I. — EXAMEN DU SANG

Le parasite du paludisme vit dans les globules rouges. 11 nous faut donc aller le chercher dans le sang si nous voulons le trouver, le reconnaître et l’étudier. Suivant le but qu’on se propose, la technique diffère.

Lorsqu’on veut se contenter du simple diagnostic de paludisme, il suffît d’étaler du sangsur une lame et de le colorer par un procédé rapide.

Veut-on reconnaître la nature du parasite qui cause la maladie? On emploie un procédé de coloration plus lent, mais plus électif et plus précis.

Enfin, quand il s’agit d’étudier l’évolution du parasite, il faut avoir recours aux examens de sang frais entre lame et lamelle ou en goutte pendante.

Nous envisagerons dans la description technique qui va suivre la manière de se comporter dans chacune de ces alternatives.

Prélèvement de sang. — On extrait le sang par piqûre avec une aiguille ou une épingle flambée, de l’extrémité d’un doigt, de préférence le médius ou l’annulaire, qui sont moins sensibles que l’index. Dans certains cas, il est préférable de s’adresser au lobule de l’oreille.

On commence par nettoyer soigneusement la peau avec un linge imbibé d’alcool. On enlève ainsi les graisses et surtout la sueur qui déforme très rapidement les globules rouges. Une goutte d’alcool qu’on évapore en soufflant dessus termine la toilette. Entre le pouce et l’index de la main gauche, on saisit le doigt du malade et on en presse l’extrémité pour congestionner la phalangette. Cette pratique rend la piqûre tout à fait indolore. Il vaut mieux piquer l’extrémité de la phalangette près des bords qu’à la partie médiane. On obtient du sang plus longtemps. L’aiguille, avec un peu d’habitude, peut être maniée légèrement et si rapidement que le patient s’aperçoit à peine de la petite blessure qu’on lui fait.

La première goutte de sang s’étale souvent sur la peau, il cou-

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vient de ne pas s’en servir. On l’essuie et on en lait sourdre une nouvelle. Celle-ci, pour ôtre bonne, doit être petite comme la tête d’une épingle et bien sphéri([ue.

On approche d’elle une lame bien propre cpi’on lient par les bords entre deux doigts. On la touche très délicatement, de façon à ce qu’elle soit comme happée. Il ne faut pas l’écraser, elle ne fournirait pas une bonne préparation.

De la main gauche, on saisit la lame par l’extrémilé au voisinage de laquelle on a déposé la gouttelette à étaler. De la main droite, on vient appliquer sur la goutte la tranche d’une lamelle qu’on tient inclinée à 4b°. Par capillarité, le sang s’étend tout le long du bord de cette lamelle. Si l’adhérence sur toute la ligne de contact ne se produisait pas spontanément, il faudrait la provoquer par de petits mouvements de va et vient, car elle constitue une des conditions indispensables à réaliser, pour obtenir un

bon étalement.

A ce moment on fait glisser sur la couche de sang lentement et

légèrement, sans appuyer, la lamelle vers l’autre bout de la lame. Si la manœuvre est bien faite, il se dépose une couche de sang tellement mince qu’aucun globule ne chevauche sur l’autre et que tous se touchent par leur circonférence.

Le sang doit sécher à mesure derrière la lamelle. On active cette dessiccation en soufflant légèrement.

Cette pratique, enseignée

Fig. 46. — Manière d’étaler le sang.

1 , d’après le procédé de Borrel ( i ) ;

2, et celui de Janezo et Rosenberger (2). La flèche indique la direction suivant laquelle

il faut faire glisser la lamelle sur la lame.

au cours de l’Institut Pasteur depuis 1894 P^^r Borrel, a etc imitée un peu partout. La lamelle, qui est particulièrement commode, peut être remplacée par la tranche d’uu objet à bords rectilignes quelconque, une feuille de carton ou de papier, une autre lame, une aiguille, une baguette de verre, etc. Janezo et Rosenberger (i) ont proposé d’étirer la goutte au lieu de 1 écraser. On la loge dans celui qui est le plus aigu des deux angles dièdres formés par la lame et la lamelle, et on conduit le couv reobjet jusqu’au bout de la lame, en laissant toujours cet angle en arrière. Les deux figures ci-dessus indiquent le sens du mou^ement qu’il faut imprimer à la lamelle, quand on se sert du procédé de Borrel (fîg. 4b, O ou qu’on emploie celui de Janezo et Rosenberger (fig. 4C, 2).

