Imprégnation des animaux marins par Targent. — A

cause de la quantité considérable de chlorures qui baignent les tissus des animaux marins, on ne peut pas les traiter directement par le nitrate d'argent.

Hertwig {Jen, Zeitsch.^ XIV, 1880, p. 324) recommande de les fixer d'abord par Tacide osmique en solution faible, puis de laver à Teau distillée jusqu'à ce que l'eau de lavage ne donne plus qu'un précipité insignifiant avec la solution de nitrate d'argent, enfin de les traiter pendant six minutes avec une solution de nitrate d'argent à 1 p. 100.

Ransom a proposé l'emploi, au lieu d'eau distillée, d'une solution d'un sel neutre qui ne se précipite pas par le nitrate d'argent, et qui soit de la même densité que l'eau de mer.

Harmer {Afitth. Zool. Slat. Neapel, V, 1884, p. 44-56) a mis à profit ce conseil pour l'élude du Loxosoma et de la Pedicellina. Ces animaux peuvent vivre pendant une demi-heure dans une solution de 5 p. 100 de nitrate de potasse dans l'eau distillée. Par ce moyen, il est facile de les débarrasser de la majeure partie de leurs chlorures, et il ne reste qu'à les transporter directement dans une solution de nitrate d'argent. Cette méthode donne de bons résultats avec l'épiderme des Méduses, des Hydraires, de la Sagitla^ et des Appendiculaires. VosMAER a pu par ce moyen mettre en évidence répithélium de la Chondrosia et de la Thenea, épithélium que Sollas n'avait pas pu apercevoir ; et Meyer a obtenu de bons résultats avec des Annélides et des œufs de Téléostéens. Peu d'animaux résistent aussi bien que les Loxosoma et Pedicellina à l'action du nitrate de potasse, mais ils y meurent au bout de quelques minutes. Cependant leurs tissus y éprouvent peu de changement, et fournissent en général de bonnes imprégnations. Harmer pense que pources animaux on pourrait substituer d'autres sels au nitrate de potasse ; il conseille une solution à 4,5 p. 100 de sulfate de soude.

214. Coloration double des tissus imprégnés, par teinture ou imprégnation. — Des tissus convenablement imprégnés par l'argent peuvent être utilement traités par la suite par Tun ou par Tautre des colorants des noyaux. On peut employer à cet eflet le carmin ou l'hématoxyline ou n^importe quelle teinture, à condition d'éviter les solutions contenant de l'ammoniaque libre, qui redissoudrait le dépôt d'argent. Et il faut observer que la coloration des noyaux ne peut avoir lieu que pour lesimprégna-

^■Tl" **'■

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lions négatives bien réussies, c'est-à-dire celles qui ont ménagé les noyaux ; les noyaux qui ont été imprégnés par un métal ne se colorant plus dans les teintures.

On peut aussi faire suivre l'imprégnation à Targent par Timprégnation à For. En ce cas, Tor parait en général se substituer à l'argent dans les tissus ; les résultats sont très précis, mais ne produisent pas TefTet d'une coloratioD double.

215. Imprégnation de tissus nerveux durcis. — Les importantes méthodes de Golgi et autres pour les imprégnations au chromate d'argent, etc., seront exposées dans la Deuxième Partie.

v, B. Or

216. Caractères des Imprégnations par l'Or. — Le chlorure d'or est un réactif qui diffère du nitrate d'argent en ce qu'il ne fournit guère que des imprégnations positives. Il ne produit, à ce que nous croyons, des images négatives que quand on le fait agir sur des tissus ayant déjà reçu l'imprégnation négative par l'argent auquel il se substitue. Pour obtenir ces imprégnations, on imprègne à l'argent, très légèrement, on réduit, on traite les préparations pendant quelques minutes avec une solution de chlorure d'or à 0,8 p. 400, et on fait la réduction dans l'eau distillée acidulée.

L'emploi du chlorure d*or est indispensable dans maintes recherches sur les organes nerveux, sur les tissus conjonctifs et sur la cornée. Il faut reconnaître que pour tous ces objets il est capable de donner des préparations qui ne peuvent pas être surpassées pour la clarté et la beauté. Mais les résultats qu'il donne sont toujours sujets à beaucoup d'incertitude ; la même méthode, ponctuellement suivie, avec le même objet, donne souvent des résultats différents. L'imbibilion des tissus, les effets chimiques qui s'ensuivent, la réduction du métal, sont tous autant de processus au sujet desquels il règne une grande obscurité, et qui sont éminemment variables. De sorte que les préparations qui paraissent le mieux réussies ne méritent pas même une confiance absolue, et il est urgent de contrôler par des préparations, faites par d'autres méthodes, les images souvent trop séduisantes et trop belles qu'elles fournissent.

