MASSES AU SAVON

277. Inclusions au savon. — Le savon offre comme masse d'inclusion des avantages qui sont dans certains cas d'une grande importance. Le savon étant soluble dans Falcool, et contenant une proportion considérable d'eau, permet Tinclusion par infiltration d'objets qui n'ont pas été déshydratés, considération qui peut être quelquefois très importante en histologie. Les masses sont pénétrantes, elles sont parfaitement transparentes, et possèdent une consistance qui fournit de très belles coupes. Après lavage, les coupes sont dans un état avantageux pour subir le traitement par les réactifs les plus divers.

La transparence des masses au savon est d'un grand avantage pour l'orientation des objets.

Le lecteur se rappellera que toutes ces masses sont alcalines, et peuvent décolorer des tissus colorés par des teintures qui ne résistent pas aux alcalis ; pour la même raison, les lavages doivent être très soigneusement faits, autrement la conservation des tissus sera compromise. Mais c'est vraisemblablement surtout parce que le savon se prête moins bien que la paraffîne à la confection rapide de séries ininterrompues de coupes qu'il a cédé le pas à la paraffine.

278. Savon ordinaire à l'alcool (Kadyi, Zool.Anzeig,, 1879, p. 477). — On prend du savon blanc ordinaire du commerce (savon au stéarate de soude, savon animal). On le râpe; et l'on en fait dissoudre 25 grammes dans 100 ce. d'alcool à 96<3, en chauffant dans une cornue au bain-marie. On filtre, si cela parait nécessaire. Si maintenant on verse dans un verre de montre un peu de la solution, celle-ci se prendra immédiatement en une masse blanche. Cela indique que la solution ne contient pas assez d'eau ; on en ajouta par petites quantités, et après chaque addition on étudie l'effet produit, en versant une goutte de la solution dans un verre de montre. On verra la masse devenir de plus en phis transparente jusqu'à ce que, enfin, elle ne montre plus qu'une faible opalescence bleuâtre. La préparation est alors terminée.

Il n'est pas possible d'indiquer d'avance la quantité précise d'eau qu'il faut ajouter, puisque cela dépend naturellement de la proportion d'eau déjà contenue dans l'échantillon de savon employé. Nous pouvons dire que pour 120 grammes de solution de savon il faudra le plus souvent 5 à 10 grammes d'eau«

Il faut ajouter Peau avec une grande prudence ; car, si Ton en ajoute trop, la masse se solidifiera lentement ou même pas du tout. C'est lorsque la masse contient le minimum d*eau nécessaire pour la rendre transparente qu'elle possède le plus de fermeté et d'élasticité.

Outre la masse dont nous avons indiqué approximativement la composition, on peut en préparer qui contiennent 10, 20, 30, 40 p. 100, ou plus ou moins, de savon. Weisker s'est servi avec avantage d'une masse contenant des parties égales de savon et d'alcool. Une telle masse est transparente, mais jaune et huileuse, et se solidifie très lentement. Après refroidissement elle se montre cependant très ferme. Son point de fusion est assez élevé, et elle est moins pénétrante que les masses plus alcooliques. Elle rend des services pour les objets très durs, et surtout pour les structures chitineuses.

Kadyi coupe avec un rasoir mouillé d'alcool fort, ce qui a l'avantage de maintenir la lame toujours propre. Pour éloigner la masse des coupes, il les met dans de l'alcool à 96 p. 100 qui, à chaud, dissout la masse immédiatement et, à froid, après un certain temps.

279. Savon à la glycérine (Poelzam, Morph. Jahrh., 1877, p. 558 ; nous citons d'après Salensky). — On prend du savon blanc ordinaire et on le coupe en tranches minces qu'on expose au soleil jusqu'à ce qu'elles deviennent blanches. On les réduit alors en poudre et l'on ajoute de l'alcool de manière à faire une bouillie épaisse. A cette bouillie on ajoute de l'alcool et de la glycérine en des proportions telles que le mélange contienne, pour 10 parties de savon, 22 parties de glycérine et 35 parties d'alcool à 90 p. 100. On chauffe jusqu'à ce qu'on ait obtenu une solution parfaitement transparente, sirupeuse, un peu jaunâtre.

