TEINTURES ALCOOLIQUES

118. Carmin au borax, alcoolique (Grenacher ; Arch. f. mik. Anat., XVI, 1879, p. 466 et suivante). — On fait une solution concentrée de carmin dans une solution de borax(carniin, 2à3p.i0i); borax, 4 p. 100) * ; on ajoute un volume égal d'alcool à 70 degrés ; on laisse reposer ', et Ton Oltre. On y laisse les préparations le temps nécessaire pour qu'elles soient pénétrées, et on les porte, sans lavage préalable, dans de l'alcool ^ contenant 4 à 6 gouttes d'acide chlorhydrique par 100 ce. On les laisse dans ce liquide jusqu'à ce qu'elles soient bien pénétrées*, puis on les lave à l'alcool pur.

* Faire bouillir pendant une demi-heure ou plus (Mayer). ■ Vingt-quatre heures (Mayer).

' A 70 p. 100 ; cela est absolument nécessaire (Mayer).

* Celte indication n'accorde pas assez de temps à la difTérenciation ; il faut parfois des jours entiers (Mayer).

La proportion d'alcool contenue dans cette solution suffit pour la bonne conservation de tous les objets qui ne sont pas très délicats et qui ne demandent pas une immersion très prolongée pour être imbibés. Pour les objets qui demandent par exemple une immersion de plusieurs jours au lieu de quelques heures, il y a utilité à augmenter la dose d'alcool. Nous trouvons même, pour notre part, que les solutions plus alcooliques sont, dans la plupart des cas, préférables à la solution ordinaire; la conservation des cellules est souvent sensiblement meilleure, la solution étant en même temps plus neutre et moins aqueuse ; et nous croyons que la coloration est plus précise et plus facile à contrôler. On peut ajouter de Talcool visqu*à concurrence de 50 p. 100 ; en tout cas pas au delà de 60p. 100 (Mayer).

Pour la décoloration, nous nous servons d'une solution d'acide chlorhydrique encore plus étendue, que nous avons appris à connaître dans le Laboratoire de Morphologie de l'Université de Genève ; à savoir, 33 gouttes d'acide par litre d'alcool. On- y laisse les objets jusqu'à ce qu'ils présentent une certaine transparence et un certain aspect brillant qui indiquent que les tissus sont suffisamment décolorés et la couleur fixée dans les noyaux.

Ce carmin peut servir à colorer des objets qui ont été fixés dans le mélanjge de Flemming, à condition qu'ils aient été bien lavés.

Il est certainement l'une des plus importantes de toutes les teintures histologiques. Tous les observateurs sont d'accord pour reconnaître à quel point il est d'iXn emploi commode.

Les colorations sont parfaitement stables dans tous les milieux conservateurs *.

119. Paracarmin (Mayer, Mitth. Zool.Stat. Neapel, X, 3, 1894, p. 491). — Acide carminique, 1 gr. ; chlorure d'aluminium, 0, 5 gr. ; chlorure de calcium, 4 gr. ; alcool, 70 p. 100 à 100 ce. Faire dissoudre au froid ou à l'aide delà chaleur, laisser déposer, et filtrer. Liquide d'un rouge clair, très propre aux colorations en masse ; c'est la teinture qui se rapproche le plus du carmin au borax alcoolique de Grenacher.

Les tissus à colorer ne doivent pas avoir une réaction alcaline*. Après coloration, les coupes (ou les objets destinés à être débités en coupes) doivent être lavées à l'alcool pur à 70 p. 100. Les objets desli-

1 Le seraient-elles dans la glycérine ? (Mayer.)

s Ni contenir beaucoup de carbonate de chaux (spicules ou portions squelet* tiques calcaires des Coraux, etc.), qui donnerait lieu à des précipités. (Mayer.)

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nés à être montés entiers peuvent être lavés dans une solution faible de chlorure d'aluminium dans Talcool ; ou, si cela ne suffit pas, avec de Tacide acétique (à 8 p, 100 si pn prend Tacide ordinaire, 2, 8 p. 100 si Ton prend l'acide cristallisable) dans Talcool.

Coloration nucléaire, rouge, mais d'un rouge moins éclatant que celui du carmin au borax. Cette teinture possède les points suivants de supériorité sur le carmin au borax. Elle n'est pas alcaline, ce qui fait qu'elle est plus inolîensive au point de vue de la conservation des tissus ; elle est plus fortement alcoolisée, ce qui fait qu'elle a plus de pénétration ; elle n'a pas cette tendance qu'a le carmin au borax de former des précipités granuleux à l'intérieur de certains objets et elle se conserve parfaitement sans précipiter. Il me semble pour ma part que c'est un réactif plus fin que le carmin borax, qui a certainement ses qualités brillantes, mais qui est comparativement un peu brutal.