C'est surtout pour le tissu nerveux que le chlorure d'or déploie une électivilé remarquable, qui en fait un réactif précieux pour l'étude de la structure et de la distribution des nerfs et de leurs organes terminaux.

Les procédés très nombreux qui sont employés pour l'imprégnation par l'or peuvent se (Jiviser en deux groupes : l'un, s'appliquant à

l'étude des nerfs périphériques et de leurs organes terminaux, est caractérisé par remploi de tissus frais ou ayant subi un traitement spécial par des acides organiques ; — et Tautre, s'appliquant à l'étude du système nerveux central, est caractérisé par remploi de tissus durcis selon les méthodes usuelles. L'exposition de ce dernier groupe de procédés trouvera sa place indiquée dans la Deuxième Partie. Le détail en grande partie des procédés du premier groupe y trouvera également sa place naturelle : et ici nous ne ferons qu'exposer d'une façon un peu généralisée les principes de Tart d'imprégnation des tissus frais.

217. Solutions & employer. — L'imprégnation se fait en général au moyen de solutions de culorure d'or simple, aux titres que nous indiquons dans les paragraphes spéciaux. Selon quelques auteurs, il y aurait utilité à employer, au lieu du chlorure d'or simple, les sels doubles : chlorure d'or et de potassium, de sodium ou de cadmium. L'avantage de ces sels consisterait en ce qu'ils sont plus neutres, que leurs solutions sont plus stables, et que le commerce en fournit plus facilement des échantillons de composition définie. On les emploie aux mêmes doses et de la même manière que le sel simple. Voici une indication se rapportant à celte question que nous avons trouvée dans un auteur des plus compétents à l'égard de la chimie des réactifs histologiques (Squire, Methods and formulœ, etc., p. 43) :

€ Le chlorure d'or du commerce n'est pas le chlorure pur. Au Cl'^ mais le chlorure double cristallisé d'or et de sodium, contenant 50 p. 100 d'or métallique. »

€ Le chlorure double d'or et de sodium du commerce est le chlorure double sus-dit mêlé à un poids égal de chlorure de sodium, et contient 25 p. 100 d'or métallique. »

Conservation des solutions. — Nous rappelons ce qui a été dit à ce sujet au n® 208. L. Johnson écrit en outre qu'il est bon de prendre aussi les précautions suivantes : — Les tissus doivent être bien lavés à l'eau distillée ; la solution, après insolation, doit être soigneusement acidifiée par addition d'un acétate ou formiate neutre, ou d'acide acétique ou formique ; et après imprégnation, les tissus doivent être lavés jusqu'à ce qu'ils ne donnent plus de réaction au papier de tournesol.

218. État des tissus & imprégner — La règle classique est que, surtout pour des recherches sur des terminaisons nerveuses, les tissus doivent être aussi frais que possible. Cependant^ Drascu (cité

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d'après Zeit. f. wiss. Mik.^ IV, 4, 1887, p. 492) trouve qu'on obtient de meilleurs résultats avec des tissus qui ont été gardés, en un endroit frais, pendant douze, vingt-quatre, ou même quarante-huit heures après la mort. Il soupçonne même qu'une principale fonction de l'acide organique des procédés qui s'inspirent de la méthode de Lowit est d'amener arlîQciellement les tissus à un certain état dans lequel ils se trouvent naturellement à un moment donné des processus post mortem, état dans lequel les nerfs auraient acquis une susceptibilité spéciale à s'imprégner de l'or.

219. Méthode de Gohnheim — L'archétype des procédés qui consistent à faire agir une solution de chlorure d'or directement sur des tissus frais se trouve dans la méthode classique de CouNifiiu {Virchow's Archiv,, XXXVIII, 1866, p. 346-349; Strickers Handb., p. 1100). Des fragments de tissu frais sont mis pendant quelques minutes, c'est-à-dire jusqu'à ce qu'ils deviennent franchement jaunes — dans une solution à 0,5 p. 100 de chlorure d'or, puis ils sont exposés à la lumière dans de l'eau acidulée par l'acide acétique, jusqu'à réduction de l'or, ce qui arrive plus ou moins vite, au plus tard au bout de quelques jours. Cette méthode donne des imprégnations positives des cellules de divers tissus qui sont souvent extrêmement belles, mais d'une électivité peu prononcée, et les résultats sont très variables.