La masse s'emploie selon les méthodes connues. Pour la séparer des coupes, Salensky emploie l'eau ou l'alcool très dilué.

280. Autres masses au savon (Flemming, Arch, f. mik.Anat.y 1873, p. 123. — Pfitzer, Ber, deulsch. bot. Ges., 1887, p. 65; Journ. Roy. Mie. Soc, 1888, p. 316; Pou, Journ. de Micr., XIlï, 1889. p. 337 (alcool à 90 p. 100, 1 partie ; glycérine, 1 partie; savon à la glycérine, 1 à 2 parties). —- Chauffer ensemble la glycérine et l'alcool à 60<* ou 70*^ C, et ajouter le savon en petits morceaux.

GELATINE

281.— L'inclusion à la gélatine est une méthode qui offre l'avantage d'être applicable à des objets qui n'ont été déshydratés, voire même à des objets qui n'ont été traités que par des liquides aqueux. Elle peut donc rendre des services importants pour l'étude d'organismes délicats et très riches en eau, tels que plusieurs Cœlentérés. Le mode opératoire est le même que pour les autres masses liquides à chaud, si ce n*est que pour la gélatine les objets doivent être pénétrés par l'eau et non par l'alcool ou une essence. Après inclusion et refroidissement de la masse on peut quelquefois procéder immédiatement à l'opération des coupes; mais il est rare que la masse acquière sans autre traitement une consistance suffisante. Pour la durcir, on peut la traiter pendant dix à trente

minutes avec Talcool absolu (Kaiser), ou pendant quelques jours par Talcool à 90 p. 100 suivi d*alcool absolu (Klebs), ou par l^acidc chromique (Klebs) ; ou bien on peut la geler (Sollas). La masse se sépare des coupes par le lavage à Teau chaude.

282. Gélatine à la glycérine (Klebs, Arch. f, mik. Anat., 1869, p. 165). — Solution concentrée de colle de poisson dans Teau^ 2 parties ; glycérine, 1 partie.

283. Gélatine à la glycérine (Kaiser, Bot. Centralb., 1880, p. 25 ; Joum, Roy, Mie. Soc, 1880, p. 504). — - On fait gonfler 1 partie de gélatine française pendant deux heures dans 6 parties d'eau ; on ajoute 7 parties de glycérine, et un centième du poids du mélange diacide phénique concentré. On chauffe pendant dix à quinze minutes, en reYnuant le tout jusqu'à ce que les flocons produits par Tacide phénique aient disparu. On filtre à chaud & travers du verre pilé fin, humecté, et placé dans un entonnoir.

284. Gélatine à la glycérine (Gerlach, Unters, a, d. Anat, Inst. Erlangen, 1884 ; Jour, Boy. Mie. Soe., 1883, p. 541). — Gélatine, 40 grammes ; solution saturée d'acide arsénieux, 200 ce; glycérine, 120 ce. On clarifie la solution avec du blanc d'œuf. On peut la garder pendant des années dans un flacon bien bouché. Gerlach prépare ses objets pour l'inclusion par un bain de glycérine diluée (1 partie de glycérine pour 2 d'eau), dans lequel il les laisse jusqu'à ce qu'ils en soient parfaitement pénétrés. Il trouve avantageux d'ajouter un peu de thymol à la glycérine.

286. Gélatine à froid (Brunotti, /our». de Botan., VI, 1892, p. 194). — On fait dissoudre à l'aide de la chaleur 20 grammes de gélatine dans 200 ce. d'eau distillée, on filtre et ajoute 1 gramme de sublimé corrosif dans 30 à 40 ce. d'acide acétique cristallisable. Cette masse possède à 15^ G. la consistance d'un sirop épais. Les objets doivent être pénétrés d'abord par un mélange de 1 volume de cette masse avec 2 à .3 volumes d'eau, puis par la masse concentrée. Puis on durcit dans de l'alcool ou dans du bichromate de potasse, acide picrique, etc. On voit que ce procédé écarte entièrement l'emploi de la chaleur.

COLLODION (CELLOÏDINE), GOMME, GOMME-GOPAL, ETG.