120. Teintura de cochenille de Mayer, nouvelle formule (Mitth, ZooL Stat. Neapel, X, 3, 1892, p. 498). — Cochenille, 5 gr. ; chlorure de calcium, 5 gr. ; chlorure d'aluminium, 0,5 gr. ; acide nitrique (d'une densité de 1,20), 8 gouttes; alcool à 50 p. 100, 100 ce. On pulvérise finement la cochenille et on la broyé intimement avec les sels en nature, on ajoute Talcool et Tacide, on chauffe à rébullition, on laisse refroidir, on laisse le tout pendant quelques jours en agitant fréquemment, et Ton filtre.

Les objets doivent être saturés d*alcool à 50 p. 100 avant la coloration, et c'est dans de Talcool de ce titre qu'il faut les laver ensuite.

Coloration assez semblable à celle du Paracarmin, mais ni aussi énergique ni aussi élective. Mayer propose cette teinture seulement comme succédané du Paracarmin. '

Ce liquide est contre-indiqué pour des tissus contenant des éléments calcaires.

121. Teinture de cochenille de Mayer, ancienne formule. (Paul Mayer, Mitth. Zool. Stat. Neapel, II, 1881, p. 14.) — On fait macérer de la cochenille en poudre pendant plusieurs jours dans de Talcool à 70 degrés. Il faut prendre environ 8 à 10 ce. d'alcool pour chaque gramme de cochenille, remuer fréquemment, puis filtrer.

Les objets à colorer doivent être imbibés d'alcool du même titre que celui qui a servi à faire la solution ; et il faut avoir soin d'employer toujours de l'alcool de ce titre pour le lavage des objets ou pour diluer la solution elle-même.

Il est très important de bien débarrasser les objets d'acide avant de les colorer. Si l'on néglige cette précaution, on n'obtient que des colorations diffuses. Les objets préparés à l'acide osmiqne ne se colorent que faiblement, à moins qu'on ne les ait préalablement blanchis. Les objets préparés à l'acide chromique se colorent bien, encore mieux ceux qui ont été fixés par un liquide picrique ou par l'alcool absolu.

Les colorations excessives ont très rarement lieu. On peut les corriger

par de Talcool acidulé avec 1 p. 100 d'acide acétique ou 1 p. 100 d'acide chlorhydrique.

Nous avons indiqué plus haut (n<> 101) les raisons pour lesquelles cette teinture ne fournit des colorations parfaitement réussies qu'avec certains objets. Pour ces motifs Mayer lui-même parait disposé à l'abandonner entièrement en faveur de la nouvelle formule. Je l'ai conservée ici parce qu'il me semble toujours que c'est un réactif qu'il est bon de connaître. Pour celui qui étudie l'histologie des Arthropodes, j'estime que c'est un réactif indispensable. La nouvelle formule donne un liquide, qui pour bien des objets est insuffisamment alcoolique. Ajoutons que l'ancienne teinture est à réaction neutre et peut être employée avec des objets calcaires. Quoi de meilleur, par exemple, pour préparer un Pluteus ?

122. Carmin à Tacide chlorhydrique, alcoolique. — Ce carmin est assez important. Seul il permet d'obtenir une coloration à la fois énergique et rapide, par le moyen de solutions faites avec de Valcool très fort, jusqu'à l'alcool absolu. Gela est précieux pour la coloration en masse d'objets très difficilement pénétrables (pièces protégées par la chitine). Ces solutions ont sur le carmin au borax l'avantage de contenir incomparablement plus de carmin dans l'alcool fort. On les emploie comme le carmin au borax, en opérant la décoloration avec le même alcool acidulé ' d'acide chlorhydrique. Cependant, avec une solution heureusement combinée, on peut obtenir de prime abord des colorations électives qui n'ont pas besoin de décoloration. Les colorations sont permanentes dans tous les milieux conservateurs.

a. Formule de Grenaciier (Arch. f. mik. Anat,, XVI, 1879, p. 468). — Demande le plus souvent des opérations ennuyeuses de neutralisation.

b. Formule de Paul Mayer (Garbini, Manuale per la Technica modema del microscopio, p. 46). — Mayer prend 100 grammes d'alcool absolu (ou d'un titre plus faible), il ajoute 1 ou 2 gouttes d'acide chlorhydrique, et du carmin à saturation. Il faut faire bouillir jusqu'à ce que l'on obtienne une solution claire.

D'après notre expérience, celle-ci est la manière la plus sûre de préparer le carmin à l'acide chlorhydrique. Il est à remarquer qu'il doit toujours rester un excès de carmin dans la solution. Bien préparé, ce carmin doit donner une coloration parfaitement nucléaire, sans décoloration par l'HCl.

c. Ancienne formule de P. Mayer {Mitth. ZooL Stat. Neapd, IV, 1883, p. 521).

d. Formule plus récente de P. Mayer (Intern. Monalschr. f, Anat. w. Phys,^ IV, 1887, p. 43). -— Carmin, 4 grammes ; eau, 15 ce. ; acide chlorhydrique, 30 gouttes. Faire bouillir jusqu'à dissolution du carmin, ajouter 95 ce. d'alcool à 85 p. 100, et neutraliser en ajoutant de l'ammoniaque jusqu'à ce que le carmin commence à se déposer.

