GROUPE DES COULEURS DE NAPHTALINE

Rose de naphtaline. (Rosa-naphihylamine, Rouge de naphtaline, Magdala). Cette couleurpeut également être classée près de la safranine.

Eau chaude et alcool.

Rouge.

L'un des meilleurs des colorants des noyaux par voie régressive.

(Flemming). No 172.

160. Classification cy tologique des couleurs. — On rencontre fréquemment dans la littérature une classification histologique (ou mieux, cytologique) des couleurs de la houille, due à Ehrlich ( Verh, d. BerL phys, Gesellsch.^ 16 mai 1879 ; — dans Reichert u, du Bois-Reymond's Arch. f. Anat, w. Phys,, Phys. Abth., 1879, p. 571).

D'après Ehrlich, les c couleurs basiques », ou couleurs dans lesquelles la substance colorante joue le rôle de base combinée avec un acide incolore, possèdent en général une tendance à se localiser d'elles-mêmes et directement dans les noyaux ; — tandis que les c couleurs acides », ou couleurs dans lesquelles la substance colorante proprement dite joue le rôle d'un acide dans la combinaison, colorent d'une manière difTuse, ou -se localisent principalement dans le cytoplasma et les substances intercellulaires. (Pour un exemple de cette distinction en couleurs basiques et acides, voyez Fuchsine Acide, no 189.)

'A ces deux groupes principaux on peut ajouter un petit groi%^ de cou-

leurs neutres. Bien peu des couleurs du commerce possèdent la constitution chimique qui les placerait dans ce dernier groupe ; Ehrlich admet qu'il s'en forme lorsqu'on mélange les solutions d'une couleur basique et d'une couleur acide. Ces corps neutres seraient insolubles dans l'eau pure, et se précipitent lorsqu'on fait le mélange, mais se dissolvent si l'on ajoute un excès de la couleur acide. Ils auraient des affmités spéciales pour certaines enclaves cellulaires,

Nous aurions donc ainsi trois groupes de couleurs, qui seraient définis en même temps par leur constitution chimique et par leurs afflnités cytologiques :

Nous aurions les couleurs basiques (dans le sens ci-dessus donné à ce mot, ce qui n'implique nullement une réaction alcaline de la solution du corps en question), qui seraient des colorants de la chromatine, ou des colorants nucléaires ; — les couleurs acides, qui seraient des colorants plasmatiques ; puis les couleurs neutres, qui seraient des colorants spécifiques pour certains éléments des cellules. Mais il semble que la généralisation d'Ehrlich, sans doute fort exacte au point de vue théorique, ne se laisse pas appliquer sans beaucoup de restrictions aux réalités de la technique. Nous avons à tenir compte dans la pratique non seulement des affinités de la couleur pour tel ou tel élément comme elles se révèlent à la teinture progressive; il nous faut aussi tenir compte de la résistance de la couleur aux liquides de lavage et de déshydratation et éclaircissement, en un mot, de sa manière de se comporter à la teinture régressive. Et cela est ici particulièrement important parce que, en effet, l'emploi principal des couleurs de la houille se trouve dans la coloration par voie régressive de coupes destinées à être déshydratées par l'alcool et montées au baume. Or les expériences d'Ehrlich ne tiennent pas compte de ces conditions. Elles ont été faites avec des cellules isolées, étalées en couche mince sur des verres à couvrir, et sans emploi d'alcool pour la déshydratation. Il en résulte que ses catégories, couleurs basiques, couleurs acides, ne correspondent pas exactement aux catégories techniques de colorants nucléaires, colorants plasmatiques.

