A.— DISTINCTION ENTRE L’OX Y HÉMOGLOBINE ET L’HÉMOGLOBINE

L'hémoglobine se présente à deux états d'oxygénation différents : l'oxyhémoglobinc et l’hémoglobine réduite. L’oxyhémoglobine dillère de l'hémoglobine réduite en ce qu’elle contient de l’oxygène sous une forme instable. Le terme hémoglobine désigne tantôt plus particulièrement l'hémoglobine réduite, tantôt généralement la matière colorante du sang quel que soit l'état sous lequel elle se présente.

B — PRÉPARATION

1. Historique. — L’oxyhémoglobine et l’hémoglobine réduite peuvent être préparées à l'état cristallisé.

Les cristaux de la matière colorante du sang ont été observés d’abord par Hünefeld (1840), Reichert (1849), puis étudiés et figurés d’une manière remarquable par O. Funke (1851-1855). Hoppe-Seyler, le premier, isola cette substance à l’état purdu stroma et lui donna le nom sous lequel elle est désignée.

IL Forme des cristaux. — La forme des cristaux varie, mais en défini tive peut toujours être ramenée, chez la plupart des espèces animales, à un type fondamental, celui du prisme orthorhombique.

Ce n est que dans des cas exceptionnels qu'on peut baser la reconnaissance de la nature du sang sur l'examen des cristaux de sa matière colorante. Pour un même sang on obtient, suivantles circonstances de la cristallisation, des formes cristallines différentes, et inversement pour des sangs d’espèce différente, on obtient des formes cristallines, qu’il est difficile, souvent même impossible de distinguer. Seuls les cristaux d’oxyhémoglobine de l’écureuil sont caractéristiques. Ils appartiennent au système hexagonal et représentent des tables hexagonales; ils sont uniaxes et polarisent. Les cristaux du cobaye sont généralement des tétraèdres. Cette forme n’est jamais observée avec le sang de l'homme. Si donc on se trouve en présence de tétraèdres, on pourra affirmer que les cristaux ne proviennent pas de sang humain, mais on ne pourra pas conclure avec certitude qu’il s’agit de sang de cobaye t,F. Guelfi). D’après üvornitschenko, les tables rectangulaires s’observent chez l’homme, mais non chez les animaux domestiques. Friboes a observé des formes variées suivant la

PRÉPARATION

quantité de liquide employé et l'origine du sang humain. Le travail de cet auteur peut être utilement consulté par le médecin (Voy. bibliographie].

111. Comparaison entre les cristaux d’oxyhémoglobine et d’hémoglobine réduite. — Les cristaux d'hémoglobine réduite ont la même forme que les cristaux d’oxyhémoglobine correspondants. Ils diffèrent au point de vue chimique par une moindre teneur eu O2; ils sont plus robustes dans l’eau et partant plus difficiles à obtenir; leur couleur est d’un rouge plus foncé avec une nuance vers le bleu ou le pourpre.

( Inpeut facilement passer d'une forme à l'autre; au contact de l'air l’hémoglobine réduite passe à l'état d’oxyhémoglobine.

— Cristaux d’hémoglobine et d’ox ij hémoglobine du chien.

Les cristaux ont la forme d’aigrettes. de touffes, d’aiguilles de pin (d’après HénocqceL

Les cristaux d'oxyhémoglobine ne peuvent souvent être reconnus qu’au microscope; généralement on les voit à la loupe, parfois ils sont visibles à l’œil nu. Ils ne dépassent guère 1 à 5 millimètres de longueur.

Desséchés complètement à 0° dans le vide, ils supportent sans se décomposer 100° et au-dessus. De petites quantités d’eau suffisent à les altérer graduellement même à la température ordinaire.

IV. Préparation des cristaux d’oxyhémoglobine. — Pour obtenir rapidement

des cristaux d’oxyhémoglobine, on place sur le porte-objet d'un microscope une goutte de sang. Lorsque cette goutte est complètement desséchée, on la recouvre d’une goutte d’eau et d’une lamelle de verre. L’eau détruit les globules et dissout la matière colorante ; au bout de quelque temps, le champ de la préparation se recouvre d'un épais réseau de cristaux (O. Funke). La préparation peut être fermée avec le baume de Canada (Moser; Frieboes). Une goutte de sang de cobaye refroidie fait apparaître des cristaux (Langendorff). Le sang veineux de la rate (chez l'homme) cristallise sans manipulation préalable par la dessiccation (Robert; Frieboes).

