METHODES D INCLUSION

Fautre de ces instruments coupent les masses tendres comme le coUodiou tout aussi bien que la paraffine ; ce sont même à peu près les meilleurs instruments qui existent pour cette fln. Avec la parai'flne, ils fournissent un travail assez bon, mais qui ne saurait être comparé pour la finesse et la régularité à celui des microtomes de Cambridge, de Minot ou de Reinhold- Giltay. Dans celui de Thoma ou de Becker, le couteau est mobile, il n'est maintenu qu'à l'une de ses extrémités, et il n'est pas assujetti sur le fond de la rainure dans laquelle il glisse. Ce dispositif lui permet de céder, d'une quantité minime il est vrai^ mais c'est toujours trop, à l'instant où son tranchant rencontre l'objet à couper. Il ne le fait pas toujours à un degré perceptible, mais il le fait souvent, surtout si l'objet est un peu dur ; d'où une irrégularité quelquefois fort désagréable dans l'épaisseur des coupes. Dans les instruments que nous allons maintenant mentionner, cet inconvénient n'existe pas ou existe à un degré moindre ; car, dans ces modèles, le couteau est immobile et solidement assujetti à ses deux extrémités.

Dans ces modèles, nous recommandons en premier lieu pour la plupart des recherches qui demandent la préparation de séries de coupes à la paraffine, le nouveau microtome à bascule vendu par la « Cambridge Scientific instrument Company >, sous le nom de Rocking Microtome, (Ce microtome est aussi construit en France par Dumaige, 2i-, rue Saint-Merri.) Ce microtome fournit avec une grande facilité des séries de coupes d'une admirable régularité, et se prête mieux que le microtome Thoma à la production rapide de coupes enchaînées ou de rubans de coupes collées ensemble, sujet sur lequel nous reviendrons tout à l'heure, mais il n'offre pas de dispositions aussi heureuses pour l'orientation exacte d'objets très petits. Cet inconvénient se trouve en partie écarté parles perfectionnements apportés à la construction du porte-objet par Henneguv et Vignal (Comptes rendus de la Soc, de Biologie, 1885, p. 647). Ce raicrotome ne s'applique du reste guère qu'à la confection de séries de coupes par la méthode de la paraffine, et n'est pas à recommander pour les coupes qui doivent se faire par la voie humide avec un rasoir mouillé, comme pour le procédé au coUodion.

Ensuite les beaux instruments de Minot et de Reinhold-Giltay. Dans ceux-ci comme dans le Cambridge Rocker, le couteau est fixe et le porteobjet mobile, mais celui-ci a un mouvement vertical produit par un mécanisme semblable à celui d'une machine à coudre. L'un et l'autre sont des instruments dune grande beauté, et très pratiques. Le Minot est fabrique par E. Zimmermann, 10, Albert-Strasse, Leipzig, au prix de 175 m. {220 francs). On en trouvera une description dans le Joum. Roy, Mie, Soc, 1889, p. 143. Le Reinhold-Giltay ressemble essentiellement au Minot, mais possède des perfectionnements dans le détail mécanique qui le rendent plus précis et moins délicat. Je n'ai pas eu l'occasion de travailler moi-même avec cet instrument, mais je l'ai vu à l'œuvre, et je puis affirmer que je lui ai vu débiter un bloc de paraffine de plus d'un centimètre de côté en un ruban de coupes à un micron d'épaisseur, et cela avec un rasoir ordinaire. Les coupes étaient toutes parfaites si ce n'est que quelques-unes étaient un peu tassées. C'est de bien loin ce que j'ai vu de plus beau en fait de micro tomes. Il y a aussi un dispositif pour permettre de couper les masses au collodion, etc. Cet instrument est fabriqué par J. W. Giliay à Delft, et coûte, je crois, environ 500 francs. On en trouvera une description dans Zeit, f. wiss, Mik., IX, 4, 1893, p. 415, et dans Joum, Roy, Mie. Soc, 1893, p. 700.

261. Les manipulations de Finclusion. — Avant de décrire en détail les plus importantes des méthodes d'inclusion, nous dirons quelques mots des procédés opératoires généraux de l'inclusion, c'està-dire des manipulations employées pour introduire l'objet dans la masse liquide d'inclusion de telle sorte que la masse devenue solide se présente sous la forme d'un bloc commode à couper et emprisonnant l'objet dans l'orientation voulue.

a. On peut faire l'inclusion dans une capsule ou dans un verre de montre, quitte à découper ensuite dans la masse solide un bloc contenant l'objet et ayant les dimensions voulues. Si l'on s'est servi d'une masse liquide à chaud, solide à froid, telle que la paraffine, on peut le plus généralement la retirer en totalité en chauffant légèrement le fond de la capsule ou du verre de montre de manière à fondre la ijouche inférieure de la masse, ce qui permet de détacher en bloc le reste de la masse.

Si l'on désire procéder de cette manière, il est bon, selon certains anatomistes, d'enduire le récipient, d'avance, avec de la glycérine. On y verse une goutte de glycérine, qu'on étale et qu'on essuie ensuite avec un linge jusqu'à ce qu'il n'en reste que des traces à peine perceptibles. J'ai toujours trouvé que pour la paraffine cette précaution n'est nullement nécessaire ; il est même rarement nécessaire de chauffer le fond du récipient, la paraffine se détache d'habitude parfaitement bien sans cela.

b. Les petils objets se laissent parfaitement bien enrober et orienter dans les masses telles que la paraffine sans aucun appareil. On pratique dans un bloc de paraffine une cavité assez grande pour recevoir l'objet, et on l'y place dans la position désirée. Il n'y a plus qu'à promener une aiguille chauffée le long des marges de la cavité pour que la paraffine fondue vienne entourer l'objet et achever l'inclusion sans déranger l'orientation de l'objet. Nous engageons vivement le lecteur à ne pas mépriser cette méthode si simple, car il est des cas où elle rend des services que ne rend aucune autre méthode. Lorsqu'on a affaire à des objets si petits qu'on ne peut distinguer leur position qu'à Taide d'une forte loupe, il est essentiel de savoir manier l'aiguille chauffée sous le microscope à dissection et même sur le porte-objet du microtome ^

c. D'après une méthode qui est très répandue, et qui est excel-

t Dans The Microlomisl's Vade Mecum^ 1885, p. 172, nous avons appelé celle méthode du nom de Kisgsley. Nous pensons maintenant qu'il convient de l'al- 'rjbner à Born. Voyez Die PlatlenmodeUinnelhode^ dans Arch, f. mik. Anat,^ 1883,

Googh

3IÉTH0DES d'inclusion

lente, l'inclusion se fait dans de petites boîtes de papier, de carton ou de papier de plomb. On construit facilement ces boîtes de la manière suivante : on prend un morceau de papier ou de carton ayant approxi-

Fig. i.