Par exemple, l'Orange est une couleur acide. Mais cela n'empêche pas que, employée en teinture régressive, elle ne se montre comme colorant nucléaire donnant une coloration très précise de la chromatine et des nucléoles plasmatiques. La Fuchsine acide, ou Sâurefuchsine, est une couleur très acide. Elle se montre en général comme colorant plasmatique très franc; mais quelquefois à la teinture régressive (il est vrai que ce n'est que rarement et dans des conditions qu'on ne peut pas préciser) elle donne de vigoureuses colorations nucléaires. La Safranine est une couleur basique; mais par l'emploi dé mordants appropriés on peut en faire un colorant plasmatique. Il y a même bien des marques de Safranine qui ne fournissent jamais, même sans mordançage, des colorations n'intéressant pas le plasma au point de les rendre inutiles comme colorations nucléaires. Le Bleu de méthylène est une couleur basique. Mais on sait qu'employé d'après la méthode d'Ehrlich pour les soi-disant colorations vitales de nerfs ou d'autres tissus, ce qu'il fournit c'est surtout une coloration plasmatique, la coloration des noyaux qui s'y présente quelquefois n'étant qu'un épiphénomène accidentel. La Nigrosine est une couleur acide d'après Ehrlich. Employée en teinture régressive elle m'a donné des colorations nucléaires

de toute beauté, le cytoplasme ne retenant pour ainsi dire qu'une trace de couleur. D'après Griesbach, le Bordeaux, également une couleur acide, est un colorant nucléaire. Il ne serait pas difficile de donner encore plusieurs exemples de ce genre.

Il semble donc que la généralisation d'ËiiRLic H, quelque importante qu'elle soit au point de vue de la théorie cytologique, ne suffit pas à fournir une classification des couleurs de la houille au point de vue de la technique histoiogique. Nous nous en tiendrons à notre classification usuelle en colorants nucléaires et plasmatigues et nous distribuerons nos couleurs dans ces cadres d'après des considérations simplement empiriques.

161. La méthode régnc'essive de coloration ou méthode de Flemming*. — Bien peu des couleurs de la houille donnent de bonnes colorations nucléaires par voie progressive (n® 98). Il y en a deux, le vert de méthyle et le brun Bismarck, qui sont des colorants nucléaires directs de première importance. L'une de ces couleurs est d'une importance toute spéciale, ce qui fait que nous ne craignons pas de nous répéter en la signalant à l'attention du lecteur à plusieurs reprises ; c'est le vert de méthyle. C'est un colorant instantané, et le réactif le plus précis de la < chromatine » qui soit connu. Les solutions de cette substance devraient certainement se trouver sur toutes les tables de laboratoire. Après le vert de méthyle, nous avons à signaler le brun Bismarck ; c'est un bon colorant des noyaux par la voie directe, et très stable. Il y en a d'autres qui peuvent fournir ùes colorations plus ou moins électives pour les noyaux par la voie directe, mais les deux couleurs que nous venons de nommer sont sans contredit les plus importantes.

Nous réservons pour la fin de ce chapitre la considération de ces colorants directs, et nous passons tout de suite à l'exposition de Isl manière d'employer les couleurs, tout aussi importantes, qui ne se laissent utiliser que par la voie régressive (n® 95). C'est cette méthode que nous allons maintenant exposer en détail.

162. Coloration. — Des coupes seulementy ou des portions de tissu assez minces pour se comporter comme des coupes, des membranes par exemple, peuvent être traitées par cette méthode.

Les solutions jolorantes 3e font avec l'alcool, l'eau ou une solution d'huile d'aniline dans l'eau (voyez plus bas, Safranine et Gentiane), selon les diverses solubilités des couleurs employées. Il n'y a pas en

1 Le principe de cette méthode est due à Uerhann et Boettcuer; mais elle est universellement connue sous le nom de Fleuming, à qui revient le mérite d'en avoir amélioré et réglé la pratique en des points essentiels.. Pour nous conformer à la tradition usuelle nous lui conservons le titre.de « Méthode de Flemming ».

