PROTOZOAIRES

801. — Les Protozoaires sont, en général, faciles à examiner à Tétat vivant dans le milieu même dans lequel ils vivent. Certains Infusoires ayant des mouvements très vifs, il est très difficile de les suivre sur !e champ du microscope, surtout avec de forts grossissements. On obtient un ralentissement de leurs mouvements, et même on peut les fixer complètement, en les soumettant à une légère compression. Pour cela, on emploie la méthode que nous avons décrite au chapitre des « Métuodes embryologiques » et qui consiste à enlever une partie du liquide recouvert par la lamelle en l'aspirant au moyen d'un petit morceau de papier non collé. Avec un peu d'habitude, pn arrive facilement à saisir le moment où l'on doit arrêter l'aspiration du liquide, pour que la compression ne déforme pas trop l'animal. H suffit de suivre l'Infusoire sous le microscope ; dès qu'on voit ses mouvements se ralentir, on enlève le petit morceau de papier placé sur le bord de la lamelle. Si l'observation se prolonge un peu, on doit de temps en temps déposer une gouttelette d'eau sur le bord de la lamelle, pour remplacer le liquide qui s'est évaporé et empêcher une compression trop forte des animaux.

EiSMOND [ZooL Anz., 1890, p. 723) a proposé un moyen mécanique d'un autre genre pour confiner les mouvements de petits organismes (Vers et Crustacés, aussi bien qu'lnfusoires). Il ajoute à l'eau dans laquelle on les observe une goutte de solution épaisse de gomme de cerisier c Kirschleim » ; la gomme arabique, etc., ne conviennent pas. Certes {Bull, Soc, ZooL de France^ 1891, p. 93) dit que cette méthode donne d'excellents résultats. Mais il faut savoir qu'il n'est nullement facile de trouver un échantillon de gomme qui puisse servir. Cette gomme est très peu soluble et ses solutions ne se conservent pas (je dois ces renseignements à l'obligeance de M. le doc-

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leur Grûbler). Un procédé similaire a été élaboré par Jensen (d'après Stahl, Biol. Centralb., XII, 1892, 18, 19, p. 886). On fait à l'aide de la chaleur une solution de 3 grammes de gélatine dans 100 ce. d'eau ordinaire. La solution n'est pas liquide à la température ordinaire. Pour s'en servir, on la chauffe légèrement, on en ajoute une goutte à l'eau qui contient les organismes dans un verre de montre, et on mêle les deux liquides.

Pour des méthodes de narcotisation, voir chapitre n. Schûrmayer {Jen. ZeiL, 1890, p. 402; Zeit. f. wiss. Mik., VII, 4, 1891, p. 493) a eu de bons résultats avec quelques espèces, parmi lesquelles Stentor et Carchesium, au moyen de nitrate de strychnine à 0,1 p. 100 ou moins.

L'étude de la structure des Protozoaires peut se faire presque entièrement sous le champ même du microscope, en soumettant ces animaux à l'action de différents réactifs que l'on fait arriver à leur contact par capillarité entre le porte-objet et la lamelle recouvrante. Il est bon de suivre directement l'action du réactif, car souvent tel détail qui devient très apparent au moment où commence à agir le réactif devient méconnaissable au bout de quelque temps et ne peut être observé sur les préparations permanentes,

Les corps qu'on désigne sous le nom de noyau et de nucléole ou d*endoplaste et d'endoplastule, jouant un grand rôle dans la morphologie et dans la biologie des Protozoaires, principalement des Infusoires, et ces corps présentant en général les mêmes réactions que les noyaux cellulaires, tous les réactifs fixateurs et colorants des cellules et des noyaux rendront de grands services dans l'étude des Protozoaires. L'un des plus importants est la solution aqueuse de vert de méthyle acidulée par l'acide acétique ; c'est le réactif qui permet de déterminer le mieux et le plus rapidement la présence et la forme du noyau et du nucléole (Balbuni et Henneguy, CompL rend. Soc. de Biologie, 1881, p. 131). Nous donnons plus loin les principales méthodes qui permettent d'obtenir des préparations permanentes de Protozoaires, mais jusqu'à présent ces méthodes ne sont pas parfaites, et l'étude des meilleures préparations ne peut remplacer celle des animaux vivants ou soumis à l'action des réactifs sous les yeux mêmes de l'observateur.

Parmi les réactifs qui ne se trouvent pas mentionnés dans les méthodes que nous exposons d'après la description de leurs auteurs, nous citerons des solutions faibles d'alun, de potasse ou de borax qui mettent bien en évidence les stries de la cuticule des Infusoires et rinserlion des cils vibraliles.

4iS CHAPITRE XXXIII

802. Coloration des Infùsoires vivants * (Certes, Comptes remtm Soc^ de Biologie^ 1885, p. 197). — Les Infùsoires vivants se colorent et peuvent continuer à vivre un certain temps dans une solution faible de certaines couleurs d*aniline, cyanine, brun Bismarck, violet dahlia, violet 8 B, chrysoïdine, nigrosine, bleu de jnéthylène, vert malachite, vert d'iode, etc., et dans rhématoxyline. Les solutions doivent être faites avec le liquide dans lequel vivent les Infùsoires : ces solutions ont un titre très faible variant de 1/iOOOO à I/IOÛOOÛ.

