De la préparation préalable des tissus à colorer. — Les

fixations ont tout autant d'importance pour la réussite des colorations que pour la conservation des tissus. Les éléments des tissus (à part quelques exceptions) ne se colorent pas du tout dans les teintures à l'état vivant. Les tissus récemment morts et non fixés s'y colorent, mais mal, et ne prennent guère qu'une coloration fugitive. Seuls, les tissus convenablement fixés prennent dans les teintures des colorations à la fois énergiques et stables. Bien des considérations portent à croire que dans la plupart de nos colorations histologiques, ce n'est pas la substance originelle des éléments des tissus que nous colorons, mais, au contraire, certains composés chimiques inconnus (peut-être souvent des albuminates métalliques) résultant de la combinaison de cette substance avec d'autres substances qui lui sont apportées dans nos liquides fixateurs et durcissants.

On comprendra donc facilement que la nature chimique des substances que nous employons pour la fixation et pour la préparation ultérieure est d'une grande importance sous le rapport des colorations. Quelques-unes de ces substances produisent des modifications dans les tissus qui s'opposent à leur coloration avec certaines couleurs ; d'autres, au contraire, facilitent la teinture en jouant le rôle de mordants. Telles sont (pour certaines couleurs) le chrome et ses sels, puis le sublimé corrosif, les aluns, les sels de fer, de platine, de palladium et d'uranium. On cherchera donc à tirer parti de cette propriété de ces substances lorsque l'occasion s'en présentera, et l'on ne perdra pas de vue l'utilité que peut souvent avoir la présence d'une substance agissant comme mordant dans les teintures elles-mêmes. L'alun, par exemple, joue dans beaucoup de teintures un rôle très important, quoique jusqu'ici inexpliqué d'une façon satisfaisante. C'est une substance qui pénètre facilement les tissus et s'y attache avec énergie, et qui, d'autre part, se combine facilement avec beaucoup de couleurs. De plus, comme le fait observer Gierke, il s'attache à certains éléments des tissus avec beaucoup plus d'énergie qu'à d'autres ; il a surtout une très grande affinité pour la substance des noyaux. Par suite de ces propriétés, il sert non seulement à rendre certaines couleurs plus stables, mais aussi à leur faire fournir des colorations plus électives que celles qu'elles donnent employées seules.

L'iode, dans plus d'un procédé, joue un rôle semblable, qu'on ne

peut expliquer qu'en lui attribuant le caractère de mordant vis-à-vis de certains éléments et de ceiHaines couleurs.

96 bis. Des colorations directes et par Mordançage. — On

distingue des couleurs qui se fixent directement sur les tissus; et d'autres qui ne s'y fixent que par l'intermédiaire d'une substance appelée « mordant b. La pratique du mordançage est très peu développée dans la teinture histologique jusqu'à présent, mais elle commence à être employée. On la mise en œuvre depuis longtemps pour certaines colorations à l'hématoxyline (Heidenhain et d*autres), et plus récemment, mais rarement, pour les couleurs de la houille. Nous décrirons au chapitre vin plusieurs colorations par mordançage à l'hématoxyline, et au chapitre x les procédés de coloration par mordançage aux couleurs de la houille de Henneguy, de Rawitz et autres. En outre il faut noter que l'emploi de l'huile d'aniline dans les solutions colorantes, comme aussi celui de l'acide chromique, de l'acide picrique ou de l'iode employés avant la teinture ou ajoutés aux liquides de lavage paraît rentrer dans cette catégorie. Je pense qu^on peut regarder comme établi que l'iode sert de mordant pour plusieurs couleurs d'aniline (safranine, violet de gentiane, vert de méthyle, bleu Victoria). Pour ces deux dernières au moins il sufBt de traiter les coupes pendant un quart d'heure, avant coloration , par de la teinture d'iode ordinaire pour voir s'augmenter beaucoup la résistance de la couleur à l'alcool de lavage. Voy. au demeurant, chapitre vni, Safranine et Violet de Gentiane.

