CHAPITRE X SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES

A. — Colorants régressifs

167. Saft*aiiine. — Colorant de premier ordre, éneigique, brillant, très électif, parfaitement permanent dans le baume.

La condition première de la réussite dans les teintures à la safranine est de posséder une bonne marque de safranine. Nous insistons ici de nouveau sur ce que nous avons dit au numéro 99 ; — avant de se mettre à travailler avec ce réactif il convient de s'adresser à Grûbler ou un autre des fournisseurs que nous avons cités et commander une provision de la couleur en spécifiant l'emploi pour lequel elle doit servir, si c'est pour la coloration nucléaire en général, ou si c'est pour des colorations spécifiques de fibres élastiques ou pour autre emploi.

11 y a dans le commerce au moins une vingtaine de marques de safranine, qui diffèrent à un degré important sous les rapports de la couleur, du poids, de la solubilité et surtout sous le rapport des coloraticms qu'elles fournissent. Les unes sont facilement solubles dans l'eau, mais pas dans l'alcool; pour d'autres c'est le contraire; quelques-unes sont facilement solubles dans les deux menstrues. Resegotti [Zeit, f. wiss. AJik.^ V, 3, 1888, p. 320) en a étudié quatorze marques. Celle dont je me sers depuis longtemps et qui donne de bons résultats est la c Safranine 0 » de Grubler. Il faut se rappeler que, comme les procédés de fabrication changent continuellement, les résultats ne seront nullement toujours identiques.

Coloration.

Bon nombre de safranines ne sont pas suffisamment solubles dans l'eau, ce qui oblige à l'emploi d'autres menstrues.

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La solution de Phtzner {Morph. Jahrb., VI, p. 478, et VII, p. 291) se compose de 1 partie de safranine, 100 d'alcool absolu et 200 d'eau, cette dernière n'étant ajoutée qu'au bout de quelques jours.

La solution de Flkmmuïg {Arch, f. mik. Anal., XIX, 1881, p. 317) consiste en une solution concentrée dans l'alcool absolu, allongée de moitié d'eau. '^^

Les solutions de Babes [op. cit., 1883, p. 356) sont (A) un mélange à parties égales d'une solution concentrée dans l'alcool et d'une solu- f|

tîon concentrée dans Teau (j*ai trouvé cela excellent), puis (B) une solution aqueuse sursaturée faite à l'aide de la chaleur.

La solution anilinée de Babes (Zeit. f, wiss. Mik,, IV, 4, 1887, p. 470) consiste en 100 parties d'eau, 2 parties d'huile d'aniline et un excès de safranine. Babes chauffe le mélange à 60 ou 80« C. et Qltre à travers un filtre humide. Cette solution pourra être conservée pendant un mois ou deux.

La^olution de Zwaardemaeer {op. cit. y IV, 2, 1887, p, 212) est un mélange à parties égales de solution alcoolique de safranine et d'eau anilinée. L'eau anilinée se fait en agitant un peu d'huile d'aniline avec de l'eau qu'on filtre ensuite. Je me trouve très bien de cette solution.

On admet que l'aniline dans ces liquides sert de mordant et permet de raccourcir notablement la durée de la teinture.

On peut employer n'importe laquelle de ces teintures avec n'importe lequel des procédés de décoloration qui vont suivre. Nous rappelons ce qui a été dit au sujet de l'emploi de l'huile d'aniline au numéro 162.

Décoloration et Eclaircissement.

Pour les règles générales à ce sujet voyez ci-dessus, n^ 163, 164.

Méthode de Flemming (Première Méthode). Alcool pur (c extraction neutre »), suivi d'essence de girofle. Les noyaux au repos sont colorés en même temps que les noyaux en kinèse.