Le noyau ae colore nettement chez l'animal vivant par les solutions de violet dahlia et de vert malachite. Le brun Bismarck ne colore le noyau que de certains Infùsoires [NyctotheriLS, Opalinà). (Henneguy.) Le noyau se comporte du reste différemment dans des espèces quelquefois très voisines.

La double coloration du noyau en vert et du protoplasma en violet s'obtient par l'emploi simultané du violet dahlia et du vert malachite*

Il y a parfois utilité à examiner les Infùsoires dans un milieu coloré dans lequel ils ne se teignent pas mais se détachent à Tétat incolore sur un fond coloré. Ou peut prendre la solution de noir d*aniline (Certes, Bull. Soc. :^oùL de France^ 1888, p. 30), ou une solution concentrée de bleu diphénylamine (Fabre-Domergde, Ann. de micr., 1889, p. 545).

fixation et conservation

803. Méthode de Certes {Comptes rend, de VAcad. d. Se, 1*"" sem. 1879, p. 433). — On expose, pendant dix à trente minutes, aux vapeurs d'acide osmique, les Infùsoires déposés sur une lame de verre ^ Pour les Infùsoires très contractiles, on dépose une goutte du réactif sur la lamelle elle-même, avant d'en recouvrir la goutte d'eau qui les renferme. On doit éviter tout déplacement de la lamelle de verre, et pour cela on soutire, avec du papier Joseph, le liquide qui se trouve en excès. On lute deux bords opposés de la lamelle avec de la paraffine ou du baume de Canada, puis on fait arriver le liquide colorant.

< La €olomcion des Infùsoires à l'état vivant a été trouvée presque simultanément, et d*une façon indépendante, par Brandt {Verhandl. d. physiol. Ges. Berlin, 187R), par Cejitks (Soc. zooL, 25 janv. 1881) et par Hennbguy {Soc. philom., 12 fév. 18SI), J'ai examiné au n° 97 la question de savoir jusqu'à ^quel point ces colorations doivent iHre regardées comme des teintures véritables, et celle de rinterprétation qu*û. mon sens il convient de leur donner. (A. B. L.)

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L'éosine et le picro-carminate donnent les meilleurs résultats. Certes emploie le mélange suivant :

Glycérine 1 partie.

Eau 1 —

Picro-carmin 1 —

On fait arriver lentement le mélange ; pour cela on place dans une chambre humide les préparations lutées ainsi qu'il est dit cidessus et on dépose une goutte de glycérine carminée sur le bord de chaque préparation. L'eau s'évapore lentement et, au bout de vingtquatre heures, se trouve remplacée par la glycérine pure.

804. Méthode de Géza Entz {ZooL Anz., n« 96, 1881, p. 875). — Pour fixer les Infusoires, l'auteur emploie de préférence le liquide de Kleinenberg ; quelques gouttes de ce liquide sont ajoutées à un verre de montre contenant de l'eau avec des Infusoires. Au bout d'une à deux minutes, on enlève le liquide et on lave la préparation pendant environ une demi-heure avec de l'alcool pas trop fort. On peut monter les objets dans un mélange à parties égales de glycérine et d'eau, mais il vaut mieux les colorer au préalable. Au sortir de Talcool, on traite, pendant dix à vingt minutes, par le picro-carmin. Pour les formes munies d'une carapace, telles que Euglena spirogyra, PhacuSj Péridiniens, il faut plusieurs heures pour obtenir la coloration. On lave à l'eau jusqu'à ce qu'on ait enlevé l'acide picrique.

805. Méthode de Brass {Zeit. f. wisSy Mik., l, 1884, p. 39). — Brass emploie pour fixer les organismes unicellulaires le liquide suivant :

Acide chromique 1 partie.

Chlorure de platine 1 —

Acide acétique i —

Eau 400 à 1000 —

Pour les Protozoaires qui sont rendus opaques par des matériaux nutritifs, Brass a adopté la méthode suivante : les animaux sont placés dans le liquide de Kleinenberg pendant trois à quatre minutes, puis dans l'eau avec une petite quantité d'ammoniaque, où ils reprennent leurs dimensions et leurs formes naturelles; on neutralise l'ammoniaque par un peu d'acide acétique et on colore par le carmin ammoniacal. On lave et on examine dans la glycérine diluée. Les objets ainsi traités deviennent très transparents.

Brass a obtenu aussi de bons résultats avec une solution de sublimé.

806. Méthode de Cattaneo [BolleUino scientiflco, n** 3 et 4, 1885J. — L'auteur soumet les Infusoires à Taclion des réactifs sur le porie-objet. Les fixateurs les meilleurs sont, d'après lui, le chlorure <ie palladium en solution aqueuse à 1-3 p. 100, et le chlorure double d'or et de cadmium à i p. 100. Le chlorure de sodium en solution de 20 à 30 p. 100 peut conserver des Protistes d'eau douce sans les déformer. L'induré de mercure et de potassium en solution à î-'i p. 1D0 rend des services dans Tétude de la structure protoplasmlqne.