Celte solution donne toujours des colorations diffuses; pour les rendre électives, il faut décolorer par l'IICl.

e. Formule de Brass (ZexL f, wiss. Mik., II, 1885, p. 303.

Il convient d'observer que si l'on désire diluer l'une ou l'autre de ces solutions, il ne faut pas employer à cet effet de l'eau, mais de l'alcool du même titre que celui qui a servi à faire la solution.

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123. Antres carmins alcooliqnes. — Nous ne citons que pour mémoire les solutions suivantes, qui sont toutes mauvaises ou superflues. Carmixl lilas au borax (TmERscu,Arch. /*. mik. Anat., 1, 1865, p. 150). Carmin picroboraté (Dutilleul, Bull, scient, dép. Nordy XVI, 1885, p. 371). Carmin sulfurique, alcoolique (Hoyer; Arch. f. mik. Anal., XIII, 1876, p. 650). Carmin à Tacide borique, alcoolique (Francotte; Bull. Soc. Belge micr., 1886, p. 48).

HÉMATOXYLINE (HÉMATÉINE) ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX

124. Théorie des teintures à rhématéine ou à l'hématoxyline. — Il paraît maintenant parfaitement établi (Nietzki, Chemie der organischen Farbsloffe, 1889, p. 215) que le principe colorant des teintures d'hématoxyline n'est pas autre chose que Vhématéine. De plus, il faut également admettre que Thématéine des solutions histologiques usuelles est un produit de Toxydation (par le moyen de Tair) de leur hématoxyline originelle (Mayer, Ueber das Fàrhen mit Haetnatoxlin, dans Mitth, Zool. Stat. Neapel, X, i, 1891 , p. 170-186; puis Unna, Ueber die Reifung unserer Farbstolfe, dans Zeit. f. wiss. Mik., VIII, IV, 1892, p. 483). Le changement produit dans les solutions par cette oxydation a été connu des histologistes depuis longtemps sous le nom de c maturation » des solutions; on se rendait bien compte que, jusqu'à ce qu'il se fût produit, les solutions n'étaient pas en état de fournir des colorations ayant les qualités désirées.

Pour réaliser la c maturation » voulue, les histologistes se fiaient jadis (d'après une tradition tout empirique et indépendante de toute théorique chimique) à l'absorption spontanée de l'oxygène de l'air par les solutions d'hématoxyline. Nous devons à Mayer et à Unna la découverte importante qu'il n'y a rien de plus facile que de réaliser cette réaction d'une manière artificielle. Il suffit, par exemple, d'ajouter à une solution alunique d'hématoxyline une faible quantité de solution neutralisée de peroxyde d'hydrogène. La solution hématoxylique c mûrit > instantanément, virant à un bleu foncé, et se trouve dès l'instant dans l'état de maturité voulue pour les colorations.

Il faut donc admettre que ï hénialéine est toujours l'élément essentiel par excellence de nos solutions. Faut-il également admettre que

uématoxylim: et autres colorants végétaux 93

cet élément seul sufQrait ? Les recherches de Mayer {loc. cit.) ont démontré qu'il ne sufGrait pas. Une solution d'hématéine pure et libre ne fournirait pas une coloration élective semblable à nos colorations histologiques ; elle ne saurait fournir au plus qu'une teinture plate et confuse de tous les éléments, teinture faible et sans relief et par conséquent pas du tout bonne. Si nous faisons abstraction pour le moment de certains procédés de coloration au moyen des laques chromiques ou ferriques d'hématoxyline (Weigert, Heidenuain), nous trouvons que les teintures histologiques usuelles se font toutes au moyen de solutions contenant de Valun. Mayer a conclu que le principe actif de ces solutions est un composé d'hématéine et d'alumine, un véritable sel.

Il suppose que ce sel se laisse précipiter au sein des tissus (surtout dans les noyaux), par certains sels organiques et inorganiques des tissus (des phosphates, par exemple) ; peut-être aussi par d'autres corps organiques appartenant au?c tissus. Nous savons que ces sels existent dans les tissus vivants. Par nos procédés de « fixation » histologique, ils y sont fixés, soit dans leur état chimique originel, comme cela doit arriver lors de la fixation par un agent neutre comme l'alcool ; ou bien sous forme de nouveaux composés formés par la combinaison de ces sels avec l'agent fixateur lui-même, comme ce serait le cas, par exemple, pour le sublimé.

