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Fig. 154.
llématoscope de Hénocque.
La lame inférieure li est séparée de la lamelle supérieure Is par un espace prismatique s représenté en noir. La lame inférieure porte à ses deux extrémités les agrafes de laiton. Celle de gauche ag maintient les lames en contact, celle de droite ad présente un talon t ayant trois dixièmes de millimètre d’épaisseur, ce qui détermine l’écartement des deux lames.
LA MATIÈRE COLORANTE DU SANG : HÉMOGLOBINE
Celle extinction partielle d’un des faisceaux doit être obtenue en s'appuyant sur une loi connue (loi de la distance, polarisation, etc.), qui permette de déterminer numériquement la quantité de lumière arrêtée parle corps dissous.
Sj peclrophotomètre de Vierordt. — La description du photomètre de Vierordt, l’un des plus employés par les physiologistes, permettra de se faire une idée de la construction des autres spectrophotornètres qui n’en diffèrent que par le mode d’affaiblissement d’un des rayons lumineux.
Le spectrophotomètre de Vierordt est un spectroscope ordinaire dont la fente est formée, d’un côté par une lame continue et de l’autre par une lame identique à la première que l’on a coupée en deux parties égales dont chacune est mobile au moyen d’une vis micrométrique ; on obtient ainsi deux fentes d’inégale largeur qui donnent dans le spectroscope deux spectres superposés d’intensités différentes. Si les deux fentes reçoivent des lumières d’inégale intensité, ou bien si l’une reçoit une lumière directe, l'autre cette même lumière modifiée par l’absorption qu’elle a subie en traversant un milieu coloré, on peut rendre égales les intensités d’une même radiation simple dans les deux spectres en faisant varier convenablement les largeurs des deux demi-fentes; les intensités sont alors en raison inverse des largeurs des fentes.
M. Krüss a apporté à l’appareil de Vierordt un perfectionnement notable par la substitution, à la fente unique de Vierordt, de deux fentes superposées, une pour chaque spectre. Dans chacune de ces fentes, les deux bords se meuvent symétriquement au moyen d'une vis à double rappel, de telle façon que les milieux de chaque fente restent toujours en prolongement l’un de l’autre ; les deux spectres restent donc exactement superposés quel que soit l’écartement des fentes.
Emploi. — Pour se servir d’un spectrophotomètre, on dispose de deux sources lumineuses, de façon que le faisceau émanant de chacune d’elles traverse le même système dispersif donnant deux spectres superposés.
On place d’autre part dans deux cuves identiques en verre à faces parallèles, et le dissolvant et la solution.
Pour ne pas tenir compte du rapport d’intensité lumineuse des deux sources, c’est sur le trajet du même faisceau qu’on place successivement la cuve contenant le dissolvant et la cuve contenant la solution.
Dans chaque expérience on modifie la largeur des fentes, de manière que les régions étudiées des deux spectres présentent une égale intensité lumineuse; les tètes des vis de rappel ayant une division indiquant la largeur des fentes, une simple lecture donne le rapport des ouvertures d’admission de la lumière.
De cette façon, la source lumineuse sur le trajet de laquelle on n’interpose aucune cuve, sert d’étalon auxiliaire auquel on compare la lumière ayant traversé le dissolvant puis la solution.
Valeur de la méthode. — La méthode spectrophotométrique permet seule de résoudre rigoureusement le problème de la comparaison des rapports des intensités de chacune des radiations simples qui composent la lumière émise par chaque foyer, mais il importe de remarquer que si théoriquement les spectropholomètres donnent des indications exactes, les mesures photométriques étant essentiellement subjectives dépendent de l’observateur : l’œil y joue le même rôle que le galvanomèLre ou l’électromètre dans les mesures électriques par réduction à zéro. L’emploi obligatoire de l’œil impose aux mesures photométriques une limite d’exactitude déterminée par sa sensibilité, laquelle varie avec
DOSAGE DE LA MATIÈRE COLORANTE DU SANG
la nature du faisceau lumineux : maximum pour le vert et le jaune, minimum pour le rouge et le bleu.
En se plaçant dans les meilleures conditions possibles, l’œil est incapable d’apprécier à plus de 0,01 près l’égalité d'éclairement de deux surfaces contiguës, les teintes comparées étant identiques.
Ce fait limite l’exactitude des mesures photométriques.
Application au closaye de deux substances {oxy hémoglobine et hémoglobine). — Si la solution que l’on se propose d’analyser quantitativement au spectrophotomètre ne contient qu’une substance dissoute, il suffit pour résoudre la question, d’avoir une seule équation donnée par une expérience ; si au contraire la solution contient plusieurs matières dissoutes, il faudra autant d’équations que d'inconnues, et par conséquent un nombre d’expériences correspondant au nombre des résultats cherchés.
