C. Acide osmique

226. Acide osmique et pyrogallol (Lee, La Cellule, IV, 1, p. 110;puis,la/'*ii^rf. dece/rût7é, 1887,p. 140).— -J'ai appelé l'attention, dans les endroits cités, sur le fait que la réaction, bien connue des chimistes, du pyrogallol sur l'acide osmique se réalise au sein des tissus. J!avais en effet trouvé c que les tissus traités par l'acide osmique prennent instantanément une coloration noir d'encre si on les traite par une solution même faible d'acide pyrogallique >. Ce

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procédé donne des résultats qui peuvent être occasionnellement utiles. Mais, comme je l'ai expliqué plus tard {Zett. f.wiss. Mik,^ IX, 2, 1892, p. 185) la réaction est en général beaucoup trop énergique et donne des colorations excessives qui manquent d'électivité.

Je n'avais essayé la réaction que sur des tissus traités par Tacide osmique pur. Plus tard, Hermann (Arch, f.mik. i4wa^, XXXVII, 4,1891, p. 570) Ta essayée avec des tissus fixés par son mélange platino-acétoosmique. Avec cetle modification on obtient des résultats incomparablement meilleurs, comme je puis en témoigner. Je ne pense cependant pas que le procédé particulier de Hermann soit le meilleur possible. Hermann fixe pendant un à deux jours dans le mélange, lave beaucoup à Teau et durcit ensuite dans des alcools successivement plus forts ; après quoi, pour obtenir la réaction noire, il met les pièces pour douze à dix-huit heures dans de Tacide pyroligneux brut. (Cet acide doit être brut, brun foncé et malodore (Hermann, dans Anat. Ergeh.^ II, 1893, p. 28).

J'ai trouvé que Ton peut employer indifféremment le mélange de Hërmamn ou le mélange de Flemming. On peut fixer pendant douze à vingt-quatre heures si cela est indiqué dans Tintérét de la fixation ; mais dans l'intérêt seul de la coloration une demi-heure suffit et est même préférable. Il est inutile ou même nuisible de traiter par l'alcool. Au point de vue de la coloration, on peut employer pour produire la réaction colorée (il n'y a pas de motif pour admettre que ce soit une c production >) soit l'acide pyroligneux de Hermann, soit une faible solution de pyrogallol. Il me semble que celui-ci vaut mieux; la différentiation est peut-être plus fine ,et la conservation des pièces me paraît meilleure. Je crois en effet avoir bien remarqué que la conservation des pièces traitées par l'acide pyroligneux laisse à désirer. On peut traiter par l'un ou l'autre de ces liquides pendant vingt-quatre heures, mais une seule heure ou moins pour de petites pièces doit suffire. On pçut employer une solution alcoolique de pyrogallol, ce qui peut être utile dans certains cas.

On obtient une réaction semblable avec une solution de tanin.

La méthode ainsi modifiée est importante. On obtient une coloration noire qui différencie suffisamment les éléments des noyaux pour qu'on puisse à la rigueur se dispenser de recourir à une coloration séparée de la chromatine, et qui en même temps différencie assez bien les éléments plasmatiques. C'est une des meilleures méthodes que je connaisse pour mettre en évidence les Nebenkern des cellules spermatiques. Elle donne parfois chez des Invertébrés de jolies différentiations du système nerveux. C'est une méthode très commode^

et, si Ton fait usage de pyrogallol, très sûre (avec l'acide pyroligneux, moins sûre). Mais ce n'est pas une méthode absolument sans défauts, la coloration plasmatique qu'elle donne n*étant pas sans laisser à désirer. En effet, elle colore, souvent assez fortement, Tenchylème protoplasmatique en même temps que le reticulum plastinien, ce qui nuit à la netteté des images. Et il y a des éléments de la cellule pour lesquels elle napas d'affinité bien marquée, le fuseau entre autres, comme je Tai déjà fait observer [La Cellule, XI, 1, 1895, p. 31).

Quoiqu'à la rigueur cette méthode dispense de l'emploi d'une deuxième coloration pour mettre les noyaux mieux en évidence, on peut cependant y recourir. J'ai trouvé fort avantageux de colorer les coupes ensuite par la safranine (colorer très fortement, vingt-quatre heures au moins).

La méthode a été attribuée à voq Mahrenthal. Les communications de KOLOSSOVV [Zeit. f. wiss, Mik,, IX, I, 1892, p. 38, et IX, 3, 1893, p. 316) me paraissent être à côté de la question.

D'après Azoulay [Anat, Anz., X, I, 1894, p. 25) on peut par une modification de celle méthode obtenir une coloration spécifique de nerfs à myéUne.