Fig.

Fig. 3.

mativement la forme du dessin ci-contre (fig. 1.) ; les vieilles cartes correspondance peuvent bien servir. On le plie selon les lignes aa' et bb', puis selon ce' et dd', toujours vers le même côté. Puis on fait les plis AA', BB', CC, et DD' qui sont également des plis faits vers le même côté ; on les obtient en appliquant Ac contre Aa et en pinçant le long de la ligne AA', et ainsi de suite pour les autres angles. Gela

donne une botte incomplète avec des oreillettes aux angles ; pour la compléter, on retourne les oreillettes en dehors, et on les applique contre les petits côtés de la boite ; pour les assujettir dans cette position et achever la boite, il n'y a plus qu'à rabattre en dehors, et pincer, contre les petits côtés, les bouts débordants, c'est-à-dire, tout ce qui est en dehors des lignes A' B' et G' D'.

Les boîtes ainsi construites se laissent facilement défaire sans se briser, pour mettre à nu le bloc de masse d'enrobage solidifié, et peuvent servir à plusieurs inclusions; celles qui ont servi sont souvent meilleures que les neuves.

d. Une autre sorte de boîte très commode se fait en entourant un bouchon d'une collerette de papier tenue en place par une épingle. La collerette se fait d'une bande de papier dont on fait passer plusieurs tours autour du bouchon, qu'elle déborde de la hauteur voulue (Og. 2).

Pour faire l'inclusion dans ces boîtes, on peut ou bien y placer d'abord l'objet et le maintenir dans une position voulue au moyen d'épingles, après quoi on verse la masse liquide qu'on laisse solidifier avant de retirer les épingles ; ou bien, on verse dans la boite un peu de masse qu'on laisse devenir assez solide pour que l'objet ne s'y enfonce pas trop, on pose l'objet sur cette couche, et l'on verse le reste de la masse.

e. Leuckart, de son côté, fait usage de boites métalliques à parois mobiles. Elles sont composées de deux pièces métalliques (le mieux en laiton, et creuses pour ne pas absorber trop de chaleur) ayant la forme qu'on leur voit sur la figure 3. Pour faire une boîte avec ces formes, on les enduit de glycérine et on les pose sur une plaque de verre également enduite de glycérine, en les rapprochant de manière à former un rectangle de la superficie voulue. Il est évident qu'on peut varier à volonté la longueur de la boîte avec la même paire de formes, mais, pour varier la hauteur de la boîte, il faut employer d'autres formes. Pour faire l'inclusion dans ces boîtes, on chauffe tout l'appareil, verre et pièces métalliques, on place l'objet, on verse la masse fondue, puis, avec une aiguille chauffée, on donne à l'objet la position voulue, on laisse refroidir, et, après refroidissement, on n'a plus qu'à écarter les parois de la boîte pour obtenir un moule englobant l'objet et prêt à être coupé.

Cette méthode est surtout utile parce qu'elle donne un moyen assez commode A'orienter de petits objets, même sous le microscope à dissection, la masse à inclusion étant facilement maintenue à l'état liquide par le chauffage ; on peut chauffer l'appareil de temps à autre

MÉTHODES d'inclusion 199

avec la flamme d*une lampe à alcool, ou bien employer uq dispositif permettant de le chauffer par la circulation d'un courant d'eau chaude, comme dans les formes connues de platines chauffantes.

/*. Selenka a décrit et figuré un appareil très simple visant au même but. C'est un tube de verre à travers lequel on fait passer un courant d'eau chaude, une dépression centrale servant à recevoir la paraffine (voyez description et figures dans le Zool. Anzeig,^ 1885, p. 419). Une modification de cette méthode a été décrite par Andrews dans Amei\ NaturaL, 1887, p. 101 (Cf. ZeiL f. tciss. Mik., IV, 3, 1887, p. 375).

Nous décrirons plus loin des procédés d'orientation s'appliquant spécialement à la méthode de la paraffine et à la méthode du collodion respectivement.

262. Choix d'une méthode. — Nous avons déjà fait entendre plus d'une fois que parmi les nombreuses méthodes d'inclusion qui ont été imaginées il y en a deux qui sont d'une importance capitale, la méthode de la paraffine, et celle du collodion. Les avis sont encore partagés sur la valeur respective de ces deux méthodes.

Il nous parait évident que chacune de ces méthodes a ses qualités, et les défauts de ses qualités. Le collodion ne fournit pas avec de petits objets des coupes aussi minces, et cela de bien loin, que celles qu'on peut obtenir avec la paraffine. 11 est difficile avec le collodion d'obtenir des coupes de moins de 7 microns d'épaisseur; tandis qu'avec la paraffine on en fait de 1 micron. Il est donc obligatoire de prendre la paraffine pour tout travail qui demande des coupes très minces. Et Ton peut dire que de nos jours c'est un cas qui se présente très souvent. D'un autre côté, la paraffine ne fournit des coupes très minces qu'avec de petits objets ; avec de gros objets, ceux de plus de 15 millimètres de côté, il est difficile d'obtenir des coupes plus fines qu'avec le collodion ; les coupes faites dans de grands blocs de paraffine ayant une tendance à se fendre ou à se tasser. Pour de grands objets donc le collodion donne de meilleurs résultats.

Quelques auteurs croient que le collodion est plus inoffensif envers les tissus que la paraffine. Après bien des comparaisons je n'ai pas pu établir une différence sensible à cet égard.

Nous pensons donc qu'il faut admettre que la méthode de la paraffine est la méthode générale, et que le collodion doit être réservé pour les gros objets et pour certains cas spéciaux. On n'emploiera les masses aqueuses, telles que la gomme ou la gélatine, que pour des cas tout à fait spéciaux.

INCLUSION A LA PARAFFINE ET MASSES SEMBLABLES (savon, gélatine)

263. Pénétration des objets. — Le premier stade du procédé de la paraffine consiste dans la pénétration des objets par un dissolvant de la paraffine. C'est une partie très importante de la manipulation et qui demande à être faite avec beaucoup de soin. On fait en sorte que la pénétration soit graduelle, ou bien en mettant le liquide de pénétration sous Talcool qui contient les objets, de la manière que nous avons expliquée au numéro 6, ou bien en passant les objets par des mélanges successifs d'alcool et de liquide de pénétration renfermant des proportions de plus en plus fortes de ce dernier. Il va sans dire qu'on ne doit opérer qu'avec des objets très scrupuleusement déshydratés. .