220. Méthode de Lôwit. — Le besoin s'étant fait sentir, surtout dans les recherches sur les terminaisons nerveuses, de faciliter la pénétration et la réduction de l'or, Lôwit imagina la méthode de traitement par les acides qui est connue sous son nom, et qui est l'archétype des méthodes employées pour l'aurification des terminaisons nerveuses. Elle consiste en des manipulations dont le procédé suivant peut servir de type. Des fragments frais sont traités par l'acide formique (1 volume de l'acide, d'une densité de 1.12, avec 1 vol. d'eau) jusqu'à ce que, en se gonflant, ils soient devenus transparents. Gela arrive en quelques secondes ou en quelques minutes, selon la grosseur des objets, qui doivent être toujours aussi petits que possible. Par ce traitement, la pénétration de l'or est rendue plus facile, et les tissus sont devenus plus propres à le réduire. On les met alors pendant une quinzaine de minutes dans une solution de chlorure d'or à 1 ou 1,S p. 100, qui doit être tenue à Tobscurité. Puis on les met pendant vingt-quatre heures dans de l'acide formique dilué (1 partie d'acide pour 1 à 3 parties d'eau), puis pendant vingt-quatre heures encore dans de l'acide formique concentré, ces deux traitements se

faisant également dans Tobscurité. On fait des coupés, s'il y a lieu, et Ton monte dans le damar ou la glycérine. {Wien. Sitzber., LXXI Bd., III Abth., 1875, p. 1 ; Arch. f. mik. AnaL, XII, 1875, p. 366.) Les préparations ainsi faites doivent, si elles sont bien réussies, montrer les nerfs seuls imprégnés, au sein des tissus demeurés incolores. Mais, malgré toutes les précautions, on ne peut nullement être certain d'obtenir constamment ce résultat.

1221. Méthode de Viallanes. — Des modiOcations ont été apportées de part et d'autre aux détails du procédé de Lœwit. On a diminué la concentration de la solution d'or. Tandis que Lœwit employait une solution à 1 p. 100, concentration qui est encore généralement employée, quelques naturalistes ont recours, ce nous semble avec raison, à des solutions beaucoup plus diluées. Ainsi Viallanes {Histologie et dév, des Insectes^ 4883, p. 42) s'est servi, pour des tissus d'insectes, du procédé suivant. Les tissus sont fixés par l'acide osmique à 1 p. 100, qu'on laisse agir jusqu'à ce qu'ils commencent à brunir. Puis ils sont mis pendant dix minutes dans un mélange de 1 partie d'acide formique et 3 parties d'eau. On les met alors pendant vingtquatre heures dans une solution de chlorure d'or à 1 p. 5000 ou même beaucoup plus étendue, qu'on a soin de tenir à l'obscurité. On réduit à la lumière dans de l'acide formique au quart. Nous voyons dans ce procédé que nous avons employé et qui nous a donné de très bons résultats, une modification du procédé classique qui nous parait excellente pour certains objets qui ne demandent pas à être spécialement gonflés par un acide pour faciliter la pénétration du sel d'or.

222. Méthodes de Ranvier. — Ranvier (Quart, Jouim, mie. Se, 1880, p. 456) fait l'imprégnation dans un mélange de 4 parties de solution de chlorure d'or à 1 p. 100 et 1 partie d'acide formique, qu'on a fait bouillir ensemble. 11 paraît que le chlorure acquiert, par l'ébuUition avec l'acide formique, une plus grande tendance à se réduire dans les tissus et une électivité plus marquée vis-à-vis des tissus nerveux. Notons ici, en passant, que, pour l'étude des terminaisons nerveuses, Ranvier a substitué le jus de citron frais à l'acide formique employé par Lôvit pour gonfler les tissus; il est moins nuisible aux terminaisons nerveuses que ne l'est Tacide formique. Nous donnons les détails de ces deux méthodes dans la Deuxième Partie. — Nkrfs intra-épidkrmiques et Gornéb.

223. Méthodes pour faciliter la réduction. — Une autre sorte de modiflcation qui a été apportée aux procédés de Gohnheim et de Lôvvit consiste dans la mise en œuvre de manipulations propres à faciliter la réduction de l'or et à la rendre aussi complète que pos* sible.

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Ainsi Bastian a modifié le procédé de Cohnheim en employant une solution de chlorure d'or à 1 p. 2000 acidulée par THCl (1 goutte par 75 ce), et en faisant la réduction dans un mélange à parties égales d'acide formique et d'eau, maintenu au chaud. Tous ces détails sont de nature à favoriser la réduction.