227. Osmium et aoide oxalique (Broesicke, Centralbl. f, d, med. Wiss. y 1878, n® 46, p. 833 ; nous citons d'après Gierke dans Zeil. /". wiss. Mik.j I, p. 408). — On traite des tissus frais pendant une heure avec une solution d'acide osmique à 1 p. 100. On les lave soigneusement et on les met pendant vingt-quatre heures dans une solution de 1 partie d'acide oxalique pour 15 parties d'eau. Par ce procédé, on obtient de bonnes différenciations de tissus ; la plupart des tissus se colorent en un rouge transparent assez beau^ chaque tissu en une nuance particulière; les noyaux, étant plus foncés que le reste, sont bien mis en évidence.

II faut avoir soin d'arrêter l'action de l'acide osmique avant qu'il ait pu noircir les tissus, car, en ce cas, l'acide oxalique n'a plus le pouvoir de les rougir. Cette méthode m'a donné pour certains sujets d'assez bons résultats, mais elle ne vaut pas le procédé au pyrogallol.

d. Autres méthodes^

228. Perohlorure de fer (Polaillon, Journ. de VAnaL et PhysioL, III, 1866, p. 43). — Le perchlorure de fer produit par imprégnation des colorations fort utilisables. La méthode consiste à imbiber les objets par une solution de perchlorure de fer, et à les mettre ensuite dans une solution faible d'acide tannique, gallique ou pyrogallique, jusqu'à ce qu'ils soient suffisamment noircis.

Les IIOGGAN (Journ. Quekett Club, 1876; Journ. Roy. Mie. Soc., II, 1879, p. 358) fixent d'abord par le nitrate d'argent à 0,5 p. 100, qu'ils laissent un peu réduire, puis ils déshydratent les tissus par l'alcool et les traitent pendant quelques minutes avec une solution de perchlorure de fer dans l'alcool. Ensuite ils les traitent pendant quelques minutes (s'il s'agit de membranes

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minces) avec une solution à 2 p. 100 d'acide pyrogallique dans l'aloool. Ce procédé, très facile, est excellent pour les membranes minces.

Bleu de Prusse (Leber, Arch. /*. Ophlalm., XIV, p. 300; Ranvier, Traité, p. 108). — Sulfate de cuivre. Leber (loc, cit,), — Gliromate de plomb, Leber (loc. cit.)- — Sulfures (Landois, Centralbl. /*. d. med. Wiss,, 1865, no 55 ; Gierke, ZeiL wiss, MiL, 1, 1884, p. 497). — Molybdate d'ammonium (Merkel, Krause), voyez Gierke, Zeit, /*. wiss. Mik., I, p. 96.) — Oxyohlorure de ruthénium (Nicolle et Cantazucene, Ann, InsL Pasteur, VII, 1893, p. 331).

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Googh

229. — On peut distinguer deux groupes de colorations combinées :

Dans Tun, on combine des colorants ayant des affinités différentes pour les diverses sortes de tissus qui existent dans la préparation à colorer, sans se préoccuper de Télectivité de ces colorants vis-à-vis des éléments des tissus, c'est-à-dire vis-à-vis des noyaux, du cytoplasma ou de la substance différenciée des éléments. C'est ainsi qu'on a recommandé une combinaison d'acide picrique et de carmin d'indigo, deux colorants qui manquent absolument l'un et l'autre de toute électivité vis-à-vis des noyaux, mais qui, employés en combinaison, montrent une électivité assez marquée vis-à-vis des tissus, le bleu de Tindigo se portant sur les épithéliums, et le jaune de l'acide picrique se localisant de préférence dans le tissu conjonctif.

Dans l'autre groupe de colorations combinées, on ajoute à une coloration élective pour les noyaux d'une préparation, une ou plusieurs autres agissant sur les éléments extra-nucléaires, éléments qu'il est quelquefois fort important de colorer d'une couleur faisant contraste avec celle des noyaux. Comme exemple typique de ce genre de coloration, nous citerons la double coloration par le carmin boracique et le carmin d'indigo ou le bleu d'aniline.

Avant de donner les formules, nous désirons dire un mot de l'emploi, d'une manière générale, de l'Acide picrique dans les colorations combinées. Flemming a fait observer avec raison que l'acide picrique peut être employé utilement et très facilement pour obtenir de doubles colorations avec le carmin ou l'hématoxyline. La technique est des plus simples ; elle consiste tout simplement à ajouter de l'acide picrique aux alcools employés pour la déshydratation des objets déjà colorés par le carmin ou l'hématoxyline. On peut employer

toutes les teintures ordinaires de carmin ou d'iiématoxyline, sans crainte de voir s'altérer la coloration des noyaux, car même la coloration délicate que donne le carmin à Talun n*est pas altérée par le traitement par Tacide picrique (Flemming, Zeit. f. wiss. Mik,^ 1, 1884, p. 360). Mais voyez n« 195.