97. Des colorations vitales. — Il a été très souvent question depuis quelques années de la propriété qu'auraient certaines substances de colorer des éléments cellulaires pendant la vie et sans porter atteinte d'une façon sérieuse à leur vitalité. Telles sont, en solutions extrêmement diluées, la quinoléine, le bleu de méthylène, le brun Bismarck, le noir d'aniline, le dahlia, le violet de gentiane, le rouge neutre (Neutralroth). Le rouge Congo est inoifensif envers certains organismes, même en solutions assez concentrées et colore certains éléments des cellules pendant la vie (Scuqltz, Centrale, f, d. med. Wiss. 1886, p. 449 ; Cf. Journ. Roy. Mie. Soc, 1886, p. 1092). On peut y colorer des Rotifères, en partie (consultez aussi à ce sujette travail de Martinotti, Zeit. f. wiss. Mik., V, 3, 1888, p. 305). Pour obtenir les résultats dont nous parlons, il faut employer des solutions colorantes t: es diluées et à réaction neutre ou très faiblement alcaline (les acides, même très faibles, sont presque toujours toxiques pour

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les cellules). On trouve alors qu'elles teignent légèrement pendant la vie le cytoplasme de certaines cellules, jamais le noyau d'après mon expérience, ou en tout cas jamais lachromatine du noyau; si celle-ci se colore, c'est un signe de la mort de l'élément. La coloration est tantôt répandue à travers toute la substance du cytoplasme, tantôt limitée à certains granules ou autres enclaves du cytoplasme (on a identifié ces granules avec les « bioblastes > d'ALiMANN, peut-être sans raison suffisante, voyez les Studien ûber die ZeUe, 1886, et autres travaux de cet auteur). J'ai fait, depuis la publication de la l'^ édition, des expériences assez étendues sur le sujet de ces prétendues colorations < vitales >. Je suis arrivé à la conclusion qu'en aucun cas il ne se produit une teinture de la matière vivante dans le sens propre de ces mots. Lorsqu'il se produit la coloration diffuse dont j'ai parlé plus haut on trouvera toujours, si la cellule est restée bien vivante, qu'il ne s'agit pas d'une teinture proprement dite, mais d'une simple absorption ou imbibition de la solution colorée par la cellule. Si Ton transporte la cellule dans un milieu privé de la matière colorante, elle abandonnera telle quelle la couleur qu'elle avait absorbée, et qui n'avait donc subi pendant son séjour dans la cellule aucun changement chimique mais était restée simplement engagée d'une façon mécanique dans les interstices de sa substance. Si au contraire il se produit une coloration des granules ou autres enclaves dont j'ai parlé plus haut, il se peut bien que cette coloration soit quelquefois une véritable teinture (elle ne Test certainement pas toujours, ce qui se laisse démontrer en remettant la cellule dans un milieu non coloré et en constatant la disparition de la couleur). Mais en ce cas, s'il y a eu teinture véritable, on pourra toujours se convaincre que cette teinture est limitée à des enclaves, c'est-à-dire à des éléments ne faisant pas partie de la trame vivante de la cellule. Ce seront des granules de substances venues du dehors et en train d'être assimilées, du pabulum cellulaire, ou des produits kataboliques, des matériaux de rebut, ou bien encore des parties de la cellule qui ont subi plus ou moins l'action toxique de la solution colorante et se trouvent en état de vitalité amoindrie sinon éteinte; en aucun cas, ce ne sera delà matière pleinement et parfaitement vivante. Je pense en somme que la valeur scientifique principale de ces colorations se trouveradans le fait qu'elles nous fournissent un moyen de distinguer dans une cellule les éléments vitaux de ceux qui ne le sont pas, ou le sont à un degré moindre. Ces conclusions sont aussi celles de l'excellent travail de Galeotti, Zeit. f. wiss. Mik,, XI, 2, 1894, p. 172. Ce travail, dont je recommande beaucoup la lecture, apporte à l'appui de la thèse une abondance de

preuves que je ne puis songer à donner dans Tespace très limité de ce paragraphe.