Méthodede Flemming (DeuxièmeMéthode, « Extraction acide ») [Zeit.f, wiss. Mik.^ I, 3, 1884, p. 350). Décolorer, jusqu'à ce que les coupes ne cèdent presque plus de couleur, dans de l'alcool contenant 0,5 p. 100 d'acide chlorhydrique, achever la déshydratation dans l'alcool pur, puis traiter par l'essence de girofle. (On peut si on le préfère employer l'acide en solution dans l'eau.) La proportion d'acide indiquée paraît plus forte qu'il ne serait nécessaire, et en conséquence j'ai presque toujours employé une dose ne dépassant pas 0,2 p. 100;

ANAT. MICROSC. 9

et plus récemment, suivant un travail plus récent de Flemming {Arch. f, mik. Anal., XXXVII, 1891, p. 249), j'ai obtenu de bons résultats en employant une dose de 1 p. 1000 ou moins. Cette méthode suppose un matériel bien fixé dans le mélange fort de Flemming, et coloré pendant au moins plusieurs heures. Podwyssozki cependant [Zeit. f. toiss. Mik.^ III, 3, 1886, p. 40o) dit avoir réussi avec des colorations de seulement une demi-heure de durée. Cette méthode ne laisse de coloré que la chromatine en kinèse et les nucléoles plasmatiques.

La méthode à V orange de Flemming sera décrite dans le chapitre des Colorations combinées.

Une deuxième méthode de Podwyssozki {loc. cit,) consiste à décolorer (quelques secondes à deux minutes) dans une forte solution alcoolique d'acide picrique suivie d'alcool pur. Mêmes résultats, si ce n'est qu'on obtient une coloration brunâtre au lieu de rouge. Voyez plus bas les observations d'OnLMACUER au sujet de l'emploi de l'acide picrique.

Babes recommande pour les coupes colorées dans sa solution anilinée un traitement par l'iode d'après la méthode de Gram que nous décrirons au paragraphe du Violet de gentiane (n® 168). Ce procédé a aussi été recommandé par Prenant [Int, Monatsschr, f. Anat,^ etc., IV, 1887, p. 368) qui fait observer qu'en ce cas le traitement par riode doit être un peu plus long que pour les préparations au violet de gentiane, et le traitement par l'alcool un peu moins long. Mais voyez aussi Ohlmacher, ci-dessous.

Martinotti et Resegotti {Zett. /*. wiss, MiL, IV, 3, 1887, p. 328) recommandent de décolorer dans un mélange fraîchement préparé d'une partie de solution aqueuse d'acide chromique à 1 p. 1000 avec 9 parties d'alcool absolu, avec traitement subséquent par Talcool pur et Tessence de bergamotte. D'après mon expérience les résultats que donne cette méthode ne sont pas meilleurs, je pense même moins bons, que ceux que donne la décoloration dans Tacide chromique simple suivi d'alcool, d'après Bizzozero (voyez au paragraphe suivant).

Ce procédé de Bizzozero est certainement excellent. Garbini {op, cit,, V, 2, 1888, p. 170) a conseillé de déshydrater d'abord dans de l'alcool mélhylique (esprit de bois), qui ne dissout que fort peu la safranine, puis de décolorer dans un mélange de deux parties d'essence de girofle avec une partie d'essence de cèdre. Cette méthode ne m'a pas donné de bons résultais.

Il nous reste à dire deux mots sur la différenciation à l'iode ou à l'acide picrique. Il a été démontré par Ohlmacuer (Joum. Amei\ Med. Ass,, XX, n^ 5, Feb. 4, 1893, p. 111) que si des tissus colorés à la safranine sont traités ensuite par des solutions qui contiennent de l'iode ou de l'acide picrique, il s'y forme un précipité d'une substance d'un rouge foncé, de nature cristalline mais revêtant des formes lancéolées, semi-lunaires, falciformes ou navicellaires. Ce précipité se forme tant dans les tissus normaux

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que daas les tissus palhologiques, et tant dans les noyaux que dans le cytoplasme. Il se forme très facilement dans les tissus carcinomateux ; et Ohlmacher a conclu que bien des corps qui ont été décrits comme < Coccidies, Sporozoaires », ou autres « parasites » des carcinomes ne sont pas autre chose que des éléments de ce précipité. Cette critique a trait, entre autres, aux travaux de Podwyssozki et de Sawtsciienko. Si les suppositions d'OuLMACUER se vérifient, il sera nécessaire d'admettre avec lui que remploi de solutions contenant de l'iode ou de Tacide picrique après la safranine est fort sujet à cautions (voyez aussi un travail plus récent du même auteur, op. cit., June 30, 1894).