(i) Janczo et Rosenhbrce», Dcul. Arch.f. klin. Med., l. LVII, i8g5.

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Quand on maiulieul très exactement le contact entre la tranche delà lamelle et la face de la lame, on arrive, par ce dernier mode d’étalement, à obtenir une mince couche de sang’, parlai tement étalée. Les globules se déposent naturellement, parla seule force de l’adhérence capillaire, sans être pressés, déchirés ou écrasés. Le procédé est bon, mais, comme le précédent, il demande, pour être bien manié, un peu d’apprentissage. Souvent, même entre des mains exercées, la préparation se termine brusquement par un bourrelet de sang dans lequel sont contenus la plus grande partie des leucocytes.

Dès qu’il est sec, le sang doit être mis à l’abri des mouches. Très friands d’hémoglobine, ces insectes la dissolvent à l’aide de leur liquide salivaire et entaillent rapidement la préparation, qui reste criblée de petites découpures circulaires faites comme à Temportc-pièces.

On met obstacle à l’action néfaste des mouches en fixant les globules.

DIAGNOSTIC RAPIDE. — La préparation sèche est fixée en versant à la surface quelques gouttes d’alcool absolu dont on humecte toute la couche de sang et qu’on rejette rapidement. On enflamme ce qui reste. L’alcool brûle très vite et porte la lame à une température voisine de 5o°, très favorable à la coloration. Celle-ci se pratique avec avantage par la thionine phéniquée qu’on laisse en contact seulement lo à i5 secondes et qu’on rejette par un simple jet d’eau. Après avoir été rapidement séchée entre deux feuilles de papier de soie, la préparation est bonne à examiner. La thionine phéniquée, par la grande variété de ses effets métacliromatiques, est un colorant de choix comme nous l’avons fait ressortir, depuis 1897 (i).

Le métachromatisme est encore accentué par différenciation soit à l’alcool absolu, soit à l’acétone. Cette teinture colore les globules rouges en vert clair tirant sur le gris, les noyaux des globules blancs ressortent en violet foncé sur le protoplasma teint en bleu très pâle. Les plaquettes apparaissent en bleu un peu plus foncé. Quant aux parasites, ils se détachent en rouge vif dans les globules rouges. La chromatine prend une teinte violet noir. Aucun colorant n’est plus commode, ni plus électif. Malheureusement les préparations se conservent mal, à moins, cependant, qu’elles ne soient montées à l’huile de cèdre ou conservées sans lamelle à l’abri de la lumière.

La thionine préparée par simple dissolution de la matière colorante dans l’eau phéniquée doit mûrir avant d’être bonne i\ employer. Ce serait là un vice rédhibitoire qui pourrait la faire

(i) E. MAnenoux, le Paludisme au Sénégal (An. de l’Inst. Pasl., 1897).

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rejeler, s’il n’existait un moyen d’obtenir la maturité immédiate de la solution. La tliioiiine de Merck est dissoute jusqu’à saturation dans de l’eau distillée et précipitée ensuite par une .solution, de soude caustique d’un titre quelconque. Le précipité est recueilli sur un fdtre, lavé jusqu’à ce que le liquide qui s’écoule ne soit plus alcalin et introduit dans un flacon où on le dissout juarni’à saliiration dans l’eau phéniquée à 2 0/0. Après 24 heures de repos, la solution est prête à employer, elle donne de bons résultats et n’a pas besoin d’être fdtrée.

Au lieu de thionine, on peut employer l’hématéine alunée, ou le bleu boraté qui se préparent comme suit :

\ Hcmatéine 1 gramme-

^ ' } Alcool absolu 50 —

(2) Solution bouillante d’alun de potasse à 5 0/0. ... d litre.

On mélange ces deux solutions.

En vieillissant le mélange rougit et colore moins bien. Aussi vaut-il mieux garder séparément les deux solutions. Au moment de l’usage, on ajoute à la quantité de la solution 2 dont on veut se servir quelques gouttes de la solution i, jusqu’à obtenir une teinte d’un beau violet. La préparation estcolorée en 5 minutes environ. Le noyau des globules blancs et les parasites sont teints en violet. Ces derniers ressortent mieux quand on teint les globules rouges en rose par une solution très faible d’éosine, 2 ou 3 gouttes d’une solution à i/iooo dans un verre de montre plein d’eau.