Il y a donc dans ces solutions à côté de l'hématéine un autre facteur essentiel, Valumine , à laquelle peuvent s'ajouter certains autres corps qui peuvent jouer un rôle secondaire dans la coloration, comme par exemple le chlorure de calcium dans la solution de Kleinenberg. En un mot, il y a, comme nous l'avons fait remarquer au numéro 100, un parallélisme étroit entre les teintures à l'hématéine et les teintures au carmin. Ces principes étant admis, il suit que la première préoccupation de l'histologiste qui travaille avec des teintures à base d'hématoxyline doit être de réaliser la conversion de l'hématoxyline de ses solutions en hématéine, afin d'obtenir la formation de la laque aluminiquc d'hématéine désirée. S'il se contente de laisser l'oxydation se faire par le procédé anciennement usité de c maturation > des solutions par l'action de l'air, il surgit des inconvénients. En premier lieu, la maturation spontanée est fort longue ; elle exige des semaines, souvent même des mois. Ensuite, le processus d'oxydation ainsi mis en jeu ne s'arrête pas au moment voulu, c'est-à-dire aussitôt que l'hématoxyline a été convertie en hématéine. Il continue, et l'hématéine iormée subit à son tour une oxydation ultérieure qui la convertit en des composés incolores ; la solution devient trop muret et commence

à précipiter. Une telle solution est donc en réalité un mélange, dans des proportions toujours changeantes, d'éléments pas mûrs, d'éléments mûrs et d'éléments trop mûrs. Les premiers et les derniers de ces éléments sont sans effet pour la teinture ; et en conséquence la puissance colorante de la solution est très inconstante.

Cet inconvénient ne se laisse éliminer que très imparfaitement par les anciennes méthodes^ Maintenant, grâce aux importantes recherches de Mayer et d'UNNA, un grand progrès a été réalisé.

Le point essentiel des résultats de Mayer, c'est qu'il faut prendre pour base des solutions colorantes, non Thématoxyline mais l'hématéine. Nous sommes ainsi soulagés du coup de l'obligation de la maturation ennuyeuse et aléatoire des solutions par l'air,. d'après la vieille méthode. Nous avons d'emblée une solution mûre. Et pour empêcher la surmaturation spontanée de cette solution, nous avons une méthode très simple d'UNNA, dont il sera question tout à l'heure.

125. De rhématéine (Mayer, loc. cit.). — L'hématéine en substance est une masse d'un vert foncé, rouge à la lumière transmise, qui se résout si on la bi*oye en une poudre brune. Elle se dissout entièrement, quoique non sans peine, dans Teau distillée et dans l'alcool, en donnant une solution d'un brun jaunâtre qui ne se trouble pas par l'addition d'acide acétique. Avec les alcalis elle donne des solutions d'un violet bleu.

L'hématéine se trouve aujourd'hui dans le commerce ; mais Mayer n'a pu se la procurer pure que chez Geigy and G^, à Bâle. Heureusement il se trouve aussi dans le commerce un composé ammoniacal d'hématéine, c'est YMaernatein-Ammoniak, ou hémaiéate iTainmoniaque connu aussi sous le nom de haemateinum crystallisatum. On trouve ce produit, d'une pureté sufOsante, chez E. Merck, à Darmstadt. Ce composé est plus facilement soluble dans l'eau et dans l'alcool que ne l'est l'hématéine, et sert tout aussi bien pour les teintures. On peut du reste très facilement se le préparer soi-même, ce qui se fait de la manière suivante.

126. Hématéate d'ammoniaque (Mayer, ibid.). — On fait dissoudre à l'aide de la chaleur 1 gramme d'hématoxyline dans 20 ce. d'eau distillée et l'on filtre s'il y a lieu. On ajoute 1 ce. d'ammoniaque caustique (d'une densité de 08'^,875) et l'on porte le liquide pourpre qu'on a ainsi obtenu dans une capsule de telles dimensions que le fond n'en soit pas couvert à plus d'un demi-centimètre de pro* fondeur. On laisse évaporer à la température de l'air et à l'abri de la

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poussière. On doit recueillir en hématéate d'ammoniaque une quantité approximativement égale à celle de l'hématoxyline employée. Il ne faut pas activer Tévaporation par la chaleur, car cela pourrait provoquer la formation de composés insolubles dans Talcool. Le produit ne doit pas être touché par des instruments d'une substance autre que le verre, la porcelaine ou le platine, jusqu'à ce qu'il soit devenu parfaitement sec.

Nous donnons plus loin les formules de Mayer pour la préparation de teintures au moyen d'hématéine ou d*hématéate d'ammoniaque ; mais avant de le faire, nous décrirons la méthode d'UNNA pour la conservation de solutions d'hématéine. (Sa méthode d*oxydation par le peroxyde d'hydrogène n'est rien moins que pratique, et nous la supprimons.)