Hénocque {Àrch. de VAnat, et de la PhysioL,, 1870, p. 111) imprègne dans une solution de chlorure d'or à 0,5 p. 100, puis lave à l'eau pendant douze à vingt-quatre heures, et réduit à chaud dans une solution presque saturée d'acide tartrique. (La solution d'acide tartrique doit être contenue dans un flacon bien bouché. La meilleure température pour la réduction est de 40 à 50 degrés. La réduction se fait rapidement, souvent en un quart d'heure.)

HoYER {Arch. f. mik. Anal. y IX, 1873, p. î222) ajoute à de l'eau distillée une à deux gouttes par once d'un révélateur photographique au pyrogallol. Ou bien il emploie l'acide tartrique et l'éluve.

Nestekoffsey traite les préparations imprégnées par une goutte de sulfhydrate d'ammoniaque, et achève la réduction dans la glycérine {voyez GiERKE. Faerb&rei zu mik. Zwecken).

Flechsig {Die Leitungsbahnen im Gehim, etc., 1876 ; Arch. f. Anat. u. Phys., 1884, p. 453) emploie pour la réduction une solution de soude caustique à 10 p. 100.

BoEHM préfère réduire dans la solution de Pritcqard, qui se compose de 1 partie d'alcool amylique, 1 partie d'acide formique et 98 parties d'eau ; il faut pour cela dix-huit heures dans l'obscurité. (Voyez Carrière, Arch. f. mik. Anat.y XXI, 1882, p. 146.)

Manfredi {Archimo per le Scienze mediche, V, n® 15) met les tissus après imprégnation (par une solution d'or à 1 p. 100) dans une solution d'acide oxalique à 0,5 p. 100, et les y chaufi*e à 36** sur un bainmarie, puis laisse refroidir et monte à la glycérine. (Gela se fait à la lumière, et il est nécessaire d'opérer par un temps clair.)

Manfredi emploie également pour la réduction, qui doit se faire au soleil, une solution d'acide arsénique à 1 p. 100, qu'il renouvelle à mesure qu'elle brunit.

BoccARDi {Journ. Roy. Mie. Soc, 1888, p. 155) prend de l'acide oxalique de 0.1 à 0.25 ou 0.3 p. 100, ou bien un mélange de 5 ce. d'acide formique, 1 ce. d'acide oxalique à 1 p. 100, et 25 ce. d'eau, et il y réduit à l'obscurité pendant pas plus de deux à quatre heures.

KoLossow {Zeit. f. wiss. Mik., V, 1, 1888, p. 52) réduit pendant deux ou trois jours à l'obscurité dans une solution d'acide chromique à 0,01 ou 0,02 p. 100.

Geberg {Intem. Monatsschr., X, 1893, p. 205) prétend que le traite-

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ment préalable des tissus frais pendant vingUquatre heures par l'eau de chaux (méthode d'ARNSTEiN, n^ 620) facilite beaucoup la réduction. Bernheim {Arch. f. Anat. u. Phys., Phys. Abth 1892, Supp.^ p. 29 ; ZeiL f. wiss. 3fik., X, 4, 1893, p. 484) ajoute à Tacide formique allongé de Lôwit un morceau de sulfite de soude (il doit être frais et sentir fortement Tacide sulfureux).

224. Traitement ultérieur des préparations imprégnées par For. — Il n'arrive que trop souvent que les préparations noircissent à la suite d'une imprégnation excessive. On peut les décolorer par le cyanure ou le ferrocyanure de potassium. Redding emploie une solution faible de ferrocyanure ; Gybulskv, une solution de cyanure de potassium à 0,5 p. 100.

On peut empêcher, du moins en une certaine mesure, le noircissement des préparations, en les mettant pendant quelques jours dans Talcool, qui a la propriété d'arrêter la réduction de l'or (Ranvier).

Les tissus imprégnés peuvent être colorés après coup par les teintures usuelles, mais il est à remarquer qu'on n'obtiendra la coloration des noyaux par le carmin qu'à condition d'employer une imprégnation négative, les éléments qui ont été imprégnés par le métal ne se colorant plus par le carmin. Les anilines peuvent rendre ici des services (safranine, vert de mélhyle, vert d'iode).

Les préparations peuvent être montées dans la glycérine acidulée avec 1 p. 100 d'acide formique, ou dans le baume de Canada. Théoriquement, elles devraient être permanentes si la réduction de l'or a été effectuée d'une manière complète ; dans la pratique, on constate que leur durée n'excède guère quelques mois.

225. Imprégnation d'animauzniarins. — Pourun motif qu'on n*a pas pu expliquer, les tissus des animaux marins ne prennent pas bien l'imprégnalion à Ter dans Tétat frais. Fol dit que l'on peut réussir mieux avec du matériel alcoolique.