Le bleu de méthylène boraté se prépare en dissolvant i gr. de bleu à chaud, mais sans porter à l’ébullition, et 2,5 0/0 de borax dans 100 cc. d’eau distillée. La solution n’est bonne qu’au bout de quelques jours pendant lesquels il convient de l’agiter fréquemment. Pour l’emploi, on verse quelques gouttes seulement de la solution précédente dans une quantité d’eau telle que le mélange présente une teinte très claire.

Le sang est coloré en un instant. Les globules rouges sont grisâtres, les noyaux des leucocytes violet rouge, les parasites bleus.

COLORATION LENTE. — Les colorations ne réussissent bien que sur les préparations fraîches. A la longue, le protoplasma perd toute affinité pour les couleurs. La chromatine seule est mise en relief. Dans d’autres cas, c’est le phénomène inverse qui se produit.

Fixation. — La préparation étalée peut être fixée à l’alcool absolu. Il suffitde répandreà la surface de la lame reposant à [ilat sur une table, et, goutte à goutte, assez d’alcool pour recouvrir toute la couche de sang. Quand l’alcool est évaporé, la prépara-

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lion est fixée. On peut encore la fixer en la |)longeant pendant 10 minutes dans iin mélange d’alcool et d’éther à parties égales.

Schaudinn conseille d’opérer la fixation avant la dessiccation du sang', à l’aide du sublimé alcoolique préalablement chauffé à fio-yo®. Ce fixateur, qui peut aussi s’em[)loyer à froid et après dessiccation, se prépare en mélangeant à 2 parties d’une solution saturée de sublimé dans l’eau, une partie d’alcool absolu. Quelques minutes de contact suffisent. On porte ensuite la préparation dans l’alcool à fio 0/0 additionné d’un peu d’iode, dans l’alcool à 90^*, dans l’alcool absolu, puis de nouveau dans l’alcool à 90°, à 60° et dans l’eau.

On peut aussi fixer la préparation par les vapeurs d’acide osmique. On l’enferme, avant dessiccation, dans une boîte en verre an fond de laquelle on a mis quelques gouttes d’une solution à 2 0/0 d’acide osmique et, pour éviter le ratatinement des noyaux, quelques gouttes d’acide acétique pur. La lame reste naturellement debout et ne plonge pas dans le liquide.

Coloration. — En 1891, Romanowsky(i) annonçait qu’il colorait un noyau dans les parasites du paludisme par un procédé qui porte toujours son nom, mais qui a subi de nombreuses modifications. Il fixait la préparation par chauffage à 120° pendant I heure, puis il la plongeait dans un mélange d’une partie de bleu de méthylène en solution concentrée et de 2 parties d’éosine à i 0/0.

Cette méthode a été reprise et perfectionnée par Ziemann (2), Nocht(3),Borrel, Laveran (4),puis par Michaelis (5) et Maurer (6). La modification consiste à décomposer une solution de bleu de méthylène par une base, oxyde d’argent dans le procédé de Borrel, ammoniaque, soude ou potassedans les autres. On provoque ainsi la formation de deux nouvelles couleurs, l’azur et le violet de méthylène, qui se combinent avec l’éosine sur la chromatine pour donner une coloration d’un rouge vif, très agréable à l’œil.

Bleu Borrel. — Il se prépare de la façon suivante. On précipite par une solution de soude à un titre quelconque une solution de nitrate d’argent. On recueille sur un filtre le précipité gris sale qui se forme, on le lave à l’eau distillée jusqu’à ce que le liquide

(1) Romanowsky, Parasitologie et traitement de la malaria en Russie. Saint-Pétersbourg, 1891.

(2) Ziemann, Eine wirksame Méthode der Chromatiii und Hlutfarbung, in Ueber Malaria und andere Blutparasitcn, lena (Gustav Fischer), 1908. — Eine Méthode der Uoppellarbung bci Flagellatcn, Pilzen, etc. (Cenl.f. Dakt., t. XXIV, déc. i8()8).

