MÉTHODES DIVERSES

Le premier qui ail signalé Faction des solutions diluées est Johann Duncan ^ qui observa que dans la chlorose, les hématies perdent leur matière colorante lorsqu'on les met dans une solution saline, dans laquelle cependant les hématies d'individus sains ne subissent pas l'hémolyse. Mais c'est Malassez - qui le premier érigea en véritable méthode l'étude de la résistance globulaire.

Méthode de Malassez"'. — Elle consiste à faire à des intervalles de temps lixes, des numérations successives de globules rouges dans un sérum artificiel de titre constant et conservé à l'abri de toute évaporation. Elle permet d'établir une courbe de la résistance globulaire. On assiste au début à une chute brusque de la courbe, puis la chute devient plus lente, comme s'il y avait dans le sang normal deux espèces de globules, les uns peu résistants qui se détruisent de suite, les autres plus résistants qui se détruisent plus lentement.

Méthode de Chanel. — Chanel ^ a modifié la méthode de Malassez en combinant aux numérations globulaires l'emploi de se'rums artificiels de titres différents. Par ce procédé Chanel avait mis en lumière l'augmentation de résistance des globules chez les ictériques.

La méthode des numérations, comme l'a montré Vaquez, qui après l'avoir employée (en la combinant avec la méthode d'Hamburger) l'a abandonnée, est passible de graves objections au point de vue pratique ; car il est difficile de fixer à partir de quel degré d'altération les hématies doivent être considérées comme altérées ; le procédé des mensurations seul pourrait le permettre à la rigueur, mais comme cette technique ne peut être pratiquée que sur des

1 Duncan. Beitrage zur Path. and therap. der Chlorose, Acad. des Sciences de Vienne, 1867, p. 516.

2 Malassez. Sur l'anémie saturnine, Soc. de biologie, 6 déc. 1873, p. 123 ; — Richesse des globules rouges chez les cancéreux; chez les tuberculeux, Soc. anatomique, 1874, p. 282 et 287 ; — Les premières recherches sur la résistance des hématies, Soc. de biologie, ianv. 1893; — Solutions salées dites physiologiques, Soc. de biol., 1896, p. 504; — Prétendus liquides conservateurs des globules rouges, Soc. de biol., 1896, p. 511.

3 Chanel. Thèse de Lyon, août 1880.

* Vaquez. Congrès internai, de l'aris, 1900. Sect. d'anat. path.

ÉTUDE DE LA RÉSISTANCE GLOBULAIRE

globules desséchés (Malassez) on voit à quelle difficulté de technique on se heurte.

Méthode d'Hamburger '. — Cette méthode que Limbeck - utilisa le premier pour étudier la résistance des hématies dans les cas pathologiques repose sur un principe différent : elle consiste à chercher le titre de la solution saline dans laquelle commence à se faire Fhémolyse.

On établit d'abord le titre de la solution de chlorure de sodium dans laquelle les globules rouges peuvent être plongés sans qu'il se produise trace d'hémolyse ; c'est la solutiondite de résistance minima.

On étudie ensuite la façon dont se produit l'hémolyse dans des séries de solution à titre décroissant à partir de 0,5 p. 100. La solution dans laquelle quelques globules rouges restent encore intacts et qui précède celle oii l'hémolyse sera complète est dite solution de résistance maxima (Mosso) ^

Sans rappeler ici la technique exacte d'Hamburger, nous décrirons en détail, comme étant la plus pratique, la méthode de Vaquez et Ribierre, qui n'en est d'ailleurs qu'une modification.

Méthode de Vaquez et Ribierre. — Les auteurs insistent particulièrement sur quelques précautions à prendre : l'asepsie doit être parfaite, car les microbes peuvent déterminer l'hémolyse ; ils stérilisent donc la verrerie à l'étuve sèche, et les solutions salines en tube scellé à l'autoclave. La piqûre qui donne du sang doit être faite aussi aseptiquement que possible ; la peau est lavée, puis séchée rigoureusement avec des compresses stérilisées.

Les résultats de l'expérience ne doivent pas être notés trop tardivement, après 24 heures par exemple, car l'hémolyse est alors plus marquée qu'au début. 11 ne faut pas attendre plus de 4 à 5 heures au maximum.

Dans un court espace de temps, les variations de température n'ont pas d'importance.

La solution doit être faite avec du chlorure de sodium fondu et chimiquement pur, et avec de l'eau distillée. Chez l'homme, la défibrination du sang n'est pas nécessaire ; chez le lapin et le chien à cause de la grande tendance à la coagulation, elle est nécessaire. La dilution ne doit être ni trop forte, ni trop faible, la dilution au 50« est la meilleure.