286. Avantages de la méthode au collodion. — Les masses d'inclusion au collodion sont assez transparentes et offrent de grands avantages pour l'orientation des objets à couper. Le collodion a sur la paraffine l'avantage de ne pas être cristallisable, Timbibition peut s'opérer graduellement et sans l'aide de la chaleur; de plus, les objets, quoiqu'ils doivent être déshydratés par l'alcool absolu, n'ont pas besoin d'être traités par une essence avant Tinclusion. Il résulte de ces propriétés que le collodion est une masse éminemment favorable à la bonne conservation des structures délicates. Il a un autre avantage qui est des plus précieux pour certains cas ; on peut colorer les coupes dans les teintures histologiques ordinaires (carmin, hématoxyline, et quelques anilines, — pas toutes), sans qu'il soit nécessaire d'enlever la masse au préalable ; car le collodion ne se colore pas dans ces teintures, et ne s'oppose pas non plus à la coloration des tissus. De plus, on peut monter les coupes dans la glycérine ou dans le baume, sans enlever la masse, qui demeure parfaitement transparente et homogène, et par conséquent invisible, dans ces milieux. C'est là un avantage précieux lorsqu'il s'agit de coupes d'objets dont les parties n'ont pas de cohésion naturelle et qui se briseraient ou tomberaient en morceaux si elles n'étaient pas enrobées pendant toutes ces manipulations dans une substance protectrice. Mais la qualité la plus importante des masses au collodion est peutêtre la faculté qu'elles ont d'imbiber les pièces volumineuses. Le séjour dans les solutions de collodion étant absolument inofTensif pour les éléments les plus délicats, on peut prolonger à volonté pendant des jours ou des semaines le bain nécessaire pour infiltrer les objets, et arriver ainsi à l'inclusion d'objets qui seraient littéralement

cuits si on les chaufîait pendant le même temps dans un bain de paraffine.

Le défaut capital de cette méthode, c'est que les masses au collodion ne présentent pas une consistance permettant d'obtenir des coupes suffisamment fines pour plusieurs recherches d*anatomie et d'histologie ; la limite inférieure de l'épaisseur des coupes au collodion se trouve à 0™™,007, tandis que celle des coupes à la paraffine se trouve à 0™™,00l. Nous disons bien « la limite inférieure » et nous voulons dire qu'une méthode qui ne donne que par exception des coupes d'une finesse de 0"",007 ne répond pas à tous les besoins. Un inconvénient, c'est que c'est un procédé très long. Il faut environ trois jours pour faire à la celloïdine une inclusion qui demanderait une heure à la paraffine. II est vrai que le temps nécessaire se trouve notablement abrégé par la méthode rapide de Gilson (n® 298).

287. GoUodion, Celloïdine et Photoxyline. — La très importante méthode de l'inclusion au collodion est due à M. Duval f^Joum, de VAnt.^ 1879, p. 18§). La c celloïdine » recommandée plus tard par Merkel et ScmEFFERDECKER {Arch. f. Anat. u. Phys., 1882, p. 200), n'est autre chose qu'un collodion pharmaceutique qui présente l'avantage d'être livré sous forme de plaques solides qui sont solubles dans un mélange à parties égales d'éther et d'alcool absolu. On peut facilement en faire venir par la poste en écrivant à Wittick et Ben- KENDORF, Schering's Grtine Apotheke, 19, Ghaussée-Strasse, Berlin, N. On en trouve du reste maintenant chezGRûBLER et chez la plupart des fournisseurs de microscopie.

Dans une exposition plus récente de sa méthode {Jour, de Micr.^ 1888, p. 197), Duval enseigne que la celloïdine ne possède aucun avantage réel sur le collodion. SeniEFFERDECKER, dans un nouveau travail, Zeit. f. wiss. 3Iik,, V, 4, 1888, p. 804, déclare qu'elle lui est supérieure en bien des points. Il me semble que la celloïdine permet d'obtenir des masses plus parfaitement anhydres, et qu'elle permet de doser plus commodément la concentration des solutions. Mais pour l'un et l'autre le résultat définitif me parait être le même.