(3) Nociit, Zur Farbung der IMalaria parasitcn (C'en/. /'. Dakl., t. XXIV, 1898 et t. XXV, 1899). ^

(4) Lavehan, Sur un procédé de coloration des noyaux des hématozoaires endo<>-lobulaires des oiseaux (C. IL Soc. de Biol., i5 avril 1899].

(5) Mioiiaeus. Das Methylenblau und seine Zersetzùngs produictc {Cenl. f Bakt

Impartie, t. XXIX, 1901). \ J

(o; MAt.itEii, Die Tüpl'elung der Wirthszclle der Tertiana parasiten (Cent. f. Dakt., t. XXVIII, 1900).— Die Malaria perniciosa (Cen/. /. Dakt. uricj., I. XXXII, 1902).

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qui s’écoule ne bleuisse plus le papier roui>é de tournesol. On jette ensuite ce précipité dans une solution concentrée de bleu de méthylène médicinal de llochst. Il se fait peu à peu une combinaison qu’on active par des aj^itations quotidiennes. Plus le bleu est vieux, meilleur il est. 11 commence à être bon au bout de 1 5 jours.

On peut obtenir une couleur immédiatement mûre en chauffant le bleu à l’argent fraîchement préparé pendant .3/4 d’heure à l’autoclave à 120°.

Voici comment il convient de colorer les préparations fixées. On les place dans un récipient en verre contenant environ 80 cc. Le flacon de Borrel convient parfaitement.

A 60 ou 70 cc. d’eau de robinet, on ajoute 10 gouttes de bleu à l’argent et 2 ou 3 gouttes de solution à i 0/0 d’éosine de HôchstB.A. On y plonge iminédiateinent les préparations séparées les unes des autresetonles agile constamment en veillant à ce que la couche de sang soit bien recouverte. Au bout de 10 minutes, on retire la préparation, on examine si elle est assez colorée et on la traite rapidement par une solution de tanin à l’éther à 5 0/0.

Le tanin donne une légère différenciation, mais il fixe surtout assez énergiquement la couleur sur la chromatine, si bien qu’après avoir lavé et séché on peut enlever à l’alcool absolu, manié avec précaution, tous les dépôts qui se forment en général sur les préparations ainsi traitées.

Un bon procédé consiste à surcolorer toujours et à décolorer ensuite par l’alcool absolu. On suit au microscope la décoloration qu’on arrête de temps en temps par lavage à l’eau, et qu’on reprend ensuite, si on la juge insuffisante.

De cette façon, on arrive à coup sûr à avoir de bonnes préparations.

Procédé de Maurer. — Au lieu de bleu à l’argent, Maurer (i) conseille d’employer du bleu à la potasse, qu’on prépare en ajoutant à une solution à i O/'ode bleu méthylène médicinal de Hôchst I 10 0/0 de potasse caustique. On laisse aussi mûrir la solution qui est bonne en 5 à 6 semaines. Un chauffage à 120» pendant 3/4 d’heure peut donner un bleu, immédiatemeiU utilisable.

Les préparations sont fixées à l’alcool-éther pendant i 4d’heure.

On fait alors et séparément les deux dilutions suivantes :

1“ A 26 cc. d’eau de robinet on ajoute 10 gouttes ou i5, 20 de bleu suivant le degré de maturité;

2° A 25 c. d’eau de robinet on ajoute i5 gouttes d’une solution à i/iooo d’éosine pure de Griibler.

(i) Maurer, loco cilato.

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yi

Les deux soliüions sont mélangées intimement dans le récipient qui contient les préparations.

On agite constamment ])endant 5 minutes en veillant à ne pas découvrir la couche de sang, puis on rejette la couleur en versant de l’eau dans le récipient. Eu faisant déborder, on élimine la pellicule à rellets métalliques qui surnage la couleur et salirait la préparation.

Maurer conseille d’abaisser la coloration, si elle est trop forte, par lavage à l’eau après dessiccation. L’alcool absolu manié avec précaution donne aussi d’excellents résultats.

Procédés de Giemsa, Leishman, Marine. — Au lieu d employer deux liquides, on peut colorer en une fois à l’aide de teintures vendues toutes préparées, qui sont d’un emploi commode, mais ne donnent jamais des colorations aussi brillantes.

