EXAMEN MICROSCOPIQUE DE L'EAU

Lorsqu'on laisse reposer de l'eau dans un récipient et qu'il se forme un dépôt, l'étude microscopique des matières, qui restent au fond du vase, après décantation peut fournir des renseignements intéressants, en dehors même de l'étude des bactéries, doat nous parlerons au chapitre suivant. Parmi les protozoaires qui se rencontrent dans l'eau signalons l'amibe du côlon que Kartuiis a signalé comme l'agent de certaines formes de la dysenterie. On rencontre aussi dans l'eau la Bilharzia hœmatobia dont les œufs épineux provoquent l'hématurie tropicale. L'ankylostome duodénal, qui détermine chez l'homme l'anémie des mineurs après développement, se trouve dans l'eau à l'état larvaire.

- Un petit crustacé du genre cyclops, qui vit dans les eaux stagnantes des pays chauds, renferme souvent l'embryon de la filaire de Médine. De même la douve du foie se développe à l'état d'embryon sur un petit gastéropode (Limnœa irunculata) qui vit dans l'eau douce.

L'eau peut encore contenir et transmettre les œufs des difl'érenls helminthes, qui proviennent de l'intestin de l'homme ou des animaux [taenias, botriocéphale, tricocéphale, ascaris, oxyures, anguillules). La présence de ces œufs dans l'eau dénonce d'ailleurs une contamination fécale.

1. Cependant à côté de cet antagonisme niicrolDien existerait pour certains auteurs dans quelques cas une symlDiose favorable. C'est ainsi que Metchnikoff admet que le bacille cholérique peut se trouver associé à des microbes dont les uns diminueraient, tandis que les autres, au contraire, augmenteraient son action pathogène.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE b85

Les différentes variétés d'infusoires qu'on trouve dans l'eau ne donnent qu'une indication : sur la présence d'une forte proportion de matière organique dans ce liquide.

On rencontre encore des mucédinées, par exemple la levure de bière, qui provient alors des eaux résiduaires d'une brasserie.

Les débris des plantes ou d'insectes indiquent que l'eau est mal protégée à sa source ou sur un point de son trajet.

Les contaminations par des eaux ménagères, des intiltrations de fosses d'aisance, des eaux de lavoirs ou des eaux résiduaires industrielles sont dénoncées par la présence de fibres musculaires, de poils, de fibres végétales, de fragments de laine, de coton, de soie, etc.

On sait que les eaux de surface ont chacune leur faune et leur flore spéciales d'animalcules et de plantes microscopiques (ce qu'on appelle le planklon). Ce plankton varie suivant la nature de l'eau, le climat et les saisons. Comme nous l'avons déjà indiqué à propos des caractères i)liysiques de l'eau, on n'a pu jusqu'ici tirer de l'étude des variations de cette faune et de cette flore que des indications assez peu précises sur la teneur des matières organiques de l'eau.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE

L'analyse bactériologique d'une eau comprend la numération des germes qu'elle contient par centimètre cube, leur spécification, enfin la détermination des agents pathogènes qui la contaminent.

Voici les précautions préliminaires qu'il convient d'observer, de l'avis du laboratoire du Comité consultatif d'hygiène de France, pour faire les prélèvements d'échantillons d'eaux dans de bonnes conditions. Elles sont d'ailleurs le complément des mesures indiquées déjà à propos de l'analyse chimique.

Prise d'échantillon pour Vanalyse înicrobiologique. — Pour ce genre de recherches, on doit toujours prélever des échantillons de deux façons différentes, en usant rigoureusement des précautions suivantes :

1*^ TuDES. — On choisit un tube en verre vert, de 6 à 8 millimètres de diamètre intérieur et de 2 à 2,0 miUimètres d'épaisseur, et on l'étiré à la lampe d'émailleur en fragments de 20 centimètres de longueur en prenant soin de donner à l'effilure de chaque extrémité une longueur de 5 centimètres et de la faire assez épaisse, ce qui est facile en choisissant une canne de verre vert des dimensions indiquées plus haut.

On ferme complètement une des extrémités près le tube et on laisse l'autre librement ouverte à l'air extérieur; on place le tube (qui possède alors une longueur de 25 centimètres environ) dans une gouttière en toile métallique (ou en clinquant) ayant la même longueur que ce tube, et on chauffe au rouge, sur toute la longueur en même temps, à l'aide d'une grille à gaz ou de charbons incandescents.