1 Hambuhgeh. Congrès international de Paris, 1900, section d'anat. path,

2 Limbeck. Prag. med. Wochensch., 1890, n"" 28 et 29 et Sem. médicale, 19 déc. 1894.

3 Mosso. R. C. délia Real Accad. dei Linci, 3 avril 1887; Arch. ital. de biologie, 1887, p. 257.

méthodes] DÎVEnSËS.

On prépare à l'avance une solution mère de chlorure de sodium fondu, chimiquement pur dans l'eau distillée au titre de 0,50 p. 100 ^

Cette solution doit être stérilisée à l'autoclave, en tube scellé ou dans un flacon bouché à l'émeri, ce qui permet de conserver la solution tout en évitant sa concentration par évaporation.

D'autre part, on possède une série de 18 petits tubes cylindriques de 3 cent, cubes de capacité, rangés dans deux porte-tubes. Ils ont été au préalable stérilisés à l'étuve sèche.

Les solutions de titres différents sont obtenues en faisant tomber dans une première série de 9 tubes, au moyen d'un compte-gouttes dont l'ouverture est taillée bien carrément, des quantités progressivement décroissantes delà solution mère de chlorure de sodium et croissantes d'eau distillée ; les deux liquides, solution de chlorure de sodium et eau distillée, doivent être répartis toujours avec le même compte-gouttes.

Il faut verser d'abord l'eau distillée et ensuite la solution de chlorure de sodium pour favoriser le mélange.

On verse d abord l'eau distillée de gauche à droite en quantité croissante : 2 gouttes, 4 gouttes, 6 gouttes. . 18 gouttes : puis la solution de chlorure de sodium de gauche à droite en quantité décroissante 48 gouttes, 46 gouttes .. 32 gouttes.

On a ainsi : dans le l^"" tube : 2 gouttes d'eau distillée et 48 gouttes de solution de chlorure de sodium à 0,50 p. 100, ce qui fait un mélange au titre de 0,48 p. 100 ; dans le 2Hube un mélange à 0,46 p. 100 ; et dans le dernier qui contient 18 gouttes d'eau distillée par 32 gouttes de solution NaCl, un mélange au titre de 0,32 p. 100.

Pour obtenir le sang on se sert du procédé habituel de la piqûre du doigt, en prenant les précautions aseptiques d'usage et en s'assurant que la peau est absolument sèche. Pour recueillir le sang, on se sert d'une pipette faite sur le modèle du mélangeur Potain dont la partie renflée contient environ 2 cent, cubes : sur la partie effilée se trouve tracé un trait qui correspond à la 50^ partie du volume total de la pipette.

Le sang est aspiré dans la pipette jusqu'au premier trait tracé à la partie supérieure de la portion renflée. On fait ainsi une série de 9 dilutions sanguines en se servant chaque fois d'une nouvelle goutte de sang qui sourd à l'extrémité du doigtet comme liquide de dilution de chacun des mélanges titrés qu'on a préparé à l'avance.

Les dilutions sanguines ainsi obtenues sont versées dans la série des 9 autres tubes qui n'avaient pas encore été utilisés. Ceux-ci sont fermés hermétiquement avec de petits bouchons de caoutchouc, et numérotés.

1 II ne faut pas employer le chlorure de sodium cristallisé qui contient de l'eau de cristallisation, de sorte qu'on ne pourrait être mathématiquement certain du titre de la solution. II suffit pour obtenir du chlorure de sodium fondu, de placer dans un creuset du chlorure de sodium ordinaire et de le porter à la température de fusion, on le laisse ensuite refroidir dans le creuset.

ÉTUDE DE LA RÉSISTANCE GLOBULAIRE

On laisse les tubes au repos durant 5 minutes afin de laisser aux solutions le temps d'exercer leur action hémolytique.

Fuis on centrifuge les tubes en les plaçant tous dans un centrifugeur à main, ou mieux dans une turbine. Après cette opération, on remet les tubes en ordre dans le porte-tube et on note les résultats.

La technique ci-dessus fournit les deux notions suivantes : \° Le titre de la solution dans laquelle débute l'hémolyse ; 2° Le titre de la solution dans laquelle l'hémolyse est totale.

Les premiers tubes présentent en général un culot de globules rouges surmonté d'un liquide incolore ; il n'y a pas d'hémolyse.

L'hémolyse commence en général pour le sang de l'homme sain, dans le 3« tube qui contient une solution à 0,44 p. 100. Le liquide qui surmonte le culot de globules rouges est alors légèrement teinté en rose. Ce tube dans lequel le début d'hémolyse indique que la résistance des globules les moins résistants a été vaincue correspond à la résistance minima

Dans les tubes suivants, la teinte est de plus en plus foncée, tandis que le culot de globules diminue.