Le choix d'un liquide de pénétration convenable est chose très importante. On emploie l'essence de térébenthine, l'essence de girofle, la créosote, la benzine, le xylol, le toluol (ou toluène), le naphte, l'essence de bois de cèdre, le chloroforme et d'autres. Ces liquides ont tous des propriétés qui les rendent plus ou moins propres à la pénétration, selon la nature des objets avec lesquels on les emploie.

La térébenthine pénètre bien et se mêle facilement à la paraffine, deux qualités importantes. De plus, elle ne rend pas les objets cassants, ce qui est une qualité précieuse. Mais ce réactif a le défaut, qui nous paraît très grand, d'altérer, peut-être à un plus haut degré qu'aucun autre, la structure des éléments délicats. Nous pensons qu'il doit être évité toutes les fois qu'on désire bien conserver la structure des cellules.

L'essence de girofle pénètre très énergiquement, et conserve bien la structure des cellules ; mais elle a deux défauts : elle a une grande

tendance à rendre les tissus cassants, et elle se mêle très lentement à la paraffine, ce qui nécessite des bains de paraffine très prolongés. Pour éviter cet inconvénient, Fol a recommandé de pénétrer d'abord par Tessence de girofle et ensuite par la térébenthine ; par ce moyen on arrive sans doute à pénétrer rapidement leé objets et par l'essence et par la paraffine, mais il ne nous semble pas qu'on écarte Faction nuisible de la térébenthine que nous avons reprochée à ce réactif.

Nous n'avons pas d'expériences personnelles sur la créosote, la benzine et le xylol. La benzine a été récemment recommandée par Brass (Zeit. f, wiss. Mik,, II, 1885, p. 301). D'après M. Heidenhain (Kern und Proioplasma^ p. 114), le xylol serait très nuisible aux cellules ; il emploie l'essence de bergamote.

Le toluène a été préconisé par Holl {ZooL Anzeig., 1885, p. 223). HoLL trouve que ce liquide est très pénétrant. Selon Holl, il n y aurait pas nécessité de rendre la pénétration graduelle en mettant le toluène sous Talcool, ou en passant par des mélanges de toluène et d'alcool ; et il n'y aurait pas nécessité non plus de rendre graduelle la pénétration par la paraffine; il met les objets pénétrés directement dans un bain de paraffine pure.

Le naphte a été recommandé par Webster {Joum. of Anal, and Phys,, XXV, 1891, p. 278). Pour les objets volumineux ce corps a l'avantage d'être très peu coûteux. L'auteur nous écrit que le naphte ordinaire du commerce suffit en général, mais que pour des travaux délicats la marque Persian naphtha (naphte de Perse) serait à préférer. FiELD et Martin (Zeit. /". wiss. Mik,, XI, I, 1894, p. 10) recommandent un pétrole volatil, Petroleum-aether.

Le chloroforme possède de bonnes qualités ; il se mêle assez facilement à la paraffine, et après évaporation graduelle par la chaleur du bain de paraffine, il laisse après lui une paraffine très homogène et ayant très peu de tendance à cristalliser. Il a deux défauts qui deviennent très sérieux pour le cas de certains objets : il est si peu pénétrant que des objets volumineux ou peu perméables ne se laissent pénétrer qu'après un temps considérable, quelquefois même pas du tout; puis il est nécessaire de l'éloigner ensuite très scrupuleusement des objets, soit par la chaleur, soit en changeant la paraffine, car la présence d'une trace même de chloroforme dans la paraffine suffit pour rendre la masse molle et impropre à fournir de bonnes coupes. Et cela demande beaucoup de temps : pour des objets volumineux jusqu'à deux jours ou plus. Le chloroforme doit donc être réservé pour les objets petits et perméables, pour lesquels on le trouvera en maintes occasions très commode.

On a aussi recommandé Thuile d'aniline (voyez au chapitre des Agents éclaircissants).

L'Essence de bois de cèdre (À. Bolles Lëe, ZooL Anz., 1885, p. 563) réunit à un haut degré les bonnes qualités de tous ces éclaircissants. Elle pénètre avec non moins d'énergie que Tessence de girofle ; elle conserve admirablement les caractères les plus délicats des cellules ; elle se mêle facilement à la parafflne ; et elle ne rend pas les tissus cassants, même après un séjour prolongé. Depuis que nous avons appris à connaître les propriétés de cette essence, nous l'employons à litre de liquide normal de pénétration pour les inclusions, et nous la recommandons particulièrement pour cet usage. Les cas pour lesquels on doit lui préférer le chloroforme sont rares. C'est toujours l'essence épaissie que j'emploie.

264. Bain de parafflne. — Les objets ayant été dûment pénétrés par un dissolvant de la paraffine, il s'agit maintenant de remplacer graduellement ce dissolvant par la paraffine fondue. Ce remplacement graduel peut se faire de deux manières, selon qu'il s'agit d'un dissolvant volatil comme le chloroforme, ou d'un dissolvant qui ne l'est pas, comme l'essence de cèdre.

Dans l'emploi de l'essence de cèdre ou de térébenthine ou d'un autre liquide non volatil, voici comment on procède d'habitude. Les objets sont mis dans un mélange de paraffine et d'essence fondant à une température peu élevée, par exemple 38** G., et on les laisse dans ce mélange, maintenu à la température voulue à l'aide d'un bainmarie ou d'une étuve à température constante, jusqu'à ce qu'ils en soient pénétrés. On peut déjà porter la température de ce bain préliminaire à celle du point de fusion de la paraffine choisie pour la masse d'inclusion définitive, mais on fera bien de ne pas dépasser cette limite. Un mélange convenable pour ce premier bain peut se faire avec des parties égales d'essence et de paraffine dure, c'est-àdire fondant à 50** environ. Ou bien, on peut suivre la pratique de quelques naturalistes qui emploient non un mélange de paraffine avec un dissolvant, mais une paraffine pure fondant à une température suffisamment basse. On trouve maintenant dans le commerce des paraffines fondante 36" C. Lorsqu'on croit que les objets sont dûment saturés de ce mélange, ou de paraffine molle, on les porte dans la masse définitive dont on veut se servir pour les coupes, et on les y laisse, à la température de fusion de la masse, jusqu'à ce qu'ils en soient parfaitement pénétrés. Il est quelquefois nécessaire de leur donner un troisième bain de paraffine pure pour enlever

jusqu'aux dernières traces du liquide de pénétration. Ces opérations accomplies, on verse les objets et la masse dans une boite d'inclusion, et Ton y oriente l'objet dans la position voulue, ou bien on laisse refroidir le tout dans le récipient qui a servi au dernier bain.

Nous aurons à revenir sur cette partie de la manipulation.