Lorsque tout le tube est ainsi chauffé au rouge sombre on ferme au chalumeau l'effilure laissée ouverte et on abandonne au refroidissement. On a ainsi un récipient partiellement vide d'air, en raison de la dilatation du gaz à la température à laquelle le tube a été porté, et absolument stérilisé.

Pour prélever réchantillori, on trace un trait, avec un couteau à verre ou une lame de bon acier aiguisée, sur l'une des effilures, on la passe à plusieurs reprises dans la flamme d'une lampe à alcool, on la plonge dans Teau à analyser à quelques centimètres au-dessous de la surface libre, et on brise la pointe à l'endroit du trait, à l'aide d'une pince flambée dans la flamme de la lampe à alcool avant de la plonger dans l'eau.

La pointe une fois brisée, l'eau se précipite dans le tube pour occuper le vide partiel; et il ne reste plus qu'à retirer ce tube de l'eau avec précaution, et à fermer l'effllure ouverte en la faisant fondre dans la flamme de la lampe à alcool.

La lampe à alcool et l'appareil insufflateur du thermocautère de Paquelin, aujourd'hui si répandus, mais surtout la lampe à souder des plombiers sont extrêmement commodes pour ce genre d'opérations. Ils contituent un chalumau portatif.

2*^ Flacons. — Il y a deux procédés pour stériliser les fioles en verre blanc de 150 c. c. de capacité, bouchant exactement à l'émeri, qui doivent servir à ces prélèvements. Le procédé de choix consiste à préparer ces flacons au laboratoire en les chauffant au four à flamber pendant deux heures à iSO degrés. L'autre procédé, applicable sur place, ne doit être employé que dans le cas où la stérihsation par la chaleur est irréalisable.

Dans ce cas, les fioles sont lavées d'abord à l'acide sulfurique à 66° Baumé. Il faut avoir bien soin de mettre chaque point de la surface intérieure de la fiole en contact avec l'acide, de l'y laisser séjourner quelque temps pour être parfaitement sûr de la destruction complète de tout germe : 20 à 25 c. c. d'acide sulfurique du commerce sont largement suffisants pour une fiole de la contenance indiquée.

Après quelques minutes de séjour de l'acide, on vide la fiole et on la rince au moins une dizaine de fois de suite ave(; l'eau dont il s'agit de prélever un échantillon en ayant soin de ne pas mélanger l'acide, même dilué, à l'eau qui devra être prélevée tout à l'heure pour l'analyse.

On rempht alors complètement la fiole avec l'eau à analyser, et on la bouche en ayant soin de passer au préalable, à plusieurs reprises, le bouchon à l'émeri dans la flamme d'une lampe à alcool. Lorsque l'on doit plonger le flacon dans l'eau pour le remplir, on se sert d'une longue pince à extrémités arrondies de façon à serrer le goulot et à maintenir solidement la fiole le plus profondément possible sous l'eau. Bien entendu, on flambera la pince avant chaque opération.

Le bouchon sera fixé sur le flacon au moyen d'une peau ou parchemin ficelé autour du goulot; à la rigueur, le bouchon pourra être plongé après la fermeture ainsi que la naissance du goulot de la fiole, dans de la cire ou de la paraffine fondue.

Il est nécessaire de prélever trois flacons et autant de tubes pour chaque eau à examiner.

Les tubes et les flacons devront être ensuite soigneusement étiquetés ou repérés de façon â ne pas commettre d'erreurs; les trois tubes enroulés de papier sont introduits dans un mince étui en fer-blanc, de même chaque flacon; les étuis seront placés au milieu de sciure de bois, de tan ou de toute autre substance inerte et pulvérulente humide, dans une caisse à doubles parois dont l'intervalle des parois sera rempli d'un mélange de glace concassée (au moins dix kilogr.) et de sciure.

Dans ces conditions la température ne s'abaisse jamais assez pour congeler l'eau, ce qui amènerait la rupture du récipient.

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE 587

Un emballage soigneusement exécuté permet d'envoyer à de très grandes dislances des échantillons d'eau qui peuvent alors être soumis à lanalyse bactériologique dans des conditions presque exactement semblables à celles que pourrait réaliser leur mise en œuvre sur le lieu même du prélèvement.

Dans tous les cas, Tenvoi devra se faire en grande vitesse et dans le plus bref délai possible après la prise d'échantillons.