La photoxyline (Krysinsky, Virchotv's Arch., CVIII, 1887, p. 217 ; Eusse, Zeit. f. wiss. MiL, IX, 1, p. 47) est également un collodion breveté. G*est un produit sec. On se la procure aux mêmes sources que la celloïdine. D'après Busse, elle aurait Tavantage de fournir une masse qui après durcissement dans Talcool à 85 p. 100 demeure parfaitement transparente. Mais puisque par la méthode récente d'éclaircissement avant les coupes, que nous décrivons plus loin, on obtient avec la celloïdine ou le collodion ordi-

Baire des masses d'une transparence parfaite, il me semble qu'on pourra pour la plupart des travaux se passer de photoxyline.

288. Marche générale. — La marche générale diffère de celle de la méthode à la paraffine en ce que Ton ne pénètre pas par une essence avant de passer au bain d'inclusion et que la masse ne durcit pas spontanément mais demande des opérations spéciales pour lui procurer la consistance voulue. Jusqu'à ces derniers temps, on a eu l'habitude de ne procéder à l'éclaircissement qu'après la confection des coupes. Une modification récente qui me paraît être pour beaucoup d'objets un grand perfectionnement, consiste à éclaircir la masse avant de faire les coupes. Nous décrirons d'abord la marche traditionnelle telle qu'elle se pratique dans la plupart des laboratoires, et nous donnerons dans un paragraphe spécial la méthode par éclaircissement avant les coupes. J'ajoute que pour ma part cette dernière méthode est celle que je pratique et que je recommande.

289. Préparation des ol]jets. — Les objets doivent être bien déshydratés par l'alcool absolu. S'ils sont de nature à se laisser facilement pénétrer, on les transportera directement dans une solution très peu épaisse de collodion, mais, s'ils sont de nature peu perméable, on les pénétrera par l'éther, ou par un mélange d'éther et d'alcool absolu.

On peut prendre un mélange de 1 volume d'éther, ou 2 ou jusqu'à 10 volumes pour 1 d'alcool absolu ; c'est un point qui n'a pas grande importance.

290. Les bains de collodion. — Le secret du succès ici c'est de pénétrer les objets d'abord par une solution peu épaisse, ensuite par une solution très épaisse. L'emploi de la celloïdine est très commode, parce qu'il permet de titrer exactement les solutions. Suivant Apathy (Zeit. f. wiss. Mik,, VI, 2, 1889, p. 164), il est bon d'employer la celloïdine desséchée. On débite une quantité de celloïdine en tranches minces qu'on laisse sécher à l'air jusqu'à ce qu'elles soient' devenues jaunes, transparentes et d'une consistance cornée, puis on les fait dissoudre dans un mélange à parties égales d*éther et d'alcool absolu. ËLScuNiG {ibid.y X, 4, 1893, p. 443) a observé que la dissolution se fait plus vite si on laisse d'abord tremper les morceaux pendant vingt-quatre heures dans la quantité nécessaire d'alcool, et qu'on ajoute l'éther ensuite. Après essai, il me semble bien qu'il en est

ainsi. L'emploi de celloïdine séchée fournit des solutions qui sont privées de l'excès d'eau qui se trouve dans la celloïdine fraîche, et donnent après durcissement une masse plus transparente et d'une consistance meilleure.

On peut appeler c peu épaisse » une solution contenant de 4 à 6 p. 100 de celloïdine séchée, et solution c épaisse > celle qui en contient de 10 à 12 p. 100. Les proportions suivantes pour trois bains successifs ont été établies par Busse [ihid.y IX, 1, 1892, p. 47) ; — N® 1, 10 parties de celloïdine séchée, ou de photoxyline, pour 180 du mélange d'éther et alcool absolu ; n^ 2, 10 parties pour 105 du mélange ; n^ 3, 10 parties pour 80 du mélange.

Je n'emploie d'habitude que deux solutions, une faible, et une forte, correspondant à peu près au numéro 2 de Busse. Le numéro 3 de cet auteur est si épais que son emploi exige beaucoup de patience.

Les objets doivent rester dans le premier bain (dans un flacon ou autre récipient bien bouché) jusqu'à ce qu'ils soient parfaitement pénétrés. Il faut pour cela des jours, même pour de petits objets ; pour de gros objets, comme les embryons humains de six à douze semaines, il faut des semaines et même des mois. Lorsque l'objet est dûment pénétré par la solution faible on passe à la ou les solutions fortes. Quelques observateurs recommandent de ne pas sortir l'objet de la solution faible, mais de laisser celle-ci se concentrer graduellement par évaporation tout en ajoutant de temps à autre un peu de solution forte.