Pour préparer des cristaux en masse et à l’état pur, on suit le procédé classique de Hoppe-Seyler, plus ou moins modifié par Zinoffsky, Jaquet, Mayet. Ce procédé consiste à séparer d'abord les globules du plasma, puis la matière colorante du stroma globulaire. On précipite ensuite l’oxyhémoglobine et on la fait cristalliser. On peut favoriser la séparation des globules, soit comme le fait Hoppe-Seyler, à l’aide de la dissolution de sel marin, soit en soumettant le sang défibriné en nature à l’action d’une machine centrifuge. La rupture de l’union de la substance globulaire et du pigment (laquage) est obtenue par addition d’eau distillée (2 à 3 vol. pour 100 de globules) ou d'une petite quan-

LA MATIÈRE COLORANTE DU SANG : HÉMOGLOBINE

Fig

tité d'eau et d'une petite quantité d’éther (Hoppe-Seyler, Zinoffsky, Jaquet). Mayet remplace l’éther parla benzine.) Les stromas qui persistent peuvent être

séparés par la force centrifuge (Jaquet).

L’agent précipitant le plus employé est l’alcool éthylique (Hoppe-Seyler). Pour chaque solution doxyhémoglobine existe une quantité d’alcool optima; un excès provoque la formation de dépôts amorphes. On peut substituer à l’alcool éthylique, soit l’alcool méthylique, soit l’acélone (Artmus et Roucnv).

Le froid favorise la cristallisation. Toute solution un peu concentrée de globules (libre de stroma) donne des cristaux avec le froid, sans addition d’un agent précipitant. Hüfner a remarqué que l’oxyhémoglobine préparée au moyen de l’alcool n'a plus exactement les mêmes propriétés que l’oxyhémoglobine préparée à l’aide du froid seul, notamment au point de vue de la dissociation.

Exemples. — défibriné et lilt

donnés pendant trois heures dans un endroit Irais. Au bout de ce temps, les globules n’occupent plus d'ordinaire que le quart de la hauteur totale. La purée de globules séparée par décantation du sérum sus-jacent est traitée par trois fois son volume d’eau, portée à 35°, puis rapidement refroidie à 0°.0n ajoute ensuite 30 à 40 centimètres cubes

d’éther et on mélange.

La dissolution limpide obtenue est additionnée du quart de son volume d’alcool, également refroidie à 0°, et est introduite dans un mélange réfrigérant de glace et de sel. Au bout de trois jours, les cristaux sont recueillis, lavés deux fois avec un mélange refroidi à 0° d’alcool (1 vol.) et d'eau (4 vol.), puis ils sont dissous dans trois fois leurvolume d’eau distillée à 33°. Cette dissolution est filtrée, refroidie, additionnée d’alcool froid, puis soumise à l'action du mélange réfrigérant. Finalement la purée cristallisée obtenue est étendue sur des assiettes plates et desséchée pendant huit heures à l’air, à une température

J 41. — Cristaux d’oxij hémoglobine du lapin (obtenus en ajoutant de la bile à du sang défibriné contenant 13 p. 100 de matière colorante. Formes en aiguilles, réglettes, tables rbombiques, d’après Hénocque).

a Dix litres de sang de cheval é à travers un linge sont aban-

Fig. 142. — Cristaux d’oxy hémoglobine [et d'hémoglobine du cobaye (d’après Hénocque).

de 18°-20°. Pour 10 litres de sang de cheval on obtient encore 520 grammes de cristaux (Zinoffsky ).

Si on n’opère pas sur des quantités trop grandes de sang, on peut se servir de la machine à force centrifuge pour rendre plus complète la séparation des globules et du sérum. L’emploi de cette machine est nécessaire s’il s’agit du sang de chien. Si elle fait défaut, il faut avoir recours au procédé de Hoppe-Seyler et opérer la séparation des globules à l’aide de la dissolution de sel marin. On mélange à cet effet le sang défibriné à 10 volumes d'une solution de chlorure de sodium obtenue en ajoutant 1 volume de la solution saturée

PRÉPARATION

à 10 volumes d’eau. On abandonne au repos ce mélange pendant un ou deux jours dans un bain froid. Les globules sont séparés. Hoppe-Seyler conseillait de les additionner de nouveau de la solution chlorurée, puis de les séparer de nouveau et de répéter cette opération un certain nombre de fois jusqu'à lavage complet des globules; toutefois cette précaution est généralement considérée actuellement comme inutile (Zinoffsky).

Pour obtenir rapidement de beaux cristaux encore impurs, on peut suivre les procédés suivants :

a) On reçoit dans une solution de fluorure de sodium à 2 p. 100 un égal volume de sang au sortir de l’artère.

Au bout de quelques jours, suivant la température, on voit apparaître, dans les couches inférieures des globules, un feutrage de cristaux que l’on peut examiner au microscope. A 40° la cristallisation est plus rapide (Arthus et Uuber).

b) 50 centimètres cubes de globules sanguins de cheval

ou de chien sont additionnés de 100 centimètres cubes d’eau ; le mélange est in-

Fia'. 143.