Il est préférable d'effectuer la préparation des récipients stérilisés dans les laboratoires chargés d'effectuer les analyses. Ce matériel s'expédie facilement.

C'est ainsi que procède le laboratoire du Comité consultatif d'hygiène publique de France, qui tient à la disposition des locahtés, dans lesquelles on ne pourrait trouver une personne suffisamment exercée aux manipulations indiquées, des tubes et des flacons stérilisés à l'avance et qu'il ne reste plus qu'à remplir en suivant strictement les précautions relatées précédemment.

D'après Pouchet et Bonjean pour l'analyse de l'eau il faudrait procéder aux recherches bactériologiques dans Tordre suivant :

r Ensemencements généraux en vue de la numération, de la spécification et des recherches des germes pathogènes.

2" Numération.

3° Spécification.

Recherche générale des espèces pathogènes ou suspectes et des associations dangereuses; expérimentation physiologique.

5° Recherche spéciale du bacille du côlon et du bacille typhique. Expérimentation physiologique, séparation des deux espèces.

Culture et nurnération des germes. — Voici la technique à suivre d'après R. Wurtz pour procéder à la numération des germes de l'eau.

RÈGLES GÉNÉRALES. — Pour procédor à l'analyse bactériologigue d'une eau quelconque, il faut d'abord que cette eau ait été recueilhe avec pureté et, autant que possible, immédiatement avant de l'ensemencer, car l'on sait avec quelle prodigieuse rapidité certaines bactéries aquatilcs se multiplient dans l'eau, à une température même assez basse.

Si l'eau que l'on doit analyser est envoyée de loin, il faudra la faire recueillir dans des récipients de verre stériHsés, comme nous l'avons indiqué plus haut.

On devra expédier l'échantillon à analyser dans la glace afin que les germes que l'eau contient ne puissent, pas se multiplier. En effet, outre que la pullulation des germes fausserait les résultats de l'analyse au point de vue de la numération de ces germes, s'il existe, en unités peu abondantes dans cette eau, des microbes pathogènes, ils ne pourraient être décelés par l'analyse : la pullulation des bactéries banales empêcherait leur développement.

On peut employer la méthode de Koch sur milieu solide, ou la méthode de Miquel en milieu liquide ;

1° Méthode de Koch. — Pour analyser une eau par cette méthode, i) faut : 1° Deux pipettes, de 2 c. c. chacune, graduées en dixièmes de centimètre cube; Un ballon jaugé de 100 c. c. ; '

o88 L^ATMOSPHÈRE, LE SOL ET L'ëAU

3° Des tubes de gélatine, et des plaques de Pelri stérilisées, en nombre suffisant ^ On stérilise les pipettes et le ballon au four Pasteur, puis on remplit le ballon, jusqu'au trait, avec de l'eau distillée et on le stérilise à l'autoclave pendant 15 minutes à 115°. D'autre part, on a fait fondre les tubes de gélatine dans l'étuve

On casse le récipient contenant l'eau à analyser dans une capsule de platine, préalablement stérilisée, et on prélève, avec une des pipettes, 1 c. c. de l'échantillon. On fait déboucher le ballon par un aide et, tenant l'orifice de la pipette bouché avec le pouce, pour être plus sûr de la manipulation (fig. 78), on laisse tomber, dans le ballon, 1/10 de c. c. de l'échantillon. L'aide rebouche immédiatement le ballon.

On a ainsi une dilution au millième; c'est dans cette dilulion qu'un i)rélèvera, avec la seconde pipette graduée, 1/10 de c. c. que l'on répartit dans un tube de gélatine préalablement Hquéfiée ^, de la sorte chaque tube contiendra 1/10 000 de c. c. de l'eau à examiner; il faudra donc, quand on aura compté les colonies qui se seront développées sur chaque plaque, multiplier leur nombre par 10 000 pour avoir le nombre de germes contenus dans 1 c. c. de l'échantillon examiné. On agite bien le tube et on verse la gélatine, ainsi ensemencée, sur une plaque de Pétri.

On devra faire vingt ou trente plaques de la même façon. On les mettra à l'étuve à 20 ou 22° et on surveillera attentivement le développement des colonies; généralement, il aura atteint son maximun au bout de trois jours.

On procédera alors à la numération et à la détermination des Fig. 78. colonies.