291. Inclusion définitive. — Si V objet est tel qu'il n'y a pas d'inconvénient à le collei^ directement sur un support adapté au porte-objet du microtome^ et si Ton n'a pas besoin de manipulations spéciales d'orientation de l'objet ni de sérialion des coupes, aucune inclusion spéciale n'est nécessaire et aussitôt que les objets sont bien pénétrés par la solution forte on peut procéder au durcisseme7xt. Pour les objets qui pour l'un ou l'autre de ces motifs demandent une inclusion afin de les avoir enrobés dans un bloc de collodion, on procède comme suit.

Les objets une fois pénétrés, on peut faire l'inclusion définitive dans des boîtes de papier, selon l'une des méthodes connues décrites numéro 261. Pour ces inclusions, les boîtes en papier rondes (fig. 2, n"^ 261) sont particulièrement recommandables, le bouchon se prêtant de la manière la plus commode à fixer l'objet dans le microtome. Avant de faire l'inclusion dans ces boîtes, il est

bon de les préparer en y versant une goutte de collodion qu'on laisse sécher complètement. Cela a pour but d*empécher que des bulles ne se dégagent du bouchon et ne viennent se loger dans la masse d'enrobage.

Les verres de montre profonds, des godets à couleurs humides pour aquarelle, etc., forment de bons moules à inclusion. Il faut veiller à ce qu'ils soient parfaitement secs.

Orientation. — Désire-t-on marquer la position de Tobjet dans la masse pour faciliter ensuite Torientation des ligaes de coupe, on peut employer la méthode d^EvcLESHEiMER (Amer, Nat\, XXVI, 1892, p. 354; Joum. Roy. Mie. 5oc. 1892, p. 563). On fait Tinclusion dans une boite métallique pareille à celles décrites au numéro 261. Les parois tant latérales que terminales de la boite sont pei*cées d'une ligne de petits trous régulièrement espacés. A travers la boite sont tendus des fils de soie qui passent dans les trous et sont assujettis sur l'extérieur delà botte au moyen d'une goutte de celloïdine. On laisse à chacun un bout libre de 4 à 5 centimètres. On trempe ces bouts libres dans une solution peu épaisse de celloïdine mêlée de noir de fumée. On pose Tobjet sur le treillis formé par les fils tendus à Tintérieur de la boite, on remplit de collodion, et Ton durcit le tout. Après durcissement, on dissout au moyen d'une goutte d'éther le collodion qui] assujettit les fils en dehors et on les tire à travers la masse. Ils laissent derrière eux une série de lignes noires servant à Torientatiou.

Apathy (Zeit. /". wiss, Mik., V, I, 1888, p. 47) conseille d'arranger les objets sur une petite plaque rectangulaire de gélatine posée sur le fond du récipient. On sort cette plaque après durcissement avec le bloc à couper, et on la coupe avec lui. Les bords de la plaque forment de bonnes lignes d'orientation.

D'après une troisième méthode, qui se laisse utiliser pour les petits objets, l'inclusion se fait dans une éprouvette. Après durcissement par le chloroforme, la masse un peu rétractée se laisse extraire de l'éprouvette à l'aide d'une brusque secousse. (Voyez au paragraphe suivant.)

Il se peut que pendant ces opérations il se soit produit des bulles dans la masse. En ce cas, avant d'aller plus loin, il convient d'exposer le tout pendant une heure ou deux, jusqu'à ce que ces bulles aient disparu, à l'action des vapeurs d'éther dans un récipient bien clos. Il faut veiller à ce que la masse ne soit pas en contact avec Téther liquide (Busse, Zeit. f. wiss. Mik., VIII, 4, 1892, p. 467).