Dans des tissus fixés au liquide de Flemming, la safranine colore, outre les noyaux, les fibres élastiques, les corps cellulaires de certains épithéliums cornés, et le contenu de certaines cellules glandulaires (la mucine entre autres).

Les solutions aqueuses acidulées par Tacide acétique donnent des coloralions nucléaires progressives assez bonnes sur des tissus frais.

168. Violet de Gentiane. — Egalement une des plus importantes des couleurs d'aniline. C'est un colorant tout aussi précis que la safranine et encore plus énergique. On peut colorer dans une solution aqueuse simple, ou dans une solution alcoolique concentrée allongée de moitié d'eau (Flemming, Zellsubst,, etc., p. 384). On peut décolorer soit à l'alcool pur, soit (Flemming, Zeit. f. wiss. Mik.^ I, 1884, p. 350) à l'alcool acidifié, comme nous l'avons dit ci-dessus pour la safranine. 11 y a encore une méthode excellente en ses résultats, et très commode, due à BizzozERO (Z5i7. f, wiss, Mik., III, 1886, p. 24). — Les tissus sont fixés et durcis soit par l'alcool absolu, soit par l'acide chromique ou les mélanges chromiques de Flemming suivis d'un lavage à l'eau prolongé. Les coupes sont mises pendant cinq à dix minutes (ou plus longtemps) dans le liquide d'ËHRLiCH (violet de gentiane, 1; alcool, 15; aniline, 3; eau, 80), puis lavées rapidement dans l'alcool absolu, et portées dans une solution d'acide chromique à 1 p. 1000. On les y laisse pendant trente à quarante secondes, puis on les met, pendant trente à quarante secondes, dans de l'alcool absolu propre, où elles se décolorent en partie. Puis, pour mieux fixer . la couleur sur les figures nucléaires, on remet de nouveau les coupes pendant trente secondes dans la solution chromique et ensuite dans Talcool absolu. Au bout de trente à quarante secondes, on les met dans quelques gouttes d'essence de girofle, où elles perdent encore de leur couleur ; on enlève l'essence et on la remplace par de l'essence propre, puis on monte dans la résine damar.

Dans certains cas, surtout lorsqu'il s*agit de tissus dont les noyaux retiennent mal la couleur, on obtient de meilleurs résultats en combinant ce procédé avec celui qui a été indiqué par Gram pour la coloration de micro-organismes dans les tissus {Fortschr, d. Medicin,^ II, 1884, n<» 6 ; BriL Med. Journ,, 6 sept. 4884, p. 486 ; Journ. Roy. Mie. Soc.^ N. S., IV, 1884, p. 317), c'est-à-dire, en faisant précéder le traitement par la solution chromique par l'action d*une solution d'iode. La série des opérations est alors la suivante : 5 à 10 minutes dans le liquide d'Ëhrlich; lavage pendant 5 secondes à Talcool absolu ; 3 minutes dans la solution d*iode (iode, 1 \\ iodure de potassium, 2 ; eau, 300) ; 20 secondes dans Talcool absolu ; 30 secondes dans la solution chromique ; IS secondes dans Talcool absolu ; 30 secondes dans la solution chromique pour la deuxième fois; 30 secondes dans Talcool absolu ; deux lavages successifs dans l'essence de girofle; résine damar.

La deuxième méthode s'emploie surtout pour les tissus dont les noyaux se décolorent facilement (foie, glandes salivaires, reins, pancréas). Dans les préparations bien réussies, le protoplasma cellulaire est incolore ; dans les noyaux au repos, les nucléoles seuls sont faiblement colorés; les mitoses sont d'un violet intense, presque brun.