La durée de ces bains doit nécessairement varier selon la nature de l'objet et son volume. Un embryon de la grosseur d'un pois doit être parfaitement pénétré par un séjour de trente minutes dans le mélange et d'une heure dans la parafQne pure fondant & 4S^ G., du moins si Ton emploie l'essence de cèdre.

Je dois dire ici que toute cette pratique de bains successifs de mélanges d'essence et de paraffine me parait élre en général superflue. Avec l'essence de cèdre en tout cas, aucun mélange n'est nécessaire, et l'on peut porter directement dans la paraffine fondue. La pratique de bains successifs de paraffine molle et de paraffine dure me paraît entièrement illusoire.

Si l'on emploie le chloroforme, on peut également suivre la marche que nous venons de décrire, si on le désire. Ainsi, on peut employer avec BûTScuLi, un bain préliminaire d'un mélange à parties égales de paraffine dure et de chloroforme, mélange fondant à 35<> environ, suivi d'un bain de paraffine pure. Mais il vaut mieux profiter de la volatilité du chloroforme, et employer la méthode élégante de Gies- BRECHT et de BuTscHLi (Zool. Anzeig.j 1881, p. 484; Biol. Centralbl., 1881, p. 591). Les objets, ayant été soigneusement déshydratés par l'alcool absolu, sont pénétrés de chloroforme, auquel on peut ajouter en cas de nécessité un peu d'éther sulfurique pour les empêcher de flotter. On chauffe le tout au bain-marie et Ton ajoute au chloroforme par intervalles de petits morceaux de paraffine. A mesure que la paraffine fond, on en ajoute et l'on continue à le faire aussi longtemps que des bulles de vapeur se dégagent des objets. Lorsque les bulles ne se forment plus, on peut élre sûr que les objets sont pénétrés de paraffine. Il ne reste plus qu'à chasser le chloroforme, ce qu'on fait en continuant à chauffer, à la température de fusion de la paraffine, jusqu'à ce que tout le chloroforme soit entièrement volatilisé. Il est urgent que le chloroforme soit entièrement chassé, car, s'il en reste une trace dans la paraffine, celle-ci reste si molle qu'il est impossible d'en obtenir de bonnes coupes. Pour savoir si tout le chloroforme est volatilisé, il suffit de plonger une aiguille chauffée dans la masse; elle ne doit pas provoquer un dégagement de bulles.

L'évaporation du chloroforme est une opération souvent très longue ; avec des objets un peu volumineux elle exige des jours

entiers. C'est pour ce motif, entre autres, que nous pensons que la méthode du chloroforme n'est indiquée que pour les objets très petits.

265. Etuves et bains-marié. — Il est important que la paraffîne ne soit pas exposée à une atmosphère humide pendant qu'elle est à Tétat liquide. Si donc on fait usage d*un bain-marie pour les inclusions, celui-ci doit être agencé de manière à ne pas exposer la paraffine à la vapeur d*eau. Un modèle très commode est celui de Paul Mayer, dont on trouvera une description dans Joum. Roy. Mie, Soc.,, ^883, p. 146.

On peut se le procurer pour un prix peu élevé en s'adressant à la direction de la Station zoologique de Naples, ou à la Maison Paul Rousseau, 24, rue des Fossés-St- Jacques, à Paris. Mais il vaut toujours mieux se servir d'une étuve. Nous recommandons particulièrement le modèle dont on trouvera une description dans le Lehrbuch de Fol, p. 121. On trouvera dans la Zeù. f. wiss. Mik. ou dans le Joum. Roy. Mie. Soc. et autres journaux techniques de ces dernières années de nombreuses descriptions d*étuves thermostatiques. La plupart de ces appareils sont construits pour le chauffage au gaz. Pour les laboratoires qui ne possèdent pas de gaz, citons l'appareil chaufTable au pétrole fabriqué par F. Santorius àGottingen {Zeit. f, xoiss. Mik., X, 2, 1893, p. 161), et celui d'ÂLTMANN {ibid., p. 221 ; Cf. Centralb. f. Bacterlol., etc., XII, 1892, p. 654), également construit pour le pétrole.

266. Inclusion dans le vide. — Il est des objets qui, soit à cause de leur grosseur, soit à cause de leur structure, ne se laissent pas pénétrer par la paraffine employée de la manière ordinaire, même après des heures ou des jours de séjour dans le bain de paraffine. Pour ces objets il convient d'employer la méthode dite c de Tinclusion dans le vide >, ou mieux c à basse pression >, méthode qui a non seulement l'avantage de garantir une pénétration complète en un temps très court, — quelques miuutes, mais aussi celle de prévenir les effondrements de tissus qui peuvent facilement avoir lieu dans l'inclusion d'objets qui possèdent des cavités internes, quand on emploie la méthode ordinaire. En principe, cette méthode consiste à faire passer l'objet dans des bains de paraffîne placés dans le vide ; on y arrive avec un dispositif quelconque permettant de maintenir la paraffine à l'étal liquide. On trouvera dans le ZooL Anzeig., 1884, p. 230, une description avec figures du dispositif employé par Hoffmann. Dans cet arrangement, le vide est produit par une pompe pneumatique aspirante à eau, les baquets contenant la paraffine étant placés dans un dessiccateur maintenu au bain-marie et percé d'une ouverture par laquelle [lasse un tube qui le met en rapport avec la pompe aspirante. Cet appareil, qui est très simple et efficace, demande cependant qu'on ait à sa disposition de l'eau sous forte pression. Pour remédier à cet inconvénient, Francoite a imaginé un dispositif très simple qui permet de produire un vide suffisant par la condensation de la vapeur d'eau. On en trouvera la description avec la figure dans le Bull. Soc. Belge Micr., p. 45.

FoL [Lelirb., p. 121) emploie la pompe aspirante à eau de la manière proposée par lloil'mann, mais il a simplifié l'appareil pour la réception de l'objet. Au lieu de mettre les objets avec la paraffine dans des baquets qu'on

INXLUSION A LA PAaAFFINE ET MASSES SEMBLABLES 205

introduit dans le dessiccateur où se fait le vide, Fol met Tobjet avec la paraffine dans un tube de verre à forte paroi, fermé par le bas {une petite éprouvette) et muni en haut d'un bouchon de caoutchouc traversé par un tube qui le met en communication avec la pompe. L'éprouvette plonge dans un récipient contenant de Teau à la température de fusion de la paraffine. On fait le vide une ou deux fois, on attend cinq à trente minutes, ou jusqu'à ce que Ton constate qu'il ne se forme plus de bulles d'air autour de l'objet ; puis on laisse entrer l'air, on jette la paraffine qui a acquis une consistance anormalement dure, et on refait l'inclusion dans de la paraffine fraîche d'après la méthode ordinaire.