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général de motif spécial pour employer l'alcool si Teau peut suffire ; le point essentiel est d'obtenir une solution très forte. L'alcool à 50 p. 100 est très souvent employé. Les coupes doivent être très fortement colorées dans la teinture. En règle générale on ne saurait les y laisser trop longtemps ; car plus elles sont fortement colorées et mieux elles résistent à la décoloration, ce qui est un avantage. Avec les puissantes teintures obtenues au moyen de l'huile d'aniline, il suffit souvent d'un bain de quelques minutes ou une demi-heure, mais il est souvent bon d'y laisser les coupes de douze à vingt-quatre heures ou plus. Les objets préparés dans le mélange de Flemming ou dans celui de Herm ANN sont ceux qui donnent les plus beau^ résultats ; mais le matériel au sublimé, etc., peut être employé. Pour les recherches sur les noyaux il vaut mieux n'employer les teintures anilinées qu'avec du matériel bien fixé dans un liquide chromo-osmique ; car l'huile d'aniline est une base assez énergique pour altérer la chromatine si celle-ci n'a pas été parfaitement bien fixée.

Avant de procéder à la décoloration il est toujours bon de rincer les coupes dans l'eau, quelquefois même de les y bien laver, cela aide à fixer la couleur. Pour les procédés de mordançage, voyez aux n<« 96 bis, 171 bis, 171 ter.

163. Décoloration. — Les coupes traitées comme ci-dessus se trouvent être surcolorées, c'est-à-dire colorées d'une manière à la fois excessive et diffuse. Il s'agit maintenant de produire l'élection voulue par la différenciation de cette coloration diffuse ; il faut les décolorer jusqu'à un certain point.

La décoloration se fait le plus souvent par le lavage à l'alcool, tantôt pur, tantôt acidifié par l'acide chlorhydrique.Si les coupes sont isolées (coupes à la celloïdine), on les porte dans un verre de montre d'alcool. Si elles sont montées en série sur porte-objets, on met le tout dans un tube d'alcool. Il est possible de différencier simplement en versant l'alcool sur le porte-objets ; mais il vaut en général mieux employer un tube ou autre bain. Les coupes isolées dans le verre de montre commencent aussitôt à céder leur couleur à l'alcool, sous iforme de nuages qui se produisent d*abord très rapidement mais après un temps plus lentement. Les coupes sur porte-objets rendent leur couleur sous forme de rivières coulant le long du verre, ce que l'on constate plus facilement si de temps à autre on soulève la lame pour un instant au-dessus du niveau de l'alcool. Après quelque temps on constate que la formation des nuages ou des rivières de couleur parait être sur le point de cesser ; les coupes sont maintenant devè-

nues pâles et un peu transparentes y et, dans le cas de tissus fixés aux liquides chronio-osmiques, ont pris un autre ton de couleur, ce qui estdû à ce que le fond général du tissu, teinté par le liquide fixateur, reparaît aux endroits d'où la couleur d'aniline a été enlevée. Par exemple, des tissus préparés au liquide de Flemming et colorés à la safranine passent d'un rouge opaque à un violet délicat. A ce moment la difl'érenciation est complète et doit être arrêtée instantanément^ ce qui se fait de la manière que nous disons au paragraphe suivant.

On recommande en général de prendre, pour la décoloration, de l'alcool absolu. Il n'y a pas de mal à cela, mais très souvent l'alcool à 95 p. 100 suffira.

Il sera en général bon de n'employer la décoloration par l'alcool à l'acide chlorhydrique (1 p. 1000 environ) qu'avec des tissus très bien fixés dans un mélange chromo-osmique ou un liquide semblable ; car cet acide peut très bien produire des gonfiements dans les tissus imparfaitement fixés. Il faut observer aussi que l'acide extrait la couleur plus rapidement des noyaux au repos que de ceux qui sont en kinèse, ce qui est un avantage ou non selon le but que l'on a en vue. En thèse générale, on peut dire que le lavage doit se faire à l'alcool pur toutes les fois que l'on désire avoir les noyaux au repos colorés en même temps que ceux qui sont en kinèse ; les autres procédés de lavage servant surtout à différencier les kinèses.