NissEN {Arch. f. mik, Anat.^ 1886, p. 338) a modifié cette méthode en supprimant le traitement par Tacide chromique.

Nous avons déjà fait observer que le violet de gentiane donne des colorations extrêmement énergiques et d'une nature opaque. Il en résulte qu'il convient mieux pour des coupes très minces que pour celles qui ne le sont pas. La coloration se conserve bien dans le baume ; mais j'engage à laisser les préparations le moins possible à la lumière.

Les solutions aqueuses acidulées par l'acide acétique (à 1 p. 100 par exemple) sont des colorants nucléaires progressifs pour le tissu frais. La couleur dissoute dans un liquide < indifférent * est une des plus utiles pour les soi-disant c colorations vitales ». Pour l'emploi de cette couleur en combinaison avec d'autres, voyez au chapitre des Colorations combinées.

169. Dahlia (Flembong, Arch. f. mik. Anat., XIX, 1881, p. 317). — Colorer dans une solution aqueuse, soit neutre, soit acidifiée par l'acide acétique, et décolorer à l'alcool pur. La coloration de la chromatine est bonne, mais moins forte qu'avec la gentiane ou la safranine. Les granulations cytoplasmiques de certaines cellules sont nettement colorées.

Pour les tissus frais^ on peut selon Ehruch [Arch. f. mik. Anal. y XIII, 1876, p. 263) employer le dahlia de deux manières. On peut

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SAPRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLÉAIRES 133

colorer dans une solution aqueuse neutre qui donne une coloration uniforme de tous les éléments, excepté des noyaux ; en traitant alors les préparations par Teau acidulée avec de Tacide acétique, la couleur se retire des tissus et se localise dans les noyaux. Ou bien on peut obtenir la coloration directe des noyaux en employant une solution concentrée de dalhia dans de Teaa acidulée avec 7,8 p. 100 d'acide acétique.

Pour la coloration spécifique des cellules à granulations (Plasmazellen) d'EuRLiCH, voyez à la deuxième partie.

Le dahlia sert très bien pour les colorations « vitales » comme nous l'avons dit ci-dessus pour le violet de gentiane.

170. Bleu Victoria (Lustgarten Med, Jahrb. k. Ges, d. Aerzte zu Wien, 1886, p. 285-91). — Colorer dans une solution concentrée dans Teau. Le matériel fortement fixé dans le liquide de Flemming demandera plusieurs heures, du matériel légèrement fixé seulement quelques minutes. Décolorer à Talcool pur (environ une minute). On peut éclaircir à Tessence de girofle, mais il vaut en général mieux prendre l'essence de cèdre ou de bergamote, car Tessence de girofle extrait la couleur très rapidement. La couleur est peu résistante à Talcool. J'ai trouvé que la résistance en est beaucoup augmentée si l'on mordance les coupes avant coloration en les traitant pendant un quart d'heure par la teinture d'iode. La décoloration à l'acide chlorhydrique est absolument à éviter.

Le bleu Victoria est un colorant nucléaire brillant et précis, et après le mordançage par l'iode très facile à contrôler. Il me semble qu'il est souvent à préférer au violet de gentiane comme donnant des colorations moins opaques.

Dans ces préparations la mucine est colorée au même titre que la chromatine.

Cette couleur a une affinité spécifique pour les fibres élastiques. Pour les difl^érencier il est nécessaire d'employer du matériel fixé dans un liquide chromique ou chromo-osmique, et de colorer très longtemps. LusTGARTEN recommande à cet effet une solution alcoolique allongée de deux à quatre volumes d'eau.