Voyez aussi au besoin la méthode de Pringle, dans Journ, of Path and, BacterioL, 1892, p. 117, ou dans /owni. Jioy, Mie. Soc, 1892, p.* 803.

267. Inclusion définitive et orientation. — Aussitôt que les objets sont bien et dûment pénétrés de la paraffine, on procède à rinclusion définitive selon l'une des méthodes qui ont été exposées au numéro 261 . Si Ton a choisi le procédé du verre de montre, et si Ton a donné le bain de paraffine dans ce récipient même, il ne sera pas en général nécessaire de passer à une manipulation spéciale d'enrobage ; il n'y a plus qu'à refroidir la masse et en découper un bloc contenant l'objet.

Mais il se peut que Ton ait besoin de donner à l'objet une position déterminée et reconnaissable par la suite dans la paraffme ; en d'autres termes, il se peut qu'on ait besoin d'un procédé d'orientation. Le numéro 261 adonné des indications suffisantes pour permettre d'obtenir une orientation grossière mais généralement suffisante par la méthode des boites de carton ou par celle des boites métalliques. Voici maintenant un procédé dû à Patten {Zeit. f, wiss, Mik,^ XI, I, 1894, p. 13) qui est susceptible de plus de précision, et permet d'orienter plusieurs petits objets dans le même bloc de paraffine. A cette fin, on commence par fixer les objets en position avant de les mettre dans le bain de paraffine. On les pénètre d'abord par l'essence de bergamote ou de girofie. On se procure du papier à lettres de cette sorte qui a des côtes élevées se croisant à angle droit. Ce doit être du papier glacé; mais à défaut de papier à côtes on peut prendre du papier lisse et le régler avec un crayon tendre. On prépare maintenant un mélange dû collodion et essence de girofie, de la consistance de miel épais. On pose sur un petit rectangle du papier, une goutte de ce mélange, ou plusieurs gouttes si Ton opère avec plusieurs objets. On prend les objets, on les laisse égoutter et on les pose dans les gouttes de collodion, en donnant à chacun une position déterminée par rapport aux lignes du papier. Gela se fait au besoin sous la loupe ou même sous le microscope composé. Les objets gardent la position qu'on leur a donnée. Cette opération accomplie, on met le tout dans de l'essence de térébenthine, qui enlève l'essence de girofie et laisse les objets fixés dans le coUodion. On passe au bain de paraffine, et après inclusion et refroidissement de la manière usuelle, on découpe un bloc de paraffine comprenant le papier. Le papier se laisse maintenant enlever sans peine, laissant la face inférieure de la paraffine

gravée des lignes d'oricntatioa du papier, au-dessus desquelles se trouvent les objets dans l'orientation qu'on leur a donnée au commencement.

Une modification plus compliquée de cette méthode a été décrite par WooDWORTii, dans Contrib, from the ZooL Lab. Mus. Comp, Zool.^ Harvard, XXV, 3, 4893, p. 45.

Une méthode similaire a été décrite par Field et Martis, dans Zeit, f. W188, 3m., XI, I, 189t, p. 11.

268. Refroidissement de la masse. — La pénétration des objets par la masse d'inclusion ayant été dûment accomplie, on doit procéder au refroidissement de la masse. C'est là un point auquel les anatomistes attachent en général une grande importance. Ils admettent que la paraffine est un corps cristallisablc, et que, si on l'abandonne au refroidissement lent, il se forme très souvent des cristaux qui prennent naissance jusque dans Tintcrieur des tissus, au grand détriment des structures délicates. Il serait donc nécessaire de surveiller le refroidissement et d'empêcher qu'il n'ait lieu lentement. Je crois qu'on a un peu exagéré l'importance de cette préeaution.

Après avoir pratiqué comme les autres pendant de longues années le rite du refroidissement, j'en suis arrivé à douter de son importance et de son efficacité. J'ai eu souvent des masses excellentes après un refroidissement lent ; et j'en ai eu de mauvaises après un refroidissement conduit selon les règles. M. Lindsay Joiinson, qui a fait de nombreuses expériences comparées sur ce sujet, a eu l'obligeance de m'écrire qu'apparemment la manière du refroidissement n'est qu'une cause minime de la formation de cristaux. Celle-ci serait provoquée, selon lui, par la présence d'une petite quantité de l'essence de pénétration demeurée dans la paraffine. En tout état de cause, si l'on désire prendre toutes les précautions possibles, voici comment on peut procéder pour le refroidissement:

Si les objets sont petits, on peut les sortir de la masse fondue avec aussi peu de paraffine que possible, à l'aide d'une spatule, et les laisser refroidir sur des lames de verre ou sur la spatule elle-même, puis les ajuster avec une aiguille chauffée sur un cylindre ou sur un cône de paraffine (voyez n*' 261 (b) ; Born, Arch. fur mik. Anat., XXllI, 1883, p. §91 ; Brass, Zeil. f, wiss. Mik., II, 1885, p. 301). Pour fixer les objets sur le cône de paraffine avec l'aiguille chauffée, il est bon d'observer la précaution de ne pas employer une aiguille chauffée au delà de la température nécessaire, et de ne faire fondre que la plus petite quantité possible de paraf/lne; moins on en fait fondre à la fois et plus elle se refroidit rapidement. En pratiquant cette méthode avec adresse, on obtient des préparations imbibées et entou-

rées d'une paraffine parfailement homogène, sans cristaux et sans bulles.

Si rinclusion s'est faite dans des boites de papier, on peut les mettre refroidir sur une plaque de pierre ou de métal, ou bien (Caldwell) les mettre dans Teau froide. Il faut en ce cas commencer par tremper seulement le fond de la boite dans l'eau, et ne la submerger en entier que lorsque la paraffine est prise ; autrement on verrait se produire dans la masse des creux qui se rempliraient d'eau. Frenzel {A7'ch. f. mik. Anat., XXV, 1885, p. 142) recommande de jeter la masse entièrement dans Teau aussitôt qu'elle est suffisamment prise. Graf Spee {Zeit. f. toiss. Mik., II, 1885) fait l'inclusion de petits objets dans des verres de montre, qu'il met ensuite sur de l'eau froide. Selenka refroidit ses objets en faisant passer un courant d'eau froide à travers le tube & inclusion dont nous avons parlé ci-dessus (n® 261 (/*).

Je me trouve très bien du procédé des verres de montre ; rien de plus simple que de les faire flotter sur de l'eau froide. Pour découper ensuite le bloc voulu, il e^t bon d'employer un scalpel légèrement chauffé; avec cette précaution la paraffine a moins de tendance à se briser ou à former des fentes qui peuvent endommager les objets.

