avec l’embryon; on la diminue tout autour de lui jusqu’à ce qu’on ait un petit prisme que l'on fixe dans le microtome, et dont on enlève de fines coupes au rasoir. Chaque coupe montre une tranche de l’embryon entourée de l’excès de paraffine ; on range les coupes en série numérotée sur la lame de verre où on les conservera. Il s’agit maintenant, pour terminer la préparation, d’enlever la paraffine sans déranger l’ordre des coupes. A cet effet, on commence par chauffer légèrement la lame de verre jusqu’à ramollissement de la paraffine, afin de fixer les coupes, puis on les lave à l’essence de thérébenthine que l’on apporte et que l’on enlève à plusieurs reprises au moyen du pinceau. Lorsque la paraffine est complètement enlevée, on couvre le tout d’une

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lamelle, et on fait filtrer dessous du baume de Canada dissout dans la thérébentine.

Dans le cas où la paraffine dont on dispose est trop dure, on peut la ramollir en l’additionnant de quelques gouttes d’huile d’olive ou de vasseline. L’addition de quelques gouttes d’essence de thérébentine la rend également plus pénétrante.

La méthode d’inclusion à la paraffine a été heureusement modifiée par Giesbrecht (1). L’objet durci est placé dans un tube cylindrique avec de l’alcool absolu, dans lequel on laisse tomber goutte à goutte du chloroforme. Ce dernier, plus lourd que l’alcool, gagne le fond, et l’objet s’y enfonce peu à peu, remplaçant progressivement son alcool par du chloroforme. Lorsqu'il est complètement immergé, on peut le considérer comme suffisamment pénétré de chloroforme. Dans le cas où l’objet trop léger flotte à la surface du chloroforme, on l’en pénètre en agitant convenablement le tube.

Ceci fait, et l’alcool surnageant ayant été décanté, on chauffe le chloroforme jusqu’au point de fusion de la paraffine, puis on y laisse tomber des petits morceaux de cette dernière substance. Le chloroforme est peu à peu chassé par la chaleur, et l’objet est pénétré de paraffine lorsqu’il ne s’en dégage plus de bulles de vapeur. Par ces pénétrations successives, on évite la contraction des objets qui se produit toujours un peu par la méthode précédente.

Les coupes ayant été pratiquées, Giesbrecht conseille de les préparer de la manière suivante, afin de leur conserver leur position.

On dépose une couche fine et régulière d’une solution plusieurs fois filtrée de gomme laque dans l’alcool absolu, sur la lame porteobjet; cela se fait le mieux au moyen d'une baguette de verre que l’on a trempée dans la solution de gomme laque, et que l’on promène horizontalement sur la lame. Lorsqu’on veut y déposer les coupes, on étale, au préalable, sur la couche de gomme, une légère couche d’essence de girofle ou de créosote aussi égale que possible, sur laquelle on place les coupes avec un minimum de paraffine. Lorsque celles-ci sont arrangées dans l’ordre voulu, on chauffe légèrement la lame de verre jusqu’à fusion de la paraffine. Par la chaleur, l’essence ou la créosote se rendent sur les bords du porte-objet où l’on pourra les essuyer, mais on continue à chauffer jusqu’à ce que le reste en soit évaporé. Alors seulement on fait passer un courant d’essence de thérébentine, qui dissout toute la paraffine sans déranger les coupes ; on recouvre finalement ces der-

(1) Giesbrecht, Zur Schneide- Technik , dans Carus Anzeiger, 12 sept. 1881, p.483.

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niéres de baume de Canada, qui rend la fine couche de gomme laque sous-jacente si transparente qu’on ne l’aperçoit pas. Selon Caldwell, on peut remplacer la solution alcoolique de gomme laque par une solution saturée dans la créosote.

Inclusion au savon (suivant Polzam). — On coupe en lames minces du savon ordinaire que l’on fait sécher au soleil pendant quelques jours, jusqu’à ce qu’il se soit décoloré, puis on le réduit en poudre fine que l’on mélange avec de l’esprit de vin jusqu’à ce qu’elle forme une masse pâteuse. De cette pâte, on obtient une masse à inclusion par l’addition d’alcool et de glycérine. On prend 10 parties en poids du savon, 22 parties de glycérine, et 35 parties d’alcool à 90 pour 100; on laisse bouillir le tout jusqu’à ce que l’on en obtienne une liqueur sirupeuse, transparente, légèrement jaunâtre, dans laquelle on plonge l’objet. Les coupes sont lavées à l’eau tiède ou à l’alcool, et conservées dans la glycérine ou la liqueur de Farrant (Salensky) (1).

Inclusion à T albumine. — Cette méthode est surtout bonne pour les études d’anatomie topographique. Elle consiste à placer l’objet, préalablement coloré par une teinture aqueuse, dans de l’albumine d’œuf de poule, pendant une ou plusieurs heures, jusqu’à ce qu’il en soit parfaitement pénétré, puis on le place dans une cupule de verre ou de papier remplie d’albumine. On durcit le tout en portant la cupule sur un bain-marie après l’avoir recouverte d’une plaque de verre, d’un entonnoir ou d’un verre à pied, afin d’empêcher le dessèchement de l’albumine. Au bout de quinze à vingt minutes, l’albumine est coagulée. On jette alors la cupule dans de l’alcool ordinaire, que l’on change à plusieurs reprises, et que l’on remplace finalement par de l’alcool absolu.

L’albumine y prend la consistance du cartilage, et l’on peut en enlever des coupes extrêmement fines. Dans l’alcool, l’objet se conserve indéfiniment, en sorte qu’il n’est pas nécessaire de hâter les coupes. Dans le cas où l’objet n’aurait pas été orienté, on place le morceau d’albumine durcie qui le renferme dans de l’essence de girofle ou de l’essence de thérébentine, il y devient, au bout de quelques heures transparent comme de l’ambre (Selenka) (2).

Les objets qui ont été durcis à l'alcool ne peuvent être imprégnés d’albumine si on ne les débarrasse préalablement de l’alcool qu'ils renferment par un lavage à l’eau. Or, dans cette opération, les éléments histologiques, d’abord contractés par l’alcool, puis gonflés par l’eau se détériorent, de sorte que les coupes ne sont plus bonnes qu’à observer la situation respective des organes (Paul Mayer).

(1) Salenski, Morphologisches Jahrbuch von Gegenbaur , t. III, 1877, p. 558.

(2) Selenka, dans Carus Anzeiger, 1878, p. 130.

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