171. Méthode au Permanganate (Hh^nneguy, Journ. de VAnat. etde la PhysioL, XXVII, 1891, p. 397). — Il a été établi par Henneguy que le permanganate de potasse agit comme mordant pour plusieurs couleurs d'aniline, et permet de réaliser de bonnes colorations dans des cas où les procédés ordinaires échouent.

iVt CHAPITBE X

On emploie da matériel Gxé aa liqaide de Flexuccg fort, qu'on ne làh^.e ajdr que quelques heures Tdeux à six heures selon les dimenhions de Tobjel^. Les coupes, collées sur porte-objets par Falbumine de Mayer, sont traitées pendant cinq minutes par une solution de permanganate de potasse à 1 p. iOO. On lave à Teau et Ton passe au bain de teinture dans la safranine, rubine, violet de gentiane, vésuvine, etc.

La couleur qui réussit le mieux est la safranine préparée avec de l*eau d*aniline et de Talcool absolu.

Les coupes doivent séjourner dans la solution colorante un temps environ moitié moindre que si elles n'avaient pas été au préalable traitées par le permanganate. La préparation se termine à la manière ordinaire au moyen de l'alcool absolu et de Tessence de girofle.

La décoloration est la partie la plus délicate de la méthode, aussi est-il nécessaire d'en suivre les progrès sous le microscope. Elle marche en général assez lentement, et la coloration sera d'autant plus élective que la décoloration aura duré plus longtemps. Celle-ci continue quelquefois lorsque les coupes sont montées dans le baume, surtout s'il reste sous la lamelle des traces d'essence de girofle. Des préparations qui, au moment où elles étaient montées dans le baume, étaient trop fortement colorées ont présenté souvent, vingt-quatre et quarante-huit heures après, une coloration élective parfaite.

Le protoplasma présente une teinte gris orangé, qui met en relief les structures les plus délicates, entre autres les figures achromatiques de la cytodiérèse ; les chromosomes et la membrane des noyaux sont vivement colorés en rouge, les sphères attractives et leurs corps centraux sont colorés moins fortement, mais tranchent nettement sur le reste du protoplasma.

Si l'on désire accentuer davaatage le détail des structures protoplasmiqucs, on peut, avant le trailcment par le permanganate, colorer pendant dix minutes par une solution alcoolique d'hématoxyline (alcool à 90 p. 100, 100 grammes; hématoxyline, 5 centigrammes), laver à l'eau, et diflférencier pendant dix minutes dans une solution de bichromate de potasse à 2 p. tOO. Mais avec du matériel préparé au liquide de Flemroing ce traitement peut être supprimé sans trop d'inconvénient.

La méthode au permanganate donne aussi de bons résultats pour les piiVes qui ont été fixées par un autre réactif que le liquide de Flemming, tel que le sublimé, les hquidcs de Perenyi et de Kleinenberg, l'alcool, etc.

L'action mordançante du permanganate est tellement énergique que si elle se prolonge un peu trop longtemps avant la coloration par la safranine et surtout par la rubine, il devient à peu près impossible de décolorer convonahlemonl les coupos; on nV arrive qu*en les laissant pendant près d'un mois dans Tessence de girofle.

SAFRANINE ET AUTRES COLORANTS NUCLEAIRES

171 bis, Mordançage par la Formaline. — Oulmacrer [Médical News ^ Feb. 16, 1895) a trouvé que la formaline est un mordant énergique pour les couleurs d'aniline, si énergique qu'employée avec la safranine elle en fait un colorant plasmatique semblable à Téosine (solution saturée de safranine 0 de Grûbler dans de la formaline a 4 p. 100). On peut employer la formaline soit combinée à la teinture, comme dans cet exemple, soit en traitement séparé précédant la teinture. H suffît d'un traitement pendant très peu de temps (une minute pour des préparations sur verre à couvrir) par une solution de formaline de !2 à 4 p. 100 pour mordancer des cellules isolées, avant coloration. Pour la combiner à la teinture, il convient en général de faire la solution de la couleur dans de la formaline à 4 p. 100. Ainsi, 1 gramme de bleu de méthylène dissous dans 100 ce. de solution aqueuse de formaline à 4 p. 100. Il suffit d'y colorer pendant une demi- minute, de laver à Talcool absolu, d'éclaircir au xylol et de monter au baume, pour avoir une coloration nucléaire très précise sans danger d'une décoloration excessive dans l'alcool • On peut employer de la même manière la fuchsine, le violet de gentiane et le violet de méthyle. Ces trois couleurs peuvent être ajoutées à la formaline sous forme de solution concentrée dans l'alcool.