Pour la numération, on place la plaque sur une lame de verre quadrillée qui permet de compter systématiquement les colonies, comme on compte les globules dans Thématimètre.

Si l'on n'a pas de plaque quadrillée, on arrive à un résultat tout aussi bon en traçant avec une plume et de l'encre, sur le fond de la plaque de Pétri, un quadrillage, qui n'a même pas besoin d'être très régulier. On effectue ainsi la numération :

Supposons que sur une des plaques, on trouve trois colonies avec la dilution que nous avons indiquée, il faudra multipHer par 10 000 le nombre des colonies trouvé

1. Au laboratoire du Comité consultatif d'Iiygiène de France on emploie pour l'analyse de l'eau le milieu de culture suivant :

Peptone sèche ta gr.

Sucre 10 —

Sel marin. lU —

Glycérine 3 —

Gélatine (carie d'or) 150 — (été), 140 gr. (hiver).

Agar-agar 4 — — 2 — —

Eau filtrée q. s. pour compléter un litre.

Ce milieu de culture ne fond à la chaleur qu'entre 30 et 34 degrés.

2. On pourra faire de même une dilution au 100^ si Peau est très pure. Suivant la richesse de l'eau en germes, on devra faire des dilutions de plus en plus grandes. On peut encore, si l'on veut augmenter le nombre de colonies dans chaque plaque, semer dans chaque tube 2, 3 ou 4 dixièmes de c. c. de la dilution primitive au 100^

ANALYSE BACTÉRIOLOGIQUE 589

sur chaque plaque pour avoir le chiffre d'unités microbiennes contenues dans 1 c. c, soit 30 000. On prendra la moyenne de vingt à trente plaques, faites de la même façon, pour avoir un résultat plus précis. Pour éviter les causes d erreur, dues aux germes de 'air et aux moisissures en particulier, il est bon de faire six plaques avec des tubes de gélatine non ensemencés, plaques dont on ôtera le couvercle une fois (comme celui des plaques ensemencées). S'il pousse, par exemple, deux colonies en moyenne sur chacune de ces plaques, on défalquera deux colonies sur chaque plaque ensemencée.

Il y a avantage à se servir, pour l'analyse de l'eau, de tubes qui sont une modification des tubes d'Esmarch. On y verse 7 à 8 c. c. de gélatine, que l'on ensemence à la manière ordinaire, et que Ton place horizontalement pendant que la gélatine refroidit. On les coiffe d'une capote de caoutchouc et on peut les conserver ainsi pendant le temps voulu. La figure 79 montre un dispositif commode pour placer à l'étuve à ^^"^ les tubes d'une même analyse d'eau. C'est une boîte en bois blanc, ouverte d'un coté, el divisée en compartiments par des fils de fer.

La détermination des colonies exige la connaissance approfondie des caractères des colonies de chaque microorganisme en particulier. Nous renverrons pour cela aux ouvrages qui traitent de l'étude des microorganismes; nous rappellerons seulement que quand on a cru reconnaître une colonie avec un objectif faible, on la prélève avec l'anse de platine ainsi qu'il a été indiqué, puis on l'examine au microscope; s'il y a lieu, on la réensemence ensuite dans les milieux appropriés.

2° Méthode de Miquci. — La méthode de dilution de Miquel est beaucoup plus précise, pour la numération des bactéries, que la méthode de Koch: mais, pour la recherche de tel ou tel microorganisme, elle est moins commode. Voici comment il faut opérer si l'on emploie cette méthode :

On prépare une centaine de tubes contenant chacun 10 c. c. de bouillon stérilisé.

Dans un premier tube Tj, on introduit, avec une pipette, 1 c. c. du liquide à analyser.

Dans un second tube T,, on introduit 1 c. c. du contenu T ^. Le tube T, contient M c. c. ; on les répartit dans onze nouveaux tubes Tg, T ' 3, T-3, etc.

On répartit le contenu du tube T3 dans onze tubes (T^, T etc.).

Les vingt et un tubes ainsi préparés, avec T, et T3 qui ont été vidés complètement, sont mis à l'étuve pendant quelques jours, ou mieux quelques semaines.