127. Solution mi-mûre et constante d'Unna {Zeit. f. wiss. Mik,, VIII, 4, 1892, p. 483). — Unna a cherché le moyen d'arrêter au point voulu ce processus d'oxydation continue et spontanée qui, comme nous l'avons dit, conduit rapidement à un étal de maturité excessive. Et il a trouvé le moyen de l'arrêter à une étape quelconque, de manière à produire une solution mi-mûre constante. On arrive à ce résultat par le simple moyen d'additionner la solution d'un agent réducteur» Unna recommande la formule suivante :

Uématoiyline 1

Alun 10

Alcool 100

Eau 200

Soufre sublimé 2

' En ajoutant le soufre à la solution hématoxylique au moment où celle-ci est devenue assez fortement bleuie, par exemple, après avoir attendu deux ou trois jours, on fixe le degré d*oxydation que la solution a atteint à ce moment. On peut alors employer la solution telle quelle pour la teinture. Elle ne donnera pas en cet état une coloration aussi énergique et aussi précise qu'une solution rendue totalement mûre par le peroxyde d'hydrogène; mais on aura l'avantage d'avoir une coloration qui ne demandera pas de décoloration subséquente par des acides.

Je pense qu'il est bon de connaître ce procédé, qui peut avoir son utilité dans certafns cas qui peuvent se présenter. Mais je pense qu'il ne saurait prétendre à être mis sur le même rang que les méthodes de Mayer.

128. Caractères des teintures à l'hématéine (soit hématozyline). — Les solutions aluminiques d'hématéine (soit hématoxyline, nous avons suftisamment expliqué que les soi-disant teintures à Thématoxyline sont en réalité des teintures à l'hématéine) colorent en divers tons de bleu ou de violet rougeâtre selon la réaction de la solu* tion employée. Les solutions neutres ou alcalines colorent en bleu pur ;

96 CHAPITRE VllI

les solutions acides donnent un ton rougeâlre. Pour faire virer au bleu le ton rouge produit par les solutions acides, c*est une pratique assez générale de traiter les préparations par de Tammoniaque très diluée. Cette pratique repose sur la croyance que le virage au bleu serait TelTet de la neutralisation par Tammoniaque de Tacide qui aurait été la cause du ton rouge. Il est des motifs pour croire que cette croyance est erronée. Squire [Methods and Formulae^ etc., 4892, p. 22) a démontré que des tissus colorés par la solution acide d'Ehrlich peuvent être bleuis par Teau distillée parfaitement pure et ne contenant pas même une trace d'ammoniaque. Squire admet cependant que le virage est activé par la présence dans l'eau d'une trace d'un alcali; ce qui explique la pratique, également très répandue, qui consiste à bleuir les préparations en les lavant pendant un temps suffisant (qui peut être jusqu'à plusieurs heures) dans de l'eau de source, qui est généralement chargée d'une quantité suffisante de carbonate de chaux ou autres corps basiques. Mayer donne une autre explication de la réaction. L'ammoniaque n'agirait pas en neutralisant l'acide, mais en précipitant l'alumine combinée à i'hématéine. S'il n'y avait pas d'alumine enjeu, l'ammoniaque produirait un virage au violet, non au bleu.

En tout cas, ce qu'il importe de retenir, c'est qu'on peut le plus souvent arriver au but par la simple eau de source, et qu'on y arrive avec une entière certitude par une solution de bicarbonate de soude, ou d'acétate de soude ou de potasse. C'est ce dernier qui est le plus inoffensif (Mayer). (Le virage de coupes peut être obtenu en quelques minutes en les traitant par une solution à 1 p. dOOO de bicarbonate de soude dans l'eau distillée (Squire, L c). (Voyez aussi Hœmacalciurriy n^ 139.) Et c'est bien là la marche à préférer, car l'ammoniaque n'est certes pas un réactif inoffensif pour les éléments histologiques délicats. Naturellement toute cette question de virage est à distinguer de celle de la nécessité qu'il peut y avoir de neutraliser par un alcali des tissus qui ont été traités par un acide pour corriger une sur-coloration. Dans ce cas la neutralisation peut être indiquée dans l'intérêt de la permanence de la coloration.

D'après Watney (PhiL Trans., 1882, p. 1075; Krause, Intern. Zeit. f, Anat. u, Hist.^ I, p. 154), nous citons d'après Max Flesch, Zeit, f. wiss. Mik.^ 1885, p. 353), on obtient un bleu ialense si l'oa emploie des teintures faites avec de l'alun fraîchement préparé; tandis qu'on obtient un ton rouge si l'on emploie de l'alun vieux dans lequel il s'est développé de l'acide libre, comme cela arrive presque toujours pour l'alun longtemps conservé. On obtient cette réaction surtout avec les solutions dans lesquelles la proportion d'alun est moindre que le tiers de l'extrait de bois de Gampéche

employé. Les solutions rouges colorent le tissu conjonctif et le protoplasma de ses cellules, de même que les granules des cellules à granulations (« Plasmazellen ») ; tandis que les solutions bleues présentent une affinité spéciale pour la mucineet pour presque toutes les sortes de noyaux.