Aux numéros 181 et 182 se trouvent des observations qui se rapportent à ce sujet.

Tout en étant d^avis qu*il n'ex^te pas de colorations « vitales ». proprement dites, je me hâte cependant de dire que l'emploi de solutions colorées inolTensives dans Tétude des cellules vivantes est souvent d'une utilité réelle. On trouvera souvent avantage à broyer un peu de gentiane, de dahlia, de brun Bismarck ou de bleu de méthylène dans un liquide « indifférent » et à s'en servir pour l'observation de cellules des tissus. Le bleu de mélhylëne offre l'avantage d'être amplement soluble dans l'eau de mer, ce qui permet de l'employer pour l'étude d'organismes marins. La gentiane et le dahlia ne sont pas suffisamment solubles dans l'eau salée pure, mais j'ai trouvé qu'ils le deviennent si l'on y ajoute une trace d'hydrate de chloral (0,25 p. 100 suffit amplement). Au chapitre des Infusoires nous parlerons de l'emploi de la quinoléine et du brun Bismarck. La coloration du brun Bismarck peut être ViKée dans les cellules au moyen d 'acide chromique à 0,2 p. 100 ou de solution de sublimé (Mayer). Le bleu de méthylène fera l'objet d'un chapitre spécial (chap. ix).

98. Choix d'une teinture. — Les quelques conseils qui suivent sont à l'usage des commençants seulement.

A. Pour les objets qui doivent être colorés en entier, nous recommandons en premier lieu le carmin au borax alcoolique de Grena- CHER. C'est un réactif qui, pour les travaux ordinaires d'anatomie microscopique, rend de grands services. C'est un colorant des plus énergiques et des plus précis, et le plus facile de tous à employer. On y pourra substituer, selon les cas, le Paracarmin de Mayer. Ce colorant me paraît être un réactif plus délicat, mais qui demandera souvent la possession de plus de jugement de la part de l'opérateur.

Pour les objets petits et facilement pénétrables, le carmin à l'alun (en comprenant sous ce titre les formules de Grenacuer et de Partscu et le Carmalun de Mayer, réussit très bien. Le carmin à l'alun est la plus délicatement élective de toutes les teintures faites de couleurs stables et employées pour la méthode de coloration progressive. Malheureusement c'est une teinture aqueuse, ce qui en limite l'application ; cependant, avec les modifications que nous indiquerons, elle peut encore servir pour la coloration de pièces assez volumineuses. Nous la recommandons particulièrement. Pour les objets fixés par les sels de chrome, nous recommandons, outre ces teintures

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qui avec ces objets ne donnent pas toujours les résultats voulus, les colorants à Thématéine, soïiV Hémalun ou VHémacalctum deMAYER. B, Pour la coloration de coupesy outre THémâlun, nous recommandons la safranine ou le violet de gentiane, si Ton n'a besoin que d'une coloration nucléaire. Si Ton veut en même temps une coloration plasmatique, je conseille avant toutes autres la combinaison de Kemschwarz suivi de safranine (voy. ces mots). Comme colorant plasmatique diffus, nous recommandons Vacide picrique, qu'on peut employer en coloration double avec Tun ou l'autre des réactifs que nous avons cités, et qui rend des services en mettant en évidence le cytoplasme des cellules. Ce procédé n'est pas à comparer comme résultats à ceux du Kernschwarz suivi de safranine ou des autres combinaisons connues, que nous apprécierons au chapitre des Colorations combinées, mais il a l'avantage d'être d'une simplicité élémentaire. Pour les objets frais et dissociés, nous recommandons le vert de méthyle. Il est bien certainement le réactif le plus absolument précis que nous connaissions pour la coloration de la nucléine par teinture progressive. C'est le réactif par excellence des cytologistes. Malheureusement le vert de méthyle est une couleur fugitive, très difficile à monter au baume, et pour cette raison nous ne le recommandons pas pour les travaux ordinaires d'anatomie microscopique.