Trois couleurs sont plus spécialement connues.

1° La couleur préparée par Grûbler sur les indications de Giemsa (i) se compose d’Azur II Grübler et d’éosine dissous dans la glycérine et l’alcool méthylique. On l’emploie, à raison de I goutte de matière colorante par ce. d’eau. La coloration est bonne en 10-20 minutes, mais on peut, dans certains cas, la prolonger, pendant 24 heures et plus, sans inconvénient. On lave à l’eau et on sèche la préparation.

Pour colorer du sang recueilli depuis longtemps, Giemsa conseille d’ajouter, pour 10 cc. de liquide, i goutte dépotasse à i 0/00. Billet recommande de renforcer la couleur avec une goutte de bleu carbonaté préparé en additionnant de o gr. 26 de carbonate de soude pour une solution de bleu médicinal de Hôchst à I 0/0 et en la maintenant pendant 24 heures à 5o-55°.

2“ La couleur de Leishman (2) préparée par Borroughs and Welcomme, à Londres, en petites pastilles qu’on dissout dans 10 cc. d’alcool méthylique donne aussi de bons résultats, mais elle teinte toujours faiblement. Comme elle est dissoute dans l’alcool méthylique absolu, elle ne nécessite pas de fixation préalable. On verse la couleur sur la lame de façon à recouvrir la couche de sang. On laisse 2 minutes au contact, puis on ajoute une égale quantité d’eau distillée. Au bout de 5 minutes, on lave à l’eau. La couleur de Leishman ne laisse jamais de dépôts.

3° Le BleuMarino (3) est aussi dissous dans l’alcool méthylique et ne nécessite pas non plus de fixation préalable.

(i) Giemsa, l’àrbcmethodcii fur Malaria Parasilcn. (Cent. f. Bakt. Oviçf.,\. XXXII, 1902). — Eine V^ereint'achunguin Vcrvollmornmung mcincr Mcthylcnazur., McUivlenlilau, Eosin. — Earbemethode zur Erzielun^ der Homanowsky. — NocliL’schcn, GÎiroiiialin farbung (Cent. f. Uakl. Orig., l. XXXVll, 190/1).

(a) \V. B. Leishman, Noies 011 Homanowsky staiiiing (Joiirn. R. Army med. C., 1904). — Deep chroinatin staininç in malaria (T/ie Lancet, mars 1904). — A melliod ■of producing cliromalin staining in sections [Jourri. of hyg., l. IV, 190b).

(3) Maiuno, Coloration des protozoaires et considération sur la neiiiropliilic de leur noyau [Ann. de l' Inst. Rast., 1904;.

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Au lieu de l’étendre d’eau, on Taddilionne d’éosineà i/iooo.

La coloration est élective et ne laisse pas de dépôts, mais elle est un peu faible.

Tous ces procédés de coloration donnent plus ou moins aisément, suivant (|u’on a ou non l’iiabitude de les manier, les mêmes résultats. Les globules rouges sont teints en rose, les plaquettes, les noyaux des globules blancs et la chromatine des parasites en violet rouge plus ou moins vif, le protoplasma des hématozoaires et celui des leucocytes en bleu. Mais la chromatine est toujours chargée et augmentée de volume, on s’en aperçoit en colorant par les procédés que nous allons indiquer et qu’il faut toujours employer concurremment.

Coloration à l’hématoxyline. — Après fixation du sang au sublimé acétique

Solution saturée de sublimé corrosif ;

Acide acétique 10 »/o ;

OU au sublimé alcoolique de Schaudinn, les préparations sont plongées soit dans de l’hématéine alunée préparée comme il a été dit plus haut, soit dans l’hématoxyline Delafield, qui se prépare comme suit.

Hématoxyline Delafield. — Dissoudre 4 gr. d’hématoxyline dans 25 cc. d’alcool fort et ajouter 4oo cc. de solution saturée d’alun (3, 5 à 4 ^/o.) Laisser le tout exposé à la lumière, la bouteille débouchée pendant 3 ou 4 jours. Filtrer et ajouter loo cc. de glycérine et loo cc. d’alcool méthylique pur. Laisser reposer six semaines à deux mois. La solution mûrit et prend une couleur assez foncée. On filtre à nouveau et on conserve dans un llacon bien bouché.