Les auteurs admettent qu'il est bon de faire les coupes aussitôt que possible après le refroidissement complet de la masse, parce que la paraffine continue à cristalliser lentement même après refroidissement ; dans les blocs de paraffine qui ont été conservés pendant des semaines ou des mois on est exposé à trouver des cristaux très volumineux. C'est fort possible qu'il en soit ainsi, mais il est certain que l'inconvénient est rarement grave. J'ai des blocs vieux de plusieurs années enrobant des préparations qui se montrent aussi bien conservées que le premier jour.

269. Mise en coupes. — Les objets ayant été enrobés par un de ces procédés, et orientés dans la position voulue, et le refroidissement ayant été obtenu par une des méthodes indiquées, doivent maintenant être examinés avec soin. 11 arrive souvent que la paraffine en se refroidissant forme autour des objets des bulles, des cavités, ou des taches opaques. On enlève les taches et l'on remplit les cavités en pratiquant avec une aiguille chauffée des piqûres autour de l'objet dans tous les endroits où la paraffine ne présente pas le degré d'homogénéité voulue ; il faut même quelquefois promener l'aiguille entièrement autour de l'objet. Aussitôt que la paraffine ainsi fondue s'est complètement refroidie, les manipulations de l'enrobage sont terminées, et Ton peut procéder h la mise en coupes.

Les coupes d'objets enrobés par Tinfiltration avec la paraffine se font à sec, c'est-à-dire avec un couteau qui n'est ni mouillé d'alcool ni d*aucun autre liquide.

Enroulement des coupes. — Les coupes faites de cette manière ont une grande tendance à s'enrouler sur la lame du couteau et à former ainsi des rouleaux qu'il est toujours difficile et souvent impossible iTétaler sans les briser. Voici quelques indications qui peuvent aider i\ parer à cet inconvénient.

Le couteau doit, autant que possible, avoir une position transver- *iale, faisant un angle droit avec la ligne de section ; caries couteaux obliques provoquent ou du moins facilitent Tenroulement.

La paraffine doit posséder un degré de dureté proportionné à la température du laboratoire. Nous avons trouvé qu'une paraffine ayant son point de fusion à 4S^ G. est celle qui convient lorsque la température du laboratoire se trouve entre 15 et 17** G. Pour une Leniprrature de 22° G. il faut une paraffine fondant à 48** G. *. Nous avons établi ces températures d'après des observations faites dans un laboratoire chauffé par une cheminée ouverte; il est possible qu'elles ne s"a[ipliquent pas parfaitement aux pièces chauffées par des poêles, qui s*jnt dans des conditions très différentes à l'égard du rayonnement de la chaleur. Et nous les avons établies d'après des expériences faites avec le microtome Thoma. Les microtomes à couteau fixe (Cambridge, Minot, etc.) permettent l'emploi d'une paraffine beaucoup plus dure. D'après notre expérience, l'emploi d'une masse tîonvenable est le plus pratique de tous les moyens qui ont été proposés pour empêcher l'enroulement des coupes.

Si, après qu'on a commencé de faire les coupes, on s'aperçoit que la masse n'a pas été convenablement choisie, on peut encore la corriger sans déranjjrerrobjet. Si la masse est trop dure, il faut placer près du microtome une lampe munie d'un réflecteur parabolique à l'aide duquel on projette sur Tobjei le:§ rayons calorifiques de la flamme de la lampe. La température convenable s'obtient en approchant ou éloignant la lampe. Si, au contraire, la masse s'est montrée trop molle, on peut la durcir en plaçant au foyer d'un iL'Ilocteur pareil un morceau de glace au lieu de source de chaleur I Fol. Lehrb., p. 123). H suffit du reste souvent de modifier la température de Tappartement en ouvrant ou en fermant une fenêtre, ou de changer la posiliori du microtome de manière à le mettre plus au frais ou plus au chaud.

' [k's parafûnes ayant approximativement ces points de fusion sont faciles à trouver dans le commerce. On peut aussi s'en procurer en combinant dans les ItraporlLons voulues une pararfine très dure et une paraffine très molle. Pour faire une masse fondant à 45" C. on peut prendre deux parties de parafline fondant :\ 00% et une partie de paraffine fondant ii 36°.

Googh

On a proposé des masses spéciales ayaat moins de tendance à s*enrouler que la paraffine pure. Ainsi, on peut ajouter à la paraffine un peu de vaseline, environ un cinquième pour la paraffine dure. Nous ne recommandons pas ce moyen.

On peut éviter renroulement en faisant les coupes en chaînes ou rubans continus. Dans ces conditions il n'y a en général que la première coupe de la chaîne qui se roule. Nous décrivons ce procédé dans le numéro suivant.

On peut empocher renroulement par des moyens mécaniques. Le plus simple, et à notre avis le meilleur, de ces moyens consiste à retenir avec une aiguille courbée, avec une languette de papier, ou, ce que nous préférons, avec un petit pinceau, le bord de la coupe qui commence à se rouler. Des appareils très ingénieux, consistant en des barres ou des rouleaux ajustés le long du tranchant du couteau, ont été proposés. Nous ne nous en servons pas et ne les recommandons pas; car outre qu'ils sont en général d'une construction compliquée et toujours difficiles à ajuster, nous leur reprochons d'aplatir et de tasser les coupes d'une manière nuisible pour les structures délicates. On trouvera la description du Schnittstrecker de F.-E, Schultze dans le Zool, Anzeig,, 1883, p. 400 ; de celui de Mayer, Andres et Gies- BRECiiT dans Mitth. a. d. Zool. StaL Neapel, IV, 1883, p. 429 ; de celui de Decker dans Arch, f. mik, Anat., XXIU, 1884, p. 637 ; de celui de Francotte dans BulL Soc. Belge de Mie, X, 1883, p. 55 ; de celui de Gage and Smith dans The Microscope, Feb. 1884, et dans WuiTMAN, Methods of research in microscopical Anatomy, 1885, p. 91 ; de celui de SxRASSERdansZetï. f. wiss. Mik., IV, 2, 1887, p. 218 ; de celui de Born, ibid., X, 2, 1893, p. 157, et dans /owrn. Roy. Mie. Soc:, 1894, p. 132. Ce dernier nous paraît peut-être le plus recommandable de tous. Un petit dispositif très simple se fait en coupant la tète à une épingle ordinaire et en fixant cette épingle au moyen de deux peCiles pelotes de cire sur la surface de la lame et parallèlement à son tranchant. On en règle l'élévation en l'enfonçant plus ou moins dans la cire (cite' (ïaprèsRef. Handbook oftheMed. Se, Supp., p. 440).