99. Produits chimiques tinctoriaux. — Dans la plupart des procédés de coloration histologique il est important de travailler avec des produits chimiques purs. Cela est particulièrement essentiel pour les teintures aux couleurs de la houille. Pour celles-ci, il ne suffit pas de se procurer un produit portant le même nom qu'un produit qui a été décrit comme donnant tels ou tels résultats histologiques. Il faut que ce soit la même marque de la même fabriqua qui a été employée par l'auteur qui l'a recommandée. Des produits portant le même nom, mais fournis par des maisons diverses, donnent très souvent des résultats tout à fait différents. (Voy. au paragraphe Safranine ce qui est dit sur les différentes marques commerciales de cette substance.) Les auteurs les plus consciencieux indiquent en général la source originelle des produits qu'ils recommandent, et l'on peut se les procurer soit eu s'adressant directement à la maison d'origine, soit par l'intermédiaire d'un fournisseur connu de réactifs pour microscopie. Si l'on choisit cette dernière voie, il est bon de demander l'envoi dans l'emballage originel, avec date, ceci pour garantir une fraîcheur suffisante des substances, plusieurs d'entre elles ne se conservant pas indéfiniment.

Je recommande particulièrement comme fournisseur la maison D*" G. Griibler and G°, 63, Bayersche Slrasse, Leipzig. Cette maison a la spécialité de réactifs histologiques vérifiés et ne livre que des couleurs qui ont bien fourni à Tessai la teinture désirée. La maison livre également des liquides colorants ou fixateurs, masses d'inclusion ou d'injection, etc., préparés selon les formules classiques. Je recommande beaucoup ces produits, qui sont en général supérieurs à ceux que les histologistes préparent eux-mêmes. On peut les commander d'après le prix courant, ou simplement en citant les numéros des formules de ce livre.

Une autre maison allemande de conûance est celle du D** G. Miinder, Mikroskopisch-chemisches Institut, Gôttingen.

Le lecteur connaîtra sans doute des maisons françaises de confiance pour les réactifs chimiques ordinaires. J'ai tenu ici à insister sur ce que, pour les teintures histologiques aux couleurs d'aniline^ il est absolument nécessaire, pour les procédés classiques, que les couleurs employées proviennent en dernier lieu des sources indiquées par les auteurs, lesquelles sont presque toutes des fabriques allemandes.

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100. Théorie des teintures au carmin. — Les considérations suivantes sont prises dans Timportant mémoire de Paul Mayer, Ueber das Fdrben mit Carmin ^ Cochenille und Haernatëin-Thonerde, dans Mitlh. a. d. Zool. StaL zu Neapel, X, Hft 3, p. 480. Les principes de la teinture histologique au carmin ont été jusqu'à présent obscurcis par Tidée erronée que le carmin ne serait que de Tacide carminique avec au plus quelques impuretés. Or il n'en est pas ainsi. D'après l'analyse de Liebermann [Ber, d. chem. Ces,, Jahrg. 18, 4886, p. 1969-1975), le caripin serait un très remarquable composé aluminO'Calcioprotéique de V acide carminique^ véritable composé chimique, duquel en tout cas Valuminium et le calcium ne peu- \ent pas plus être absents que le sodium du sel de cuisine. Son analyse donne environ 17 p. 100 d'eau, 20 p. 100 de matières azotées, 56 p. 100 d'acide carminique, au moins 3 p. 100 d'alumine et 3 p. 100 de chaux, avec une faible proportion de magnésie, de potasse, de soude, d'acide phosphorique, et une trace de cire. Les expériences de Mayer l'ont conduit à la conclusion que dans la teinture histologique (il ne s'agit pas ici de teinture industrielle) les éléments actifs de ce composé sont en général seulement l'acide carminique et l'alumine, avec, en certains cas particuliers, la chaux. Les autres bases sont inactives; et les matières azotées, si tant est qu'elles agissent, ont un effet nuisible, car c'est à leur présence qu'est due la putrescibilité des solutions.