Quant à la durée des lavages, elle varie beaucoup selon la nature des tissus et les détails du procédé que l'on met en œuvre ; peut-être pourrait-on dire qu'elle ne saurait être de moins de 30 secondes, et que le plus souvent elle n'est pas plus de deux minutes.

Un procédé très intéressant est celui de la décoloration par une deuxième teinture à couleur d'aniline. Par ce procédé la deuxième couleur se substitue à la première dans le fond général des tissus, laissant les noyaux colorés par la première teinture, ce qui produit une coloration double. Ainsi le bleu de méthylène et le violet de gentiane peuvent être enlevés des portions plasmatiques par une solution aqueuse de vésuvine ou d'éosine ; la fuchsine peut être enlevée des portions plasmatiques par une solution aqueuse de bleu de méthylène, tout en laissant les noyaux en possession de la première couleur. Flemming a obtenu des résultats importants en différenciant des coupes colorées au violet de gentiane dans une solution aqueuse d'orange (voyez pour tous ces procédés au chapitre des colorations combinées), Flemming paraît attribuer cette réaction à la nature acide de Torange. C'est possible ; Torange est une couleur acide dans le sens chimique, et sa solution dans Teau a une réaction acide. Je ne puis pas dire jusqu'à quel point la nature acide des couleurs dans le sens chimique leur peut prêter une action décolorante sur les couleurs basiques ou moins acides. Il est certain, en tout cas, que les couleurs basiques peuvent servir

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de décolorants ; nous en avons donné deux exemples tout à l'heure : — la yésuvine et le bleu de méthylène sont tous les deux des couleurs basiques.

Des procédés comme ceux de Resegotti {colorations combinées) ei de Benda (Safranine suivie de Lichtgrûn) n'entrent pas en ligne de compte ici parce que dans ces procédés la deuxième couleur est employée en solution alcoolique^ de sorte que l'action décolorante peut être attribuée, en partie du moins, à la menstrue.

Dans plus d'un des procédés de différenciation qui seront décrits plus loin, un traitement par l'acide chromique ou par l'iode intervient. Je pense que ces corps agissent en mordançant la chromatine, ce qui lui permettrait de retenir avec plus d'énergie la couleur qu'elle aurait absorbée à la teinture. Nous savons d'un côté que l'acide chromique précipite la safranine de ses solutions; de sorte que si nous admettons d'un autre côté que la chromatine ait une affinité spéciale pour cet acide (surtout la chromatine à l'état kinétique) l'explication serait complète. Comparez aussi ce que nous avons dît au n<^ 162 bis,

164. Éclaircissement. — La différenciatioii étant complète, la décoloration doit être arrêtée immédiatement, comme nous l'avons dit. Il suffit pour cela de mettre les coupes dans de Teau ; mais la pratique usuelle est d'éclaircir et monter tout de suite.

On peut éclaircir par l'essence de girofle, qui enlèvera encore de la couleur aux tissus. Ou bien on peut employer un éclaircissant qui soit sans action sur la couleur (essence de cèdre, de bergamote, xylol, loluol, et d'autres, voyez au chapitre Agents éclaircissants). Si Ton a décoloré à Talcool pur, il est souvent préférable d'employer l'essence de girofle, parce que l'alcool pur n'enlève pas toujours parfaitement la couleur aux portions plasmatiques, surtout si la coloration a été longue. Mais si elle ne l'a pas été, et surtout si l'on a décoloré à l'alcool acidifié, l'essence de girofle ne sera pas nécessaire, et du moment qu'elle n'est pas nécessaire il vaut mieux ne pas l'employer, car elle diminue quelque peu le brillant de la coloration. Cette essence a la propriété particulière de décolorer la chromatine des noyaux au repos plus rapidement que celle des noyaux en kinèse, ce qui fait qu'elle aide à un degré important à la différenciation des mitoses.