Or, Langhans (d'après Max Flesch, loc. cit.) a découvert qu'on peut obtenir ces deux réactions électives avec une seule solution. Il sufOt pour cela de colorer par Thématoxyline de Delafield et après avoir monté les préparations au baume, de les exposer pendant un temps prolongé à la lumière. (Les préparations à la glycérine ne fournissent pas cette réaction.)

Aucune des anciennes solutions préparées avec Vhématoxyline n'est parfaitement stable (ni du reste le Hémalun non plus) comme nous Tavons suffisamment expliqué plus haut; tout au plus en trouverait-on une ou deux qui soient un peu tolérables à cet égard (celle d'Ehrlich cependant se maintient très bien) (Mayer).

Les teintures hématoxyliques à laque alunique passent pour être des colorants nucléaires. Elles le sont en ce sens qu'elles ont une affinité énergique pour la chromatine des noyaux. Mais elles ont aussi des affinités très marquées pour bien des éléments de la cellule en dehors du noyau. Elles ne fourniront donc des élections pures de la chromatine que moyennant les précautions voulues, teinture pas trop prolongée, ou bien lente, mais faite dans des solutions très diluées. Avec la plupart de ces solutions les colorations excessives s'établissent avec la plus grande facilité. On les corrige par des lavages prolongés dans de la solution d'alun (d'une concentration de 0,8 à 1 p. 100 par exemple), mais cela demande le plus souvent beaucoup de patience. On arrive plus vite au but en employant un acide quelconque, par exemple, l'acide chlorhydrique (de 0,1 à 0,2 ou même 0,5 p. 100). Après ces lavages, pour assurer la permanence de la teinture, il faut neutraliser les tissus avec un alcali (voyez plus haut ce qui a été dit à propos du bleuissage de la coloration).

Le bicarbonate de soude à 0,1 p. 100 sert bien pour ces neutralisations. Si l'on désire employer ce sel en solution alcoolique, on peut procéder comme l'indique von Wistinguausen (Mitth, Stat. ZooL Neapel, X, 1891, p. 41 ; Zeit.f. wiss. Mik., X, 4,1893, p. 480). On fait dissoudre du bicarbonate de soude à l'aide de la chaleur dans de l'alcool à 70 p. 100 (il s'en dissout très peu), et l'on filtre après refroidissement. Pour les lavages, on ajoute 3 à S gouttes de la solution à un verre de montre d'alcool à 70 p. 100.

Il faut user de précautions sérieuses pour assurer la permanence de la coloration. Si l'on a employé des acides, il faut les enlever complètement ou les neutraliser avec le plus grand soin. La plupart des teintures donnent des colorations qui se conservent mieux dans le

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baume que dans les milieux aqueux. Mayer trouve que ses préparations à l'hématéine se sont bien conservées tant dans des milieux aqueux que dans le baume (voyez plus loin).

Les nouvelles teintures à base dhématéine sont en grande partie exemptes des inconvénients que nous venons d'énumérer.

129. Emploi. — Ces teintures servent à des besognes très variées, il en est une pour laquelle elles sont à peu près indispensables, c'est la coloration en masse d'objets qui ont été fortement fixés dans des liquides chromiques ou osmiques. Pour ces cas, l'hématéine peut réussir là où tout autre colorant échouerait. Elle rend aussi de grands services pour certaines recherches spéciales, telles que l'étude du Nebenkern et de la figure achromatique de la division mitosique, agissant en ces cas comme colorant plasmatique. Elle fournit aussi des colorations spécifiques et très importantes d'éléments nerveux (voir à la Deuxième Partie). Bien des histologistes s*en servent à titre de colorant normal pour leurs coupes. On peut admettre que depuis que les travaux de Mayer et d'autres nous ont mis à même de régler d'une manière scientifiquQ l'emploi de l'hématéine, cette pratique est justifiable.

Pour les coupes je recommande beaucoup, outre l'Hémalun de Mayer le procédé à la laque d'alun de fer de M. Heidenhain, qui m'a donné des résultats superbes et est en somme assez facile à exécuter.

Pour les colorations eu masse, l'Hémalun ou THémacalcium de Mayer.

Quant aux anciennes méthodes, je n'hésite pas à dire que, eu égard aux grands avantages offerts par les procédés de Mayer, les anciennes méthodes doivent être abandonnées, et seules les formules de Mayer, ou du moins des formules qui se conforment aux principes établis par ce savant, doivent être employées par les travailleurs sérieux. (Ceci s'entend seulement des procédés usuels de coloration par les laques aluminiques, et non des procédés spéciaux par les laques chromiques, etc.)

A. — Laques aluminiques

a. Solutions aqueuses.