Je pense qu'OuLMACUBR entend parler de la formaline pure. J'ai trouvé que combinée à l'acide chromique, au chlorure de platine, etc., en guise de liquide fixateur, elle n'a pas cet effet : au contraire, le matériel se colore fort lentement.

171 ter. Mordançage au Tannin et Tartre stibié. — Rawitz (Sitzb, Ges, Naturf, Freunde Berlin^ 1894, p. 174; Zeit. /*. toiss. Mik,^ XI, 4, 1895, p. 503 ; et Leiifaden f. histiologische U7itersih chungen, lena, 1895, p. 76) a pu employer la safranine et la fuchsine comme colorants plasmatiqices de la manière suivante. Les coupes c/e matériel fixé par le mélange de Flemming ou par uu autre mélange chromique sont mises pendant vingt-quatre heures dans une solution faite à froidy de tannin à 20 p. iOO dans l'eau, puis lavées et mises pour deux à trois heures dans une solution de tartre stibié à 1 p. 100, ou 2,5 p. 100, maintenue à une température d*environ 37° C, ou bien pour vingt-quatre heures à la température normale, puis lavées soigneusement et colorées pendant vingt-quatre heures dans la safranine, la fuchsine, le violet de méthyle, le violet de gentiane, ou le vert émeraude, puis décolorées selon la manière usuelle dans l'alcool, ou bien décolorées par un traitement de deux à vingt-quatre heures dans une solution de tannin à 2,5 p. 100.

Ce procédé produit, d'après Ra.witz, une inversion de la coloration : au lieu de la coloration nucléaire que donnent normalement les anilines en question employées sans mordant, on aurait une coloration purement plasmatique. D'après Rawitz, les centrosomes et sphères attractives sont démontrées avec une netteté que cet auteur n'a obtenue par aucune autre méthode. Les fuseaux karyokinétiques sont colorés, dit-il, mais pas les chromosomes; ceux-ci ont, selon lui, une teinte brune qui est à attribuer au tannin ou à Tacide chromique.

Du matériel fixé dans d'autres liquides que ceux que nous avons indiqués ne donnerait pas, d'après Rawitz, la réaction en question, mais donnerait une coloration diffuse.

J'ai essayé ce procédé plusieurs fois, avec la safranine, avec du matériel fixé au mélange de Flemming, et aussi avec du matériel fixé au mélange de Hermann, et en pratiquant la décoloration tantôt dans l'alcool pur, tantôt dans la solution de tannin. Je n'ai jamais vu la moindre trace de 1' t inversion » de coloration décrite par Rawitz. J'ai eu au contraire des colorations nucléaires très énergiques, très brillantes et très précises. La seule différence essentielle que montrent mes préparations d'avec les préparations ordinaires, c'est que, outre la coloration de la chromatine, il y a une coloration plasmatique dans un autre ton. La chromatine, soit au repos soit en kinèse, est d'un rouge vif (excepté dans les couches superficielles, où l'action de l'osmium s'est fait trop sentir ; là, elle est d'un ton plus sombre.) Le cytoplasme est brunâtre, son élément plaslinien très bien différencié. Les fuseaux sont colorés en général d'un gris brunâtre, quelquefois d'un rouge assez vif. Les Nebenkerne et les vestiges fusoriaux sont brun foncé, très bien démontrés. Je ne puis m'expliquer la différence entre les résultats de Rawitz et les miens qu'en supposant que cet auteur a travaillé avec une marque de safranine bien différente de la mienne. En tout cas, les résultats sont beaux et le procédé peut être recommandé, surtout aux anatomistes qui ont affaire à un matériel qui retient mal la couleur. Le mordançage est si énergique que la couleur résiste à l'alcool pendant des heures.