Ces conclusions une fois établies, il est tout à fait logique d'admettre qu'il convient de prendre comme base de nos teintures^ non le car-

* Nous avons beaucoup d'obligation à M. le D' Paul Mayer, qui a bien voulu lire et critiquer ce chapitre, ainsi que le précédent et le suivant.

min, mais V acide carminique. Cette proposition avait déjà été faite par DiMMOCK {Amer. NaiuraL, XVIII, 1884, p. 324-7). Mais la tentative de DiMMOCK n'avait pas réussi, pour ce motif, que dans la composition de ses teintures, il avait omis Vêlement essentiel, Valumine, 11 colorait, par exemple, avec des solutions alcooliques d*acide carminique pur, ou de carminate d'ammoniaque pur. De telles solutions colorent, il est vrai, mais faiblement et d'une manière diffuse. Mayer a donc cherché la manière de les combiner avec Talumine.

L'acide carminique est une substance solide d*un brun pourpre, facilement soluble dans Teau et dans Talcool. D'après Nietzki, Chemie der organischen Farbstoffe, 1889, p. 231-234, c'est un acide dit basique faible (Liebermann dit fort), formant avec les métaux alcalins des sels solubles, avec les métaux terreux et lourds des sels violets insolubles.

Le sel aluminique (carminate d'alumine) s'obtient en précipitant une solution d'acide carminique ou de carminate d'ammoniaque par de l'acétate d'alumine. Il a la propriété remarquable d'être soluble en même temps dans les acides et les sels acides, tels que l'alun, et dans les alcalis et les sels alcalins, tels que le borax, à condition qu'on ne prenne comme dissolvant que l'eau ou de l'alcool allongé d'eau.

Il se laisse précipiter également de ces solutions par le chlorure d'aluminium, mais seulement en partie ; l'alun ne donne pas lieu à un précipité, il se forme du carminate qui reste en solution. De là, la composition de la teinture décrite plus loin sous le titre de Garmalun.

Nous avons dit que les solutions se précipitent en partie par le chlorure d'alumine. Le carminate ainsi précipité se redissout dans un excès de chlorure, ajouté avec précaution. Cette opération fournit la teinture décrite au numéro 105, teinture qui trouvera son utilité pour les cas où il est désirable de ne pas employer un liquide contenant de l'alun.

L'une et l'autre de ces teintures colorent en un ton violet assez semblable à celui du carmin à l'alun de Grenacher. On peut obtenir un ton plus rouge en ajoutant du chlorure de calcium à la solution de Garmalun. Mais cela n'est pas à conseiller, car l'addition de chlorure de calcium précipite la solution en formant du gypse. L'addition de chlorure de calcium ne précipite naturellement pas la solution au chlorure d'aluminium; mais pour d'autres motifs on n'obtient pas de bons résultats en additionnant ainsi la solution de chlorure d'aluminium dont nous avons parlé jusqu'ici. On arrive au but en additionnant de chlorure de calcium une solution alcoolique de

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chlorure d'aluminium. De cette façon on obtient une teinture alcoolique donnant une coloration rouge. Ce liquide sera étudié plus loin sous le titre de Paracarmin.

II sera intéressant de comparer ces considérations théoriques sur les teintures à Tacide carminique avec ce qui sera dit plus loin (n* 124) sur la théorie des teintures à Thématoxyline. On y remarquera un certain parallélisme instructif. Dans les deux cas, ce n'est pas la matière colorante seule qui agit, c'est toujours cette matière associée à Valumine.

La teinture s'obtient toujours au moyen de l'acide carminique plus l'alumine ou au moyen de l'hématéine plus l'alumine ; d'autres substances, telles que la chaux, jouant rarement un rôle dans la teinture.