130. Hémalun (Mayer, Mitth. ZooL Stat. Neapel, X, i, 1891, p. ITâ). — On fait dissoudre 1 gramme d'hématéine. ou d'hématéate d'ammoniaque (no 125) à l'aide de la chaleur dans 50 ce. d!alcool à 90 p. 100 et on l'ajoute à une solution de 50 grammes d'alun dans un litre

d'eau distillée. On laisse refroidir et déposer, on filtre s'il y a lieu, et Ton ajoute un cristal de thymol. On obtient un liquide foncé d'un ton violet rougeâtre. Le ton exact dépendra beaucoup de la qualité de l'alun (Mayer). Celte teinture correspond à l'hématoxyline de Bôumer*. Elle colore largement aussi bien, et cela soit immédiatement, soit plus tard, car elle est naturellement mûre dès le premier moment. On peut s'en servir, soit concentrée, soit diluée. A l'état concentré, elle colore presque instantanément (des coupes ont été colorées en les inondant une seule fois du liquide). Allongée de vingt volumes d'eau distillée, elle colorera des tentacules de Tubularia à travers toute leur épaisseur en une heure (pour allonger les solutions, il faut avoir soin de n'employer que l'eau distillée ou plutôt une solution faible d'alun dans l'eau distillée). Les lavages peuvent se faire soit à leau distillée, soit à l'eau de source. '

Cette teinture est admirable pour les coloVaiions d'objets entiers. Des objets volumineux demanderont cependant un bain de vingtquatre heures et un lavage de même durée (au mieux dans de la solution d'alun au centième, si l'on désire une coloration nucléaire très précise).

Les préparations se conservent bien dans la glycérine, pourvu que celle-ci ne soit pas acide, et aussi dans le baume. Il faut observer que si l'on a employé l'essence de. bergamote pour l'éclaircissement, il faut l'enlever soigneusement par de l'essence de térébenthine avant de passer au baume ; et que remploi de l'essence de giroQes n'est pas sans danger. Il vaut mieux (Mayer, in litt.) n'employer que le xylol, le benzol et le chloroforme, et monter dans le baume au xylol ou au chloroforme. La solution d'hémalun peut être additionnée de carmin à l'alun, de fuchsine-acide, etc., afin de produire des colorations doubles; mais pour ce but il semble préférable d'employer les deux teintures successivement.

131. Hémalun acide (Mayer, loc. cit., p. 174, note). — C'est de rhémalun additionné de 2 p. 100 d'acide acétique cristallisable (ou de 4 p. 100 d'acide acétique ordinaire). Emploi comme pour* Thémalun simple, lavage à l'eau de source pour bleuir la coloration. Celte solution donne une coloration nucléaire peut-être encore plus précise qtie Thémalun simple. Elle a aussi l'avantage de ne pas donner

* Comme pour la formule de Bôhmer, il n^est pas nécessaire de se conformer exactement aux proportions indiquées. On peut toujours improviser une solution d'hémalun en ajoutant quelques gouttes de solution alcoolique d'hématéine à une solution d*alun de la. concentration qu'on voudra.

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de précipités par suite d'une décomposition partielle provoquée par Tammoniaque de l'air et Talcali du verre des flacons, phénomène qui se manifeste bien à un certain degré pour l'hémalun simple, cependant pas au point de nuire à sa puissance tinctoriale.

131 bis. Solution mûre deHsLiiaeniZooLAnz.^ 1895, p. 158). — Après avoir essayé plusieurs moyens d'oxydation, Hansen s'est arrêté au pe^'inanganale de potasse. On fait dissoudre 1 gr. d'hématoxyiine cristallisée dans 10 gr. d'alcool absolu.

Ou fait dissoudre à Taide de la chaleur 20 gr. d*alun de potasse dans 200 gr. d'eau distillée et l'on filtre après refroidissement. Le lendemain on mêle les deux solutions.

On met dans une capsule de porcelaine 3 ce. de solution aqueuse concentrée de permanganate de potasse (à 15° G. il se dissout une partie de permanganate pour 16 d'eau). On ajoute la solution d'hématoxyiine, et tout en remuant continuellement on chauffe graduellement jusqu'à ébulUtion. Le liquide devient violet-rouge foncé. On laisse bouillir pendant une demiminute à une minute. Alors on refroidit le mélange, au mieux rapidement, en faisant flotter la capsule sur de l'eau froide. On filtre après refroidissement, mais en général la filtration n'est guère nécessaire. La solution est maintenant mûre et prête à servir.

Le motif pour lequel Hansen a été conduit à élaborer ce procédé de préparation, c'est qu'il avait fait l'expérience que l'hématéine du commerce n'est pas d'une qualité constante et ne fournit pas toujours des solutions identiques sous le rapport de la coloration des tissus. Hansen trouve que son procédé fournit un produit plus égal. Et il parait trouver son procédé plus simple et plus rapide que celui de Mayer pour la préparation d'hématéate d'ammoniaque.

Une solution fraîchement préparée m'a donné des résultats de toute beauté. La marche de la coloration est semblable à celle de Thémalun, et les résultats sont à tel point identiques qu'il serait fort difficile sinon impossible de reconnaître les coupes colorées par les deux méthodes, si elles venaient à perdre leurs étiquettes.