Cristal

cl’ oxy hémoglobine de l’homme. (Un des cristaux est situé dans une grande lacune irrégulière , d’après IIénocque.)

troduit dans un tube dialyseur de Kuhne. Si on plonge ce tube dans de l'alcool dilué à 20 ou 33 p. 100, on obtient un dépôt de cristaux dans le dialyseur (Arthus). Robert conseille de dialyser une bouillie de globules contre de l'eau distillée.

V. Conservation des cristaux d’oxy hémoglobine. — La dessiccation altère

les cristaux d’oxyhémoglobine. La forme peut être conservée, mais les cristaux perdent la propriété de se dissoudre dans l'eau distillée. Ils se dissolvent dans l'eau alcalinisée ; les solutions ont une couleur brune.

Les cristaux d’oxyhémoglobine inclus dans le baume du Canada ou de Dammar se conservent pendant des années. Il suffit de mettre un peu de bouillie cristalline sur une lamelle sans recouvrir la préparation ; puis à dessécher celle-ci à la température la plus froide possible. Lorsque les cristaux n’ont plus le brillant que donne l’humidité, on ajoute le baume, puis on recouvre la préparation d'une grande lamelle. Éviter l’emploi de l’alcool.

VI. Préparation de cristaux d’hémoglobine réduite. — La préparation des cristaux d'hémoglobine réduite suppose comme condition essentielle qu’on opère en milieu non oxygéné.

Hermann, Gscheidlex, Robert, IIüfner, conservent du sang en tube scellé à l’étuve ; il se forme des cristaux d’hémoglobine réduite lorsque le sang renferme

des microbes.

Arthus et Rouchy obtiennent des cristaux d’hémoglobine en traitant par l'alcool fort ajouté en quantité convenable (un quart de volume, par exemple) les globules du sang de cheval putréfiés et laqués. Ex. : des globules de sang de cheval ont été séparés du sérum par centrifugation, puis lavés deux fois au chlorure de sodium à 1 p. 100 et centrifugés. Ils sont abandonnés pendant plusieurs jours à la température du laboratoire jusqu'à ce que se soit produite une putréfaction intense, puis laqués par un volume d’eau, additionnés d’un quart de leur volume d’alcool à 95 p. 100 et abandonnés pendant vingt-quatre heures à une température voisine et un peu inférieure à0°. On trouve dans l’éprouvette où on a fait faire ce mélange, une quantité énorme de tablettes hexagonales noires et brillantes ayant de 2 à 3 millimètres de diamètre et même plus. Ces tabletles examinées au microscope, changent de coloration au contact de l’air. En même temps, elles se dissocient et se transforment en des amas de cristaux

620 LA. MATIÈRE COLORANTE DU SANG I HÉMOGLOBINE

rouge vif, présentant des formes qu’on observe avec l’oxyhémoglobine du cheval.

Nencki et Sierer ont recommandé le procédé suivant: Un dissocie des cristaux de sang de cheval dans de l’eau tiède; le liquide est additionné de sang en putréfaction et soumis dans un flacon bouché au caoutchouc à un courant d’hydrogène pur. Au bout de quelques heures on ferme à la lampe l’orifice des tubes adducteurs et abducteurs et on abandonne le tout à 20-23° pendant huit jours. Les dernières traces d’O2 sont consommées par la putréfaction. A ce moment, le liquide a une belle couleur rouge-violette et ne contient plus que de 1 hémoglobine. On fixe alors sur l’extrémité du tube abducteur un tuyau de caoutchouc dont 1 autre extrémité plonge dans de l’alcool refroidi, et après avoir cassé la pointe du tube, on fait pénétrer dans le flacon, qui est alternativement réchauffé dans de 1 eau tiède puis refroidi, une quantité d’alcool représentant environ 25 volumes p. 100. On bouche ensuite l’extrémité de caoutchouc et on abandonne le mélange au froid. Au bout de douze à vingt-quatre heures, l’hémoglobine se dépose en petits cristaux brillants.

VII. Aptitude à cristalliser. Dissolvants des cristaux ^oxyhémoglobine et d’hémoglobine. — Sont difficilement

solubles dans l’eau et cristallisent facilement les oxyhémoglobines <1 écureuil, de cochon d'Inde et de rat ; viennent ensuite les cristaux du sang de cheval et de chien, puis enfin ceux du sang de lapin, il homme, de singe, de porc et de bœuf. Ces derniers sont très solubles et cristallisent difficilement. D’après Bücheler, 400 grammes d eau dissolvent à 0° : 2gr,G14 d’oxyhémoglobine de cheval et

à. 20° : 14M’,375. L’oxyhémoglobine provenant de globules à noyaux (Oiseaux) est difficile à préparer en raison de la ténacité avec laquelle la nucléine des noyaux adhère aux produits (Jaquet).