Le subliifx'i en solution à 5 p. 100 et Tacide osmique à 1 p. 100 sont aussi de bons fixateurs.

Au second rang, Cattaneo place, comme agents fixateurs, Tacide picnque, Tacrde chromique, le liquide de Kleinenberg, le bichromate de potasse.

L'alcool, Tacidc citrique et le jus de citron fixent bien les Infusoires, mais ne permettent pas de conserver les préparations.

Gamme colorants, le violet de méthyle, le violet de gentiane et le bleu de Lyon ne donnent pas de bons résultats; ils donnent une coloration uniforme. Le rouge Magenta et la fuchsine valent mieux, parce quHls colorent le noyau avec plus d'intensité que le protoplasma; la DÎgroëine et riicniatoxyline sont encore meilleurs; mais les réactifs colorants les plus recommandables sont le carmin ordinaire et le picro-carmîn.

Callanco conserve ses préparations dans la glycérine ou Tessence de girolle.

807. Méthode de Savillk Kent et de Bertuold {Manual of îhe înfn^Qria ; Jottiti. of R, Mie. Soc, y 1883, p. 451). — Pour la préparation des organismes inférieurs, Infusoires et Algues, les auteurs prérèrenl à Tacidc osmique une solution d*iodure de potassium, de couleur jaune tirant sur le brun.

808. Méthode de Waddington {Joum. R. Microsc. Soc, III, 188H, p. î8o , — Pijur bien mettre en évidence les cils des Infusoires, l'auteur les lixe par quelques gouttes d'une solution de tannin, ou par une trace d'une solution alcoolique d'acide sulfureux.

809. Coloration des Flagella. — La méthode célèbre de Loef- FL£R a subi plu^ivieurs modifications, dont nous donnons la plus récente {Cmiralb. f. Bttkiefiol., Ml, 1890, p. 625; Joum. Roy. Mie. Soc.^

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1890, p. 678). On fixe la préparation (par ex., pellicule d*une infusion, goutle d'un liquide de culture, etc.), par la pratique usuelle des bactériologistes, sur verre à couvrir (on étale la matière en couche très mince sur un verre à couvrir et Ton passe ce verre, lentement, trois fois à travers une flamme ; ou bien, on le laisse sécher plusieurs heures à Tétuve). On traite la préparation fixée par un mordant. Le mordant de LoEFFLER se fait comme suit. A 10 ce. de solution de tannin à 20 p. 100 on ajoute 5 ce. de solution de sulfate de fer et 1 ce. de solution aqueuse ou alcoolique de fuchsine, de violet de méthyle, ou de noir pour laine. (Pour certains organismes il convient d'ajouter quelques gouttes de solution de soude caustique à 1 p. 100 ; ainsi pour les bacilles typhoïdes, 1 ce, pour Bacillics snbtilis, 28 à 30 gouttes, etc. Pour d'autres il faut ajouter à la solution de soude une trace d'acide sulfurique ; ainsi pour Spirillum rubrum, t) gouttes.)

Le verre à couvrir ayant été fixé dans une flamme comme nous l'avons dit, on verse dessus pendant qu'il est encore chaud quelques gouttes du mordant ; on chaufie de nouveau pendant une demi-minute jusqu'à ce que le liquide commence à se vaporiser, et on lave, d'abord à l'eau distillée, puis à l'alcool. Puis on verse dessus la teinture, et l'on procède de même. La teinture de Loeffler consiste en une solution saturée de fuchsine dans l'eau anilinée (n^ 167) (au mieux neutralisée jusqu'au point de précipitation par addition de solution de soude caustique à 0,1 p. 100).

Modifications du procédé de Loeffler.

Trenkmann {Centralb., VI, 1889, p. 433; ZeiL f. wiss. Mik,, VII, 1,

Brown, Journ. Roy. Mie. Soc, 1893, p. 268.

Julien, ibid., 1894, p. 403.

Bunge, ibid., 1894, p. 640; 1895, p. 129 et 248.

Le procédé de Van Ermengëm, ibid.,» 1894, p. 405, est une application de la réaction de l'acide osmique avec le tannin.

810. Coupes d'Infùsoires. — Bien que les manipulations d'objets «lussi petits soient assez délicates on peut obtenir des coupes des espèces les plus grosses (Stentor, Bursaria, Nyctotherus, etc.). Les Infusoires fixés par une solution forte d'acide osmique (2 p. 100 ou une solution saturée) sont déshydratés par l'alcool et l'essence de girofle ; puis placés dans un bain de paraffine dans un petit verre de montre. Au bout de . quelques minutes on les porte, à Taide d'une

aiguille à cataracte, sur un petit bloc de paraffine dure; on les oriente à l'aide d'une aiguille chauffée; après refroidissement on coupe. La coloration peut se faire après la fixation, ou mieux lorsque les coupes ont été collées sur le porte-objet par Talbumine de Mayer.