Le tube dans lequel il n'y a plus de culot perceptible et où le liquide rouge ne présente plus d'ondes par agitation, indique une hémolyse totale : on note le titre de la solution qu'ilcontient : c'est ce tube qui correspond à la résistance maxima R-,

Vaquez et Ribierre insistent d'autre part sur rimportance qu'il convient d'attacher à ce qu'ils appellent Vétendue de la résistance. Cette notion est fournie par les différences qui existent entre la résistance minima et la résistance maxima ; en établissant des courbes d'hémolyse ou de résistance, on acquiert ainsi des renseignements beaucoup plus précis.

Méthode de Viola. — A^iola \ dont les premiers travaux remontent à 1894, emploie, pour l'étude de la résistance globulaire, une méthode un peu différente des précédentes :

On prépare 24 solutions de NaCl titrées, à des taux allant de 0,20 à 0,68 p. 100; ces solutions sont réparties dans des tubes de verre à raison de 8 cent, cubes par tube. Dans chaque tube on laisse tomber 2 gouttes de sang ; on riiélange rapicment, et l'on fait trois observations, l'une immédiate, l'autre après 3 heures de repos, la troisième après centrifugation des tubes. De ces trois observations

1 Viola. Gaz. degli Ospedali dei Milano, i 894, p. 115; — etArc/i. de p/iî/si'oZ., janvier 1895, p. 37. — Viola. Il metodo per la misurazione délie resistenze dei g-lobuli rossi. Lavori delL' Islilulo de Clinica inedica générale de Padova, 1902.

MÉTHODËS DIVERâKS.

qu il complète encore par les examens microscopiques, Viola déduit la valeur des 3 résistances : maxima, minima et moyenne.

La résistance maxima est donnée par l'examen microscopique du sédiment obtenu après centrifugation ; le tube dans lequel on voit encore par champ microscopique 3 à 5 globules rouges bien conservés est celui qui indique R*.

La résistance minima R^ est donnée par le degré de coloration après 3 heures ; le tube dont la coloration est incertaine indique R'.

La résistance moyenne R^ est fournie par l'observation immédiate ; le tube où se produit un trouble notable indique R^

Viola note encore les solutions de passage entre la résistance maxima et la résistance moyenne P et p.

Pour le sang humain normal :

Viola a montré la signification différente des variations simultanées ou isolées des trois résistances, maxima, minima et moyenne. Il admet que IV- correspond à l'hémolyse de la majorité des globules du sang de ceux qui sont parvenus à l'état de maturité, tandis que R', qui indique le degré de résistance maxima, correspond à celle des globules les plus jeunes provenant des organes hématopoïétiques ; et que R^qiii indique la résistance minima, répond à l'hémolyse des globules âgés, usés, ayant achevé leur évolution.

Dans les cas pathologiques, il distingue deux ordres de faits : selon que les 3 résistances varient simultanément dans le même sens, en plus ou en moins, tout en conservant les distances qui les séparent normalement (Variations réelles) ; ou bien que les résistances varient indépendamment les unes des autres (variations apparentes).

Les variations réelles correspondent à des altérations chimiques du plasma sanguin (action des acides, des alcalis, de la saignée, etc.). retentissant par suite sur toutes les variétés de globules rouges. Les variations apparentes répondent, au contraire, à des altérations primitives des globules rouges eux-mêmes, ce qui explique qu'elles peuvent porter isolément sur l'une ou l'autre des 3 variétés de globules correspondant aux 3 résistances.

Elles peuvent être dues : 1° à la suractivité des organes hémato-

ÉTUDE DE LA RÉSISTANCE GLOBULAIRE

poïétiques et à la surproduction de globules jeunes, ce qui augmente la résistance niaxima ; 2° à l'intensité plus grande du processus hématolytique et à Fexcès des globules vieillis : ce qui augmente la résistance minima ; 3" à la cessation momentanée ou partielle de la destruction des globules usés, ce qui laisse dans la circulation plus de formes globulaires à résistance minima et augmente par suite la résistance minima.

RÉSULTATS

§ I". — La résistance globulaire à l'état normal.

l'* Chez l'adulte. — Chez l'homme de 20 à 40 ans, la résistance minima correspond :

Suivant Hamburger, lledin, à une solution de NaCI de. . 0,44 p. 100

— Vaquez, — 0,44 à 0,48 —

— Ribierre, — 0,42 à 0,44 —

La résistance maxima correspond :

Suivant Vaquez, à une solution de NaCl de 0,32 à 0,34 p. 100

— Ribierre 0,34 à 0,36 —

2» Sexe. — Vicarelli et Agostini ont signalé chez la femme un certain degré d'infériorité de la résistance globulaire.