101. Théorie des teintures à, la cochenille. — D'après Mater, dont les plus anciennes recherches sur cette matière se trouvent confirmées par ses études les plus récentes [Mitth. ZooL Slat. Neapel, X, 3, 189â, p. 496), le principe actif des extraits ou teintures histologiques de cochenille n'est pas l'acide carminique libre, mais un composé de cet acide avec une base, laquelle n'est pas la chaux mais un alcali. L'extrait aqueux de cochenille ne contient que des traces de chaux, l'extrait alcoolique n'en renferme pas même des traces. L'extrait aqueux, préparé au moyen de Yalun (soit cochenille de Partsch ou de Czokor), doit ses propriétés tinctoriales à la formation d'un canninate d'alumine^ sel dont les propriétés générales ont été discutées dans le paragraphe précédent. La teinture préparée avec Yalcool pur ne contient au contraire que ce carminate d'un alcali que nous avons mentionné tout à l'heure. Ce carminate seul colore d'une façon faible et diffuse, comme le fait l'acide carminique seul. Mais s'il se rencontre, dans les tissus à teindre, avec des sels de chaux, d'alumine ou de magnésie qui soient capables d'entrer en combinaison avec lui et de fournir au sein des tissus des précipités colorés insolubles, alors il peut résulter une coloration énergique et très élective. En efTet, Vancienne teinture alcooliqu^e simple de Mayer donne des colorations superbes avec certains objets, c'est-à-dire avec ceux qui contiennent les sels en question. Malheureusement les objets ainsi constitués sont plutôt rares, et avec la plupart des objets histologiques la coloration fournie par cette teinture est assez pâle.

Or Mayer a trouvé qu'en ajoutant les sels en question à la teinture on obtient une solution colorante qui contient elle-même tous les éléments nécessaires pour fournir une coloration forte et élective avec toutes sortes d'objets. D'où la nouvelle formule, n** 120.

102. Acide carminique pur. — On peutseleprocurerchezE. Merck à Darnir^tadl, ou chez Grûbler (adr. dans le chap. précédent). Le prix (variable 1 est dans les environs de 2 fr. 50 âS fr. parlOgrammes.M.le D"" Maycr m'écrit du reste que la qualité laisse souvent à désirer ; des ôchaïUillons récemment fournis se sont trouvés contenir souvent un peu d*aiïimoniaque ou d'alcali fixe.

103. Choix d'une teinture au carmin. — Dans mon opinion, l'uLililù ^ îisentielle des teintures au carmin se trouve dans leurs exccllLuites qualités pour les colorations d'objets entiers. Pour les coupes, je les trouve décidément inférieures aux anilines classiques et à plusieurs teintures à Thématéine. On peut donc rejeter toutes les anciLMioes formules proposées pour la coloration de coupes. Pour les autres, il y a lieu de croire que les formules de Mayer viendront sous peu, en vertu de leur rationalité et de l'égalité constante des produils (|u*elles fournissent, à prendre la place de bien des teintures jus«|u'ici fort estimées. Ce ne sera peut-être pas tant en vertu d'une supériorilé absolue des liquides de Mayer au point de vue de la précision oi] de l'énergie de la coloration^ que pour d'autres motifs. Je n'ai pas pu trouver (Mayer du reste ne Ta jamais affirmé) que le I^aracaiMiin soit toujours supérieur au carmin boracique sous ces rapportai, bien qu'il fournisse certainement souvent une coloration plus fine. IjC carmalun m'a donné dea colorations égales en beauté et eu prt cision à celles du carmin aluné, mais pas supérieures. Les deux liquides de Mayer ont cependant d'autres points de supériorité que nous cnumérerons dans leurs paragraphes respectifs. Je pense f|ue, s'il n'était un peu coûteux, le Carmalun pourrait remplacer avec avaiilage le carmin aluné dans les laboratoires, mais que pour le iDonient il faudra maintenir le carmin boracique à côté du Paracarmin.

En tout cas, il y a lieu d'espérer que les démonstrations de Mayer auront rrossi à barrer le flot de formules irrationnelles pour teintures au carmin qui nous a si longtemps assiégés.