Les hémoglobines sont bien plus solubles que les oxyhémoglobines correspondantes. Les cristaux d’hémoglobine tombent vite en déliquescence lorsqu’ils sont abandonnés à l’air, en même temps qu’il y a rapidement absorption d’oxygène et transformation en oxyhémoglobine.

L oxyhémoglobine est soluble dans la dissolution très étendue d alcalis, d ammoniaque et de carbonates alcalins, mais elle s'y altère au bout de quelques jours. Elle se dissout et se conserve au contraire dans la glycérine et les solutions étendues d’albumine, de sucre, de glycose. Elle est soluble dans l’urine et dans les diverses humeurs de 1 économie, mais elle s’y altère rapidement.

L’oxyhémoglobine est insoluble dans 1 alcool, elle se décompose rapidement dans 1 alcool étendu d eau ; elle est également insoluble dans l’éther, les essences, le chloroforme, la créosote, le sulfure de carbone, la benzine.

VIII. Coloration des solutions. — Les dissolutions d’oxyhémoglobine sont en couches épaisses d’un rouge clair éclatant,

PREPARATION

en couches minces d’un jaune rougeâtre; les dissolutions d’hémoglobine sont en couchesépaisscs d’un rouge-cerise foncé ; en couches minces elles sont vertes à la lumière transmise.

IX. Réactifs précipitants. Combinaison avec les métaux. — La plupart des acides minéraux même très étendus précipitent l’oxyhémoglobine en la décomposant. Les acides oxalique, tartrique, phosphorique, l’acide acétique peu concentré la décomposent sans précipitation .

L’oxyhémoglobine est précipitée par le carbonate de soude. La précipitation est complète par la saturation par le sulfate d’ammonium. La précipitation est également complète par 4 volumes d’une solution d’acétate de potassium additionnée d’un peu debaryte ou encore en ajoutant à I volume de la solution d’oxyhémoglobine 4 volumes d'un mélange préparé en saturant d’acétate de potassium 1 volume d’eau additionné de 0vol,25 à 0vol,37b d’alcool fort. Le sulfate de magnésium à saturation précipite le pigment, mais incomplètement (Ivrauss).

L'alcool précipite également l’oxyhémoglobine et dédouble peu à peu le pigment, surtout si la température est élevée. L’alcool absolu transforme l’ox yhémoglobine en parahémoglobine 1). L’oxyhémoglobine est précipitée de ses solutions par le chloroforme (Preyer, Formaxek). Le précipité est difficilement soluble (Krüger).

* L’oxyhémoglobine est précipitée par un grand nombre de sels des métaux lourds, notamment par le sulfate de cuivre, le chlorure et l’acétate de zinc, les nitrates mercureux et mercurique, le sous-acétate de plomb ammoniacal, le perchlorure de fer additionné d’un peu d’ammoniaque. Le nitrate d’argent, le sublimé, le perchlorure de fer ne donnent pas de précipité. L’acétate de plomb, le sous-acétate de plomb troublent les dissolutions d’oxyhémoglobine. L’iodure double de mercure et de potassium et le benzoate de soude précipitent le pigment en milieu acide. Les sels de métaux lourds forment avec la matière colorante du sang des composés dont quelques-uns présentent une belle coloration, sont peu solubles et comparables aux laques (Jutte).

L’hémoglobine fixe de l'iode (Kouraïev).

X. Dialyse. — Comme la plupart des substances albuminoïdes l’oxyhémoglobine ne dialyse pas. On utilise même fréquemment cette propriété dans le but de vérifier le bon fonctionnement d’un dialyseur. Comme les substances protéiques et en général les

(1) Nencki et Sieber ont donné le nom de parahémoglobine à une modification de l’oxyhémoglobine que l’on obtient en maintenant cette dernière pendant plusieurs heures avec 10 volumes d’alcool absolu à une température voisine de 0°. Avec l’oxyhémogiobine de cheval, on obtient une masse rouge, formée par des cristaux insolubles dans l'ca,u.

LÀ MATIÈRE COLORANTE DU SANG : HÉMOGLOBINE

substances colloïdes, l’oxyhémoglobine est partiellement retenue par les filtres de porcelaine dégourdie (Arthus et Rouchy).

XI. Action sur la lumière polarisée. — L’hémoglobine une substance albuminoïde dextrogyre ayant une rotation spécifique (a) C= -j- 10°, 4. Les combinaisons avec O2 et CO ont une rotation spéciiique identique (Gamgee, Hill). l outes les nucléoprotéides et les nucléines sont également dextrogyres (Gamgee, W. Iones).