3» Age. — h) Chez l'enfant, Chanel a signalé un certain degré d'infériorité de la résistance. Paris et Salomon ont trouvé chez des enfants normaux âgés de 12 mois à 15 ans les chiffres suivants :

Résistance minima 0,44 à 0,48 p. 100

— maxima 0,32 à 0,36 —

Suivant Joua ^ la résistance minima du sang du fœtus est constamment inférieure à celle du sang de la mère ; la résistance moyenne inférieure dans quelques espèces animales est supérieure dans d'autres.

h) D'après le même auteur, la résistance minima du sang du nouveau-né est constamment inférieure à celle du sang de la mère ; la résistance moyenne, par contre, est supérieure. Dès la première

1 JoNA. Rlforma medica, 1895, n" 201.

RÉSISTANCE GLOBULAIRE A l'ÉTAT NORMAL.

heure après la naissance aussi bien chez le fœtus à terme que chez le prématuré, la résistance minima remonte rapidement, tandis que la résistance moyenne varie peu ou augmente légèrement.

D'après Viola, les globules rouges du fœtus venu avant terme, ont une faible résistance ; au contraire, ceux de l'enfant né à terme ont une résistance minima supérieure à celle de l'adulte ; suivant Viola, la résistance globulaire va en diminuant avec l'âge, de l'enfance à l'âge adulte et à la vieillesse ; cette diminution de résistance, en rapport avec l'âge de l'individu, est à rapprocher de l'évolution similaire, lorsqu'on considère la vie d'un globule rouge ; tandis que les globules rouges non encores achevés, les globules rouges nucléés, ont une résistance inférieure, les hématies jeunes, ayant atteint leur complet développement, présentent un maximum derésistance, puis la résistance va en diminuant avec l'âge du globule.

c) Chez, le vieillard, d'après Chanel, la résistance diminue légèrement, il en est de même d'après Viola et d'après Obici ' ; les deux résistances s'abaissent, d'autant plus que l'âge est plue avancé.

4° Espèces animales. — Chez le lapin normal de 2 kilogr. à 2 kilogr. 500, les chiffres observés sont :

Paris et Salomon ■ : = 0,39 à 0,42

Ribierre : R' = 0,42

D'après Ribierre, les variations qu'on observe aux différents âges ne sont pas plus considérables que celles qu'on peut rencontrer chez des individus sains et ne sauraient, en pratique, entrer en ligne de compte. Il en est de même de celles que l'on obtient en se servant des globules rouges du sang artériel, au lieu de globules du sang des capillaires ; si les hématies du sang artériel ont une résistance plus considérable que celles du sang veineux, les différences sont peu considérables.

1 Obici. Revisla di pat/iologia, nevrosa e mentale. Vol. VII, fasc. I, 1902. ^ Pabis et Salomon. Soc. de biologie, février 1903,

KTUUK Dli LA RÉSISTANCE f! LOBULAIRE.

§ II — Résistance g^lobulaire clans les états iiatholog-iques.

Comme le fait remarquer Hamburger lui-même, daus son rapport au Congrès de Paris, la recherche de la résistance globulaire n'a guère augmenté la somme de nos connaissances sur les états pathologiques qu'elle a servi à étudier, et les notions définitivement acquises sont encore bien peu nombreuses.

Ictère. — Un fait, cependant, peut être considéré comme solidement établi, c'est l'augmentation très marquée de la résistance des hématies au cours de Yictère.

Ce fait déjà signalé par Chanel, von Limbeck, Maragliano, Viola, Lang, a surtout été mis en relief par Vaquez. Cet auteur a vu le chiffre de la résistance minima passer de la normale, 0,44 à 0,30 et 0,32 ; la résistance maxima, évaluée à 0,32 à l'état normal, s'étendre à 0,24.

Pour Viola, de même, les trois résistances sont augmentées. Contrairement à ce que nous verrons dans les recherches expérimentales, tous les cas d'ictère, quelle que soit leur origine, semblent donner lieu à l'accroissement de la résistance. Vaquez et Ribierre' l'ont observé dans des cas d'ictère catarrhal, d'ictère infectieux bénin, d'ictère par intoxication éthylique, de cancer du foie, de cirrhose hjpertrophique ; ils ont vu la résistance augmentée chez les cardiaques en état d'asystolie au cours des poussées d'ictère.

Deux facteurs semblent surtout entrer en ligne de compte : l'intensité et l'ancienneté de l'ictère. Mais il ne faut pas oublier aussi l'importance de la gravité de l'affection qui détermine l'ictère ; l'ictère grave s'accompagne d'une résistance plus marquée que l'ictère bénin par rétention.

Chez un malade atteint de cirrhose hypertrophique, Vaquez et Ribierre ont vu la résistance augmenter à mesure que l'ictère s'accentuait. Widal et Ravaut^ ont aussi rapporté un exemple d'augmentation de la résistance globulaire dans un cas d'ictère chronique

1 Vaquez et Ribierhe. Soc. de hiol., 26 juillet 1902.

2 Vaque/ et Ribiehre. Soc. méd. des llôp., 21 nov, 1902. ' Widal et Ravauï. Soc. méd, des Hop., p. 984.