Au lieu d’hématoxyline, on peut se servir d’hématéine, et on a une solution immédiatement mûre.

Cette teinture est très énergique et ne s’emploie qu’étendue d’une grande quantité d’eau.

Hématoxyline au fer. — On se sert aussi avec avantage de l’hématoxyline au fer de Heidenhain.

La préparation est plongée dans une solution d’alun ferrique (sulfate double d’ammoniaque et de sesquioxyde de fer) à 2 ou 4 o/o pendant 24 heures, lavée à l’eau rapidement, et colorée pendant 24 heures dans la solution suivante:

Hématoxyline cristallisée 1 R'i’.

Alcool fort 10 gr.

Eau 190 gr.

On rince à l’eau et on reporte de nouveau dans la solution d’a-

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km de fer qui décolore. Il faut suivre ladécoloralion au microscope et Tarrêler par lavage à l’eau quand on la juge suffisante.

Sang non étalé. — Procédé de Schaudinn. — Au lieu d’examiner du saiïg’ étendu sur lame, il est quelquefois utile d’observer le parasite dans des g'iobules non déformés par l’étalement. Voici comment on doit opérer.

On reçoit quelques gouttes de sang dans un tube à centrifugation, contenant une certaine quantité du mélange d’Hermann chauffé de 6o à 70°.

Acide acétique • t ce

Acide osmiqiie à 2 0/0 4 cc.

Chlorure de platine à 1 0/0. .. t5 cc.

On porte de suite à la centrifuge, on rejette le fixateur et on lave abondamment à plusieurs reprises.

On ajoute alors quelques gouttes d’hématoxyline Delafield et, après une heure, on examine dans l’eau ou la glycérine.

Ou bien, toujours par centrifugation, on passe parl’alcool absolu, le xylol et on monte à l’huile de cèdre.

Au lieu du mélange d’Hermann, on peut aussi employer, de la même façon, le sublimé alcoolique et colorer par l’hématoxyline à l’alun de fer.

Examen à l’état frais- — Toutes les préparationsdesang coloré, quelles que soient les méthodes qu’on emploie, ne donnent que des images du parasite pris à un moment de son existence et fixé dans la position qu’il occupait à ce moment-fà. Si on désire pénétrer plus intimement dans les phénomènes vitaux de cet organisme, si on veut assister à son développement, surprendre les divers phénomènes qui accompagnent sa nutrition et sa multiplication, il est indispensable de l’examiner à l’état frais sans coloration.

On n’arrive pas d’emblée à percevoir les détails de structure de l’hématozoaire et il est indispensable de faire tout d’abord l’éducation de son œil. Un des meilleurs moyens pour y parvenir, celui que conseille Schaudinn, est de répérersur une préparation colorée des parasites à diverses phases de leur évolution, puis dedécolorer progressivement. Si on se sert d’une lame traitée par la méthode de Romanowsky, par exemple, on la soumet à l’action de l’alcool absolu ou de l’acétone, en l’examinant de temps en temps dans les régions répérées. Le parasite pâlit sans cesser de rester visible. Peu à peu, l’œil s’habitue aux images qu’il perçoit et finit par découvrir, sans aucune coloration, sur des préparations quelconques, les parasites qui s’y trouvent. A ce moment, on est devenu apte à faire des examens entre lame et lamelle ou en gouttes pendantes.

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A cet effet, on prélève une g-outtelette de sang soit directement avec la lamelle, réchauffée aux environs de 37°, soit avec une baguette de verre qu’on appli(jue ensuite sui’ le couvre-objet. La préparation est alors placée sur une lame à cellule, ou sur une lame plane et bordée à la vaseline. On examine à la chambre chaude. Sous les tropiques, l’examen peut être fait à la température du laboratoire.

Dans de bonnes conditions, en variant l’éclairage et l’ouverture du diaphragme, on arrive à suivre pendant plusieurs heures l’évolution d’un parasite.

On peut observer les phénomènes de fécondation entre lame et lamelle avec du sang de malade ou mieux avec du sang extrait de l’estomac d’un Anophèle ayant piqué un malade dont le sang contient des macrogamètes et de microgamétocytes. L’examen doit être poursuivi depuis 10 minutes jusqu’à 12 heures après la piqûre.