Si le bouillon se trouble dans tous les tul)es, il faut repeler l'analyse et i)0usserla dilution plus loin. Si quelques-uns seulement poussent, on peut calculer approximativement le nombre des germes contenus dans la prise d'essai, d'après le principe suivant : on suppose que la dilution a été assez faible pour que chaque tube ne contienne qu'un seul germe. D'après Miquel, lorsqu'un tube sur deux est resté stérile, les bouillons troublés l'ont été par un seul germe. On voit que cette méthode

repose sur une sorle de poslulalum, mais elle a donné à Miquel des résultais très précis.

Miquel pratique actuellement ce qu'il appelle le procédé mixte. Il dilue Peau à analyser au i/100 ou au 1/1000, suivant qu'il suppose l'eau plus ou moins riche en microbes. Cela fait, il l'introduit à la dose de une à deux gouttes dans un flacon conique à large base (environ 9 centimètres de diamètre) dans lequel se trouve de la gélatine stérilisée et liquéfiée au bain-marie; cette gélatine forme, au fond du tube, une couche d'environ 2 millimètres. Une fois les gouttes d'eau introduites, il secoue le vase horizontalement pour disséminer les germes et il le met à l'étuve. L'eau étant très diluée, chaque flacon ne contient que deux ou trois germes au plus et on n'a pas à craindre l'envahissement des colonies qui liquéfient la gélatine. On peut donc, ce qui est un avantage sérieux, laisser longtemps les tubes dans l'étuve à 22°.

Un inconvénient de ce procédé, c'est que la forme du flacon, qui est conique et à large base, ne permet pas de repiquer facilement les colonies et encore moins de les examiner au microscope.

La spécification des microbes de l'eau est bien difficile à faire d'une façon complète, car nombre des espèces microbiennes qu'on peut rencontrer dans l'eau sont encore mal déterminées.

On cherchera à reconnaître à la lou])e ou avec un objectif très faible les caractères des diverses colonies, lorsqu'elles sont bien développées, du S*" au 15*" jour en général. On recherchera, à l'examen en goutte suspendue sans coloration et après dessèchement sur lamelle et coloration, l'aspect morphologique des microbes formant la colonie.

Enfin on pratiquera son ensemencement et on poursuivra son étude sur les différents milieux de culture usuels de laboratoire.

La recherche des agents pathogènes peut être conduite de façons différentes. On peut y procéder, d'une façon assez grossière d'ailleurs, par l'inoculation à un animal d'une culture mixte obtenue en ensemençant 30 à 40 c. c. de l'eau à analyser dans un ballon contenant 10 c. c. de bouillon.

Voici la technique préconisée par Pouchet et Bonjean :

Le ballon ainsi ensemencé est laissé 8 jours à l'étuve à 86". A ce moment avec le liquide de culture on pratique à un cobaye une injection intra-péritonéale de 0^«,3 à 0<^%5 pour 100 du poids de lanimaL

On relève la température et le poids de l'animal matin et soir, jusqu'au 8^ jour et plus si c'est nécessaire.

Les eaux très pures ne provoquent pour ainsi dire pas de réaction thermique.

Les variations notables de poids et de température, les abcès, les selles diarrhéiques sont des indices de la présence de bactéries nocives.

Si l'animal succombe, l'examen bactériologique du sang, des excrétions et des sécrétions normales et pathologiques peut permettre d'isoler à l'état de cultures pures des microbes pathogènes qui se trouvaient dans l'eau.

En résumé cette recherche par l'inoculation à l'animal d'un liquide dans lequel s'est multiphé l'ensemble des microbes contenus dans une eau peut fournir des renseignements de quelque valeur. Mais il faut bien se garder de tirer aucune conclusion du fait que l'expérience a été négative et que l'animal injecté n'a pas été incommodé.

DÉRIVATION ET CAPTAGE DES BAUX SOI D'ailleurs ce procédé ne permet pas de constater la présence du Lacille du côlon et du bacille d'Eberth, lorsqu'ils existent dans l'eau. Cependant ces microbes sont certainement des plus intéressants, au point de vue de la valeur potable d'une eau, parmi les pathogènes qu'elle peut contenir.

Aussi convient-il de faire une recherche spéciale de ces deux espèces bactériennes au moyen du bouillon phéniqué. On distinguera ensuite le bacille du typhique du baclerium coli en tenant compte des caractères différentiels que nous avons indiqués (p. 97).

Lorsqu'il y a lieu de rechercher le bacille du choléra dans une eau suspectée on utilisera l'ensemencement dans l'eau peptonée et salée (p. 118).