Certaines couleurs sont beaucoup plus sensibles à l'action de l'essence de girofle que d'autres. Il faut aussi tenir compte de la qualité de cette essence si fréquemment falsiQée. L'essence fraîche décolore plus rapidement que la vieille.

Des séries de coupes montées sur porte-objets se laissent éclaircir commodément en les inondant de l'agent éclaircissant.

Lorsque l'éclaircissement a été obtenu, on monte au baume ; ou bien si l'on ne désire pas monter tout de suite et que l'on ait employé

Pessence de girofle, il faut arrêter la décoloration en transportant les coupes dans un milieu qui n'attaque plus la couleur (xylol, essence de cèdre, etc.).

Pour le montage il faut éviter les solutions faites au chloroforme, ce corps attaquant souvent la couleur.

165. Résultats généraux. — Le résultat final dépend beaucoup du traitement préalable des tissus. Si vous leur avez fait subir une fixation prolongée dans le mélange fort de Flemming, et si vous avez décoloré à Talcool acidiQé et éclairci à Tessence de girofle, il ne restera en général de coloré que les nucléoles plasmatiques et la ehromatine des noyaux en kinëse, la chromatine des noyaux au repos s'étant décolorée. Si vous avez donné une fixation plus légère, soit avec le mélange faible de Flemming, soit avec un autre fixateur favorable à la coloration, et que vous ayez décoloré à Talcool pur, la chromatine des noyaux au repos demeurera colorée. Si Ton n'a décoloré que fort légèrement, le protoplasma demeurera coloré.

166. Choix d'une teinture d'aniline. — Dans les coilleurs basiques, c'est la safranine et le violet de gentiane qui sont les couleurs les plus employées, tant sous le rapport de Ténergie et la précision de la coloration que sous celui de sa permanence. J'y ajoute volontiers le bleu Victoria qui m'a toujours donné d'excellents résultats sous tous les rapports. On peut prendre l'une ou l'autre de ces couleurs selon qu'on désire avoir une coloration rouge ou bleue. La safranine sera souvent à préférer s'il ne s'agit que d'une coloration èimple. Elle donne aux forts grossissements de bonnes images tant à Téclairage du jour qu'à l'éclairage artificiel. Tandis que j'ai toujours remarqué que le violet de gentiane (et la plupart des bleus) donnent à la lampe des images dichroïques qui ne sont pas favorables à une bonne définition.

Il est une autre considération qui peut influer sur le choix. Quelques-unes de ces couleurs donnent une coloration mate; il en est ainsi pour le violet de gentiane, à tel point que dans les fortes colorations les chromosomes et nucléoles plasmatiques paraissent parfaitement opaques. Gela est favorable à la définition des limites de ces éléments, mais défavorable à la transparence des préparations ; de telles colorations ne sont à préférer que pour des coupes très minces. La safranine, le vert d'aniline, l'orange et quelques autres couleurs donnent une coloration transparente de ces éléments. C'est certainement un avantage pour des coupes tant soit peu épaisses ; mais cette

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transparence n*est pas favorable à la bonne déQnition d'objets difficiles, car elle donne lieu à la formation de lignes de diffraction. La coloration de la safranine n'est cependant pas d'une transparence excessive, et donne de bons résultats sous ce rapport.

S'agit- il de faire des colorations doubles, les bleus seront souvent à préférer comme colorants nucléaires. Car il y a plusieurs rouges qui sont de bons colorants plasmatiques, mais dans les bleus, pour autant que j*aie pu le constater, il n'y en a que peu ou point de satisfaisants. Après un bleu (ou plutôt avant) vous pouvez employer la fuchsine acide, le Congo, l'éosine, etc. Tandis qu'après la safranine je ne connais guère que le Kernschwarz que je puisse recommander comme colorant plasmatique.