Pour poser les équations en question, il faut partir de définitions précises, et ces définitions et leur interprétation expérimentale ont été établies par l’un des créateurs de l'analyse spectrale: Bunsen.
Soit I, l’intensité de la lumière incidente pour une longueur d’onde donnée quand cette lumière aura traversé une solution colorée, l’intensité sera réduite dans un certain rapport; supposons que pour une épaisseur égale à l’unité, l'in¬
tensité ne soit plus que j , quand l’épaisseur sera égale à e fois l’unité, l’intensité transmise, pour la longueur d’onde déterminée, ne sera plus que :
ne
On a donc:
de là la possibilité de doser la quantité de matière colorante dissoute ou en
suspension en prenant comme constant le rapport j-, et comme variable e ; ici
l'expérience spectrophotométrique sert à maintenir la constance du rapport, tandis qu’on fait varier e.
Telle est l’idée dont est parti Bunsen pour définir ce qu’il appelle coefficient d’extinction.
On fait le rapport p = 10 et le coefficient d'extinction est l’inverse du nombre
exprimant alors l’épaisseur de la solution.
On voit facilement que les coefficients d’extinction de diverses solutions d’une même substance sont directement proportionnels aux concentrations.
Si on appelle C.> etc., les poids d une même substance colorante par unité de volume, et E, E, etc,., les coefficients d’extinction correspondants, on aura:
Ei=Çi
ou
Ei E2
On convient de prendre pour unité de volume 1 centimètre cube, la valeur de A se trouve alors définie numériquement ; cette valeur étant lonction de la longueur d’onde, varie dans chaque région du spectre.
JM ou at et Doyon. — Physiologie. E **
LA MATIÈRE COLORANTE DU SANG : HÉMOGLOBINE
Supposons une solution de concentration C, on aura pour deux régions du spectre définies parleur longueur d’onde Xt et X2.
G — Aj Ej — A2 E 2
ou :
I'-2 Al
fine autre solution de concentration différente de la même substance donnera pour les mêmes longueurs d’onde X, et X2.
d'où
Ei=Ej
De là cette remarque.
Le rapport des coefficients d’extinction mesurés dans deux mêmes régions du spectre pour les solutions d’une même substance est constant et indépendant de la concentration: il peut donc servir de caractéristique pour le corps donné.
Examinons maintenant le cas où dans une même solution se trouvent plusieurs matières colorantes. Vierordt, le premier, a montré expérimentalement que ces diverses matières dissoutes (sans réaction chimique l’une sur l’autre) agissaient chacune séparément comme si elles étaient seules.
Si C', C", G'" représentent les concentrations, et E', E’, E" les coefficients d’extinction correspondants, on aura :
etc.
pour une longueur d’onde X'.
On en tire la valeur du coefficient d’extinction totale
On aura de même pour une longueur d’onde X' :
C'est ainsi que, comme il est dit plus haut, on parvient expérimentalement former autant d’équations qu’il y a de substances à doser.
Prenons l’exemple de deux substances, on aura le système d’équation suivant
pour une longueur d’onde X :
DOSAGE DE LA MATIÈRE COLORANTE DU SANG
pour une longueur d’onde X', d'où l'action :
c, = A' a; (ea" — e, \\)
A' A, — A' Ai
A 7 A j { Aj Ei-A'E) A' A', — A' A"
Appliquons avec IIüi xeh ces notions au dosage de I'oxn hémoglobine, de l'hémoglobine, chaque matière colorante étant seule, puis au mélange de ces deux matières colorantes.
Oxy hémoglobine. — Le coefficient d’extinction étant déterminé pour l’appareil employé, l’expérience donne A' = 0 002 07 pour une longueur d’onde de Op.,558, et A" =000131 pour 0(x, 540.
Un aura pour une solution quelconque d’oxyhémoglobine, sa concentration en appliquant la formule :
C' = 0,00207 E' ou:
suivant que l’expérience aura été faite dans la région du spectre de Ou, 558 ou de Oij.,540.
Hémoglobine. — Pour les deux mêmes régions du spectre, on a :
Aj = 0,00133 pour X = 0g, 558
d’où :
A, = 0,00178 pour X = 0g,540
C" = 0,00135 E' ou C" = 0,00178 Ej
Si on a un mélange des deux substances pour la région du spectre caractérisé par h = 0 558, on aura un coefficient total d’extinction :