Enfin, on peut renoncer à empêcher l'enrouleracnt, et se borner à le rendre moins nuisible. A cet efi'et, on taille le bloc de paraffine contenant Tobjet en prisme à arête très aiguë, de manière à donner aux coupes la forme d'un triangle isocèle juste assez large à sa base pour contenir la section de l'objet et dont la hauteur ait au moins cinq ou six fois la longueur de la base. L'arête du prisme étant orientée vers le tranchant du couteau, on obtient des coupes enroulées dont les spires vont en s'élargissant du sommet à la base, la section

ANAT. UICROSC. 14

de l'objet se trouvant dans la dernière spire, qui est la plus ouverte. La coupe étant placée sur un porte-objet avec la dernière spire en bas, il suffît de chauffer légèrement pour que la partie contenant Tobjet se déroule complètement. On éloigne le reste de la paraffine en la faisant fondre et en ajoutant un dissolvant.

Voici un des meilleurs procédés pour dérouler les coupes (Henne- GUY, Joum. de VAnat. et de la Phys., 1891, p. 398). Après avoir étalé au pinceau une couche d*albumine de Mayer aussi mince que possible sur le porte-objet, on laisse tomber sur celui-ci quelques gouttes d'eau distillée qu'on étale avec un agitateur tenu horizontalement. Les coupes sont ensuite disposées en série à la surface de la couche d'eau. La lame de verre est portée sur la platine de l'étuve à inclusion, platine dont la température est de 45 à 50^ C. En quelques Instants les coupes se déplissent et s'étalent complètement sur le porte-objet. Celui-ci est alors placé à la partie supérieure de Tétuve, sur la lame de verre qui ferme le compartiment où sèchent le§ préparations, et dont la température ne dépasse guère 40° G. Au bout de dix minutes, un quart d'heure, toute l'eau est évaporée, et on peut alors faire fondre la parafOne et ajouter un dissolvant. Il est important que la paraffîne ne fonde pas avant que toute l'eau soit évaporée, sans quoi les coupes n'adhèrent plus au porte-objet et risquent de se déchirer.

270. Coupes en chaîne. — Rubans de coupes. — 11 arrive, dans certaines conditions, que si l'on fait une série de coupes sans enlever du couteau chaque coupe à mesure qu'elle se fait, mais en les laissant reposer sur la lame dans la position qu'elles y prennent d'elles-mêmes, on oblient une chaîne ou un ruban de coupes, chaque coupe se collant d'elle-même par ses bords antérieur et postérieur à celle qui la précède et à celle qui la suit. Des chaînes de coupes ainsi faites présentent sur les coupes isolées des avantages qui sont souvent d'une grande importance. La série se coupe beaucoup plus rapidement. Elle se laisse monter aussi beaucoup plus facilement, car pour placer la série sur le porte-objet, on n'a qu'à saisir la chaîne par un bout et la transporter intégralement sur la lame de verre. De plus, l'intégrité de la chaîne nous garantit l'intégrité de la série ; lorsque nous avons déposé sur le porte-objet une chaîne de coupes, nous pouvons être parfaitement certain qu'aucune coupe n'a été égarée, qu'aucune n'a été placée irrégulièrement, et que toutes ont gardé Tordre de succession dans lequel elles ont été coupées. Pour les travaux embryologiques, on comprend à quel point cela est un avantage précieux.

Qoo^^

Voici quelles sont, d'après notre expérience, les conditions néces saires pour la production des chaînes de coupes.

1** La paraffine doit avoir une certaine consistance, c'est-à-dire qu*il faut employer une masse d'une dureté proportionnée à la température du laboratoire. Nous n* avons rien à ajouter à ce que nous avons dit à ce sujet plus haut, numéro 269.

On a recommandé de faire rinclusion dans de la paraftine dure, d*en tailler un bloc contenant Fobjet, puis d'entourer ce bloc d*une mince couche de paraffine molle, qu*on enlève ensuite des côtés du bloc, de sorte que les coupes présentent sur leurs bords antérieur et postérieur seulement une

marge de paraffine molle plus propre à faciliter l'adhésion que ne Test la '

paraffine dure. On obtient facilement la production d'une couche de paraf- i

fine molle autour du bloc en plongeant celui-ci pendant un instant dans de |

la paraffine molle fondue.

Spee, Brass et Foettingér recommandent une préparation spéciale de la paraffine d'inclusion. Nous parlerons plus loin de ces modes de préparation. I

On a aussi proposé d'enduire d'une couche très mince de solution de baume du Canada le côté du bloc de paraffine qui est tourné vers le couteau. I

L'une et l'autre de ces méthodes peuvent être utiles, mais aucune n'est

indispensable en général.

2*^ Le bloc de paraffine doit être taillé de façon à avoir ses bords, antérieur et postérieur, parallèles au tranchant du couteau.

3^ Le couteau doit avoir une position transversale, c'est-à-dire que son tranchant doit faire angle droit avec la ligne de coupe.

iP II faut faire les coupes en succession aussi rapidement que possible, et surtout imprimer au couteau un mouvement très rapide. Pour réaliser cette condition, les microlomes de Caldwell, de la Cambridge Scientific Instrument Company, de Minot, Reinhold-Giltay, etc. , se montrent d'un grand secours, mais ils ne sont nullement obligatoires ; on se tire bien d'aiTaire avec le microtome à glissement de Thoma ou de Schanze.

271. GoUodiozmage des coapes fragiles. —Malgré les plus grandes précautions prises dans la préparation préliminaire ainsi que dans la pénétration et l'infiltration, il arrive quelquefois que l'objet à couper est devenu cassant ou même friable ; il se brise devant le rasoir, ou ne donne que des coupes si friables qu'il est impossible de les monter sans déranger les rapports de quelques-unes de leurs parties. Les œufs surtout présentent assez souvent cet inconvénient. On y remédie en enduisant la surface de l'objet avant chaque coupe d'une mince couche de collodion, qui sert d'une manière parfaitement efficace à maintenir en position les parties des coupes les plus fragiles.