Hansen dit que sa solution se conserve mieux que les autres. Celle que j'ai préparée a formé en peu de jours une pellicule qui a rendu nécessaire une filtration ; et peu de jours après le phénomène s'est renouvelé. Et Mayer {in liU.) a trouvé après peu de jours un fort précipité. La précipitation dans mon flacon continue ; et je pense qu'en vue de ce grave inconvénient la solution de Hansen ne peut pas prétendre à remplacer celle de Mayer.

132. Solution ammoniacale (Ammoniated Hematoxyline de Squire, Sqitire, Melhods and Formula*, etc., 1892, p. 24).

Je l'ai essayée. Elle me fait fefTet de ne pas être d'une maturité constante, et je ne puis pas la recommander au même titre que l'hémaiun de Mayer, dont la coloration me parait d'ailleurs sensiblement plus délicate.

133. Hematoxyline de Bœhmer (Arch. f. mik. AnaL, IV, 1868, p. 345 ; — parait avoir été publiée en premier lieu, avec des proportions un peu

HÉMATOXYLINE ET AUTRES COLORANTS VÉGÉTAUX lOi

différentes, dans le AerzUiches IntelligenzbL^ Baiera, 1865, n^ 38). ~ On fait une solution de :

Hématoxyline cristallisée 1 partie.

Alcool absolu 12 —

Et une seconde solution de :

Alun puriné 1 partie.

Eau distillée 240 —

On ajoute deux ou trois gouttes de la première à un verre de montre plein de la seconde.

Pour avoir de bonnes colorations il faut laisser mûrir longtemps (selon Mayer, deux mois).

On peut conserver en réserve une provision de la solution alcoolique d'hématoxyline. Elle devient brune, mais ne perd pas ses qualités pendant des années.

Nous pensons que quiconque a réfléchi aux principes exposés dans les premiers paragraphes de ce chapitre ne se servira plus de cette formule ancienne que comme dernière ressource dans des moments où il n*aurait pas sous la main une teinture se conformant mieux à ces principes

134. Hématoxyline à ralun; Ranvier {Comptes rendus Acad. 5c., 1882, 2° Sem., t. XCV, p. 1375, — et Contejean {Bull. Soc. Philomath. Paris, 8, 3, 1891, p. 117).

135. Hématoxyline de Delafield. — Cette formule a une histoire curieuse. Employée depuis longtemps dans l'Institut pathologique de Heidelberg, elle fut communiquée par Pfîtzner à Flemming, qui, en la recommandant d'une façon particulière dans son Zellsubstanz Kern u, Zelltheilung, la fit connaître et apprécier. Flemming Tattribua d'abord h Grenacher. Plus tard, ajant appris que cette attribution était erronée, il crut devoir l'attribuer à Prudden ; et ce n'est que récemment {Zeit. /*. wiss, Mikroskopie, II, 1885, p. 288) que nous avons appris par Prudden que la formule est due à Delafield. Nous la donnons d'après Prudden, loc, cit. A 400 ce. d'une solution saturée d'alun d'ammoniaque dans l'eau (il se dissout environ i partie dans 11 d'eau), on ajoute 4 grammes d'hématoxyline cristallisée dissoute dans 25 ce. d'alcool fort. On laisse le tout exposé à l'air et à la lumière pendant trois ou quatre jours, on filtre et on ajoute 100 ce. de glycérine et 100 ce. d'alcool méthylique (esprit-de-bois, CIl^O). On laisse reposer jusqu'à ce que la solution ait acquis une couleur suffisamment foncée (on fera bien de laisser mûrir très longtemps, six semaines à deux mois), on filtre, et l'on conserve la solution dans un flacon bien bouché. Au moment de s'en servir, on doit l'étendre d'une quantité considérable d'eau.

On peut, et avec avantage, se servir d'hémaléine pour fabriquer cette teinture (Mann, Zeit. f. wiss. Mik., XI, 4, 1895, p. 487).

Cette solution est une teinture très énergique. Elle colore en général des éléments extra-nucléaires en même temps que la chromatine des noyaux. En effet, c'est à titre de colorant plasmatique qu'elle fut préconisée par Flemming (/. c). Je l'ai employée comme colorant plasmatique pour des coupes, avec de bons résultats. Mais je pense que pour cette fin elle a fait

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son temps. Bien d'autres teintures seraient à lui être préférées à cet égard (hématoxyline à Talun de fer de M. Heidenhain,- Kernschwarz, safranine et Lichtgrûn de Benda, et d'autres encore). Elle pourra peut-être encore être utile pour la coloration en masse de tissus très réfractaires à la coloration.

BuTSCHLi {Unters. ueb, mikroskopische Schàume, etc., 1892 ; Zext.f. wiss. Mik.f IX, 2, 1892, p. 197) a recommandé d'allonger la solution fortement d'eau et d'y ajouter, assez d'acide acétique pour donner un ton franchement rouge.