On avait débuté en déposant, avant chaque coupe» sur la surface libre de Tobjet une goutte de coUodion. Cette pratique a un inconvénient : la quantité de collodîon employée ramollit la paraffine à un degré nuisible, et, de ^ plus, en séchant, donne aux coupes une tendance à s'enrouler. Voici, d'après

Mark {Amer, NaluraL, 1885, p. 628 ; Joum. Roy. mie. Soc, 1885, p. 738), comment il faut procéder :

Dans un petit flacon muni d'un pinceau qui passe à travers son bouchon et plonge, mais à une faible profondeur seulement, dans le collodion, on met un peu de collodion fluide. Le critère de la bonne consistance du collodion est que, quand on en applique une couche mince sur la paraffîne, celte couche doit sécher en deux ou trois secondes, sans laisser de vernis luisant à la surface de la parafflne. Dans cet état, le collodion parait ne pas produire de membrane à la surface de la paraffîne, et ainsi ne cause pas de tendance k s'enrouler dans les coupes ; d'autre part, il parait pénétrer la préparathDn à une certaine profondeur et en flxer les parties dans leurs positions. Pour maintenir le collodion à ce degré de consistance, on a sous la main un flacon d'éther, avec lequel on allonge le collodion aussitôt qu'il commence à laisser des traces luisantes sur la paraffîne.

Tout étant prêt pour l'opération des coupes, on retire le pinceau du flacon de collodion, on l'exprime en l'essuyant sur le goulot du flacon, de manière à l'avoir chargé seulement de peu de collodion, et, sans tarder, on enduit rapidement la surface de la préparation d'une mince couche de collodion. Il faut avoir soin de ne pas collodionner les faces verticales du bloc de paraffîne, et surtout celle qui est tournée vers l'opérateur, car si cela arrive, la coupe risque de s'attacher au couteau par ce bord et même d'être emportée et d'adhérer à la surface inférieure du couteau. Aussitôt que le collodion aura séché (nous avons dit que ce doit être en deux ou trois secondes), on fait une coupe. On retire le couteau, et, sans tarder, on passe une deuxième couche de collodion sur la surface nouvellement affranchie de la paraffîne. Pendant que cette deuxième couche sèche, on enlève du couteau la première coupe et on la porte sur un porte-objet préparé avec le fîxatif de ScïLELLiBAUM en ayant soin de l'y poser avec la surface collodionnée en dessous. Puis on fait la deuxième coupe, et on répète toute la série des opérations que nous avons décrites. Avec un peu de pratique on peut arriver à faire des coupes en chaîne, en coliodionnant chaque coupe. f^ IIenking {Zeit. f. tviss. Mik., III, 4, 1886, p. 478) reproche à ce procédé

que l'éther du collodion ramollit la paraffîne, et préfère une solution de paraffîne dans l'alcool absolu. Ou bien, pour des objets extrêmement fragiles, comme les œufs des Phalangides, une solution très claire de gomme laque dans l'alcool absolu.

Rabl [ibid., XI, 2, 1894, p. 170) emploie de la paraffîne surchauffée, maintenue à environ 100<^ G. au bain-marie. Ce procédé a aussi l'avantage d'empêcher l'enroulement des coupes.

IlEiDER (ibid.^ VIII, 4, 1892, p. 509 ; Embryonalentw. von Ifydrophilus, p. 12) emploie une solution faite en mélangeant du collodion à un volume égal de solution sirupeuse de mastic dans l'éther, et en allongeant le mélange d'éther jusqu'à ce qu'il soit parfaitement liquide.

272. Nettoyage et montage des coupes. -> Pour débarrasser les coupes de la paraffine dont elles sont infiltrées, nous avons le

choix entre de nombreux dissolvants de la paraffine. On emploie la térébenthine, la térébenthine chauiïee, la créosote, un mélange de quatre parties de térébenthine avec une partie de créosote, un mélange de térébenthine et d'essence de girofle, le naphte, le pétrole, Tessence de bergamote, Tessence de cèdre et d'autres essences, Talcool absolu chaud, la benzine, le xylol, et même (pour des coupes contenant très peu de paraffine), la solution de baume de Canada dans le xylol dont on se sert pour le montage. Personnellement, nous donnons au xylol la préférence sur tous ces dissolvants. Le naphte ne doit pas être employé pour les coupes destinées à être montées directement dans le baume, vu qu'il ne se mêle pas parfaitement avec cette substance.

Pour terminer la préparation, on chauffe le porte-objet (nous supposons qu*on y a déjà collé les coupes) au-dessus d'une petite flamme, et on le plonge aussitôt que la paraffine s'est fondue dans un tube de xylol ou autre dissolvant. Un séjour de quelques minutes ou même quelques secondes sufBra pour éloigner la paraffine par le xylol. Il n'y a plus alors qu'à ajouter une goutte de baume et un verre à couvrir.

278. Résumé de la méthode de la paraffine. — Voici un exemple d'une inclusion à la paraffine réduite à sa plus simple expression, c'est-à-dire dépouillée de tous les procédés accessoires ayant trait à l'orientation, à la collodionisation et à la sériation des coupes, etc. Déshydratez un petit objet dans l'alcool absolu. Mettez dans un petit tube bas un peu d'essence de bois de cèdre (assez pour couvrir l'objet). Versez sur l'essence une quantité pareille d'alcool absolu. Mettez l'objet dans cet alcool. Laissez-le (au mieux en bouchant le tube) jusqu'à ce qu'il soit tombé au fond de l'essence de cèdre, et que sa surface ne montre plus de couches réfringentes brillantes dues au mélange imparfait des liquides. Enlevez l'alcool avec une pipette. Faites fondre de la paraffine dans un verre de montre et mettez-y l'objet. Ayez soin que la paraffine soit de la dureté que nous avons recommandée au numéro 269. Après quelque temps, portez l'objet dans un autre verre de montre avec une nouvelle quantité de paraffine fondue. Ayez bien soin de ne pas laisser monter la température au-dessus du point de fusion de la paraffine (la paraffine surchauffée subit une élévation de son point de fusion et devient plus dure). Aussitôt que vous pensez que l'objet doit être parfaitement pénétré de paraffine pure, faites flotter le verre de montre sur de l'eau froide. Après refroidissement, découpez avec un scalpel légèrement chauffé

2i4 CHAPITRE XV

un bloc de parafQne contenant Tobjet. Avec une aiguille chauffée, fixez ce bloc sur un cône de paraffine déjà fondue dans le porte-objet du microtome. 11 n'y a plus qu'à couper. Désirez-vous avoir les coupes en ruban ? Alors taillez soigneusement le bloc de parafQne en rectangle; taillez tout près de l'objet sur trois côtés, mais laissez un petit mur de paraffine sur le quatrième. Mettez le couteau dans la position transversale. Orientez le bloc de sorte que le côté qui a le mur de paraffine soit tourné vers le tranchant du couteau et soit parallèle à lui. Coupez rapidement. Collez la série de coupes sur porte-objet par l'une des méthodes que nous donnons dans le chapitre xvii. Chauffez un instant sur la flamme. Mettez pendant cinq minutes dans un tube de xylol. Montez au baume ou passez à Talcool pour colorer ensuite.