292. Durcissement. — a) On procède d'habitude comme suit, par évaporation graduelle suivie d'un traitement par V alcool. On fait l'inclusion dans très peu de masse ; il est bon qu'il y en ait

" T'i y^nr,-' i..i"j y»! .■■■■■ imw ■jwi. nnm». ■j^jjiwni

GOLLODION, GOMME, GOMME-GOPAL, ETG. 223

juste assez pour couvrir largement Tobjet. Si Ton s*est servi d*un godet de porcelaine, on le couvre avec un verre renversé, de manière à laisser à découvert un coin ou une marge de la masse pour qu'une lente évaporation puisse avoir lieu. Si ce sont des boiles de papier, on les met sous une cloche, en faisant en sorte que celle-ci ne s'applique pas exactement sur. son support. Au bout de quelques heures, le collodion s'est durci à Textérieur et s'est un peu rétracté, de sorte que l'objet enrobé commence à être à sec. On le couvre d'une goutte de collodion, et l'on remet la préparation à couvert comme auparavant. (Si l'on a laissé trop sécher la première couche de collodion, il est bon de la mouiller avec une goutte d'éther, pour assurer que la deuxième couche adhère à la première.) Après quelques heures, on ajoute une nouvelle goutte de collodion; et l'on répète cette opération à des intervalles de quelques heures pendant deux ou trois jours, ou plus. On trouve enfin que l'objet est enrobé dans une masse d'une certaine consistance sans avoir subi de ratatinement.

Le secret de la réussite du durcissement par évaporation consiste à rendre Tévaporation très graduelle. Si les objets sont gros, il est bon de mettre la masse qui les contient sous une cloche fermant hermétiquement, et de ne soulever la cloche, pour permettre aux vapeurs d'alcool et d'éther de s'échapper, que pendant quelques secondes une ou deux fois par jour.

Nous avons souvent trouvé avantageux de durcir nos objets dans la vapeur d'alcooL A cet effet nous les mettons, après enrobage sur du liège ou dans les boîtes de papier, dans un flacon contenant assez d'alcool pour baigner à peine le fond de la masse.

Lorsque la masse a atteint une consistance telle que le bout du doigt (la pulpe, pas l'ongle) ne l'impressionne plus, on achève le durcissement en jetant le tout dans l'alcool. (On peut commencer par l'alcool, en y jetant la masse liquide, mais ce procédé donne lieu très souvent à la formation de bulles d'air.) On éloigne d'abord le papier, ou l'on sort la masse du récipient qui l'a contenue et on la porte dans une quantité considérable d'alcool (si la masse ne se laisse pas dégager au premier moment, il faut attendre qu'elle ait fait un court séjour dans Talcool). On a employé pour le durcissement des titres d'alcool très divers. On peut maintenant regarder comme établi par les expériences ad hoc de Busse {Zeit. f. wis$. Afik., IX, 1, 1892, p. 49), que l'alcool de 85 p. 100 est celui qui convient le mieux, tant sous le rapport de la transparence de la masse définitive que sous celui de sa consistance pour les coupes. C'est du reste là.

une conclusion qui se rapproche beaucoup de la pratique de la plupart des anatomistes.

Il faut de un jour à quelques semaines pour achever le durcissement.

Le récipient contenant V alcool ne doit pas être hermétiquement clos^ mais doit être au moins légèrement ouvert.

On voit que ce procédé est d'une longueur excessive. Je pense qu'il n'a de raison d'être que si, comme le prétendent quelques auteurs, les objets volumineiuv se durcissent mieux par cette méthode que par celles que nous allons maintenant exposer.

b) La méthode du durcissement par le chloroforme est due à Vial- LANES [Rech, sur VHist. et le Dév. des Insectes^ 1883, p. 129) ; c'est pour les petits objets la méthode la plus sûre, la plus rapide, et celle qui donne la meilleure consistance à la masse. Elle consiste à jeter les objets enrobés dans du chloroforme. Sous l'influence de ce réactif, le collodion se prend immédiatement en une masse suffisamment dure pour être coupée ; il n'y a plus qu'à attendre que l'action du chloroforme se soit propagée jusqu'au centre de la masse, ce qui a lieu en quelques heures ou en quelques jours, selon les cas. Si l'inclusion a été faite dans un tube, il n'y a qu'à verser sur le collodion une quantité suffisante de chloroforme ; après durcissement, la masse, un peu rétractée, se laisse facilement extraire du tube. Nous recommandons particulièrement ce procédé, qui donne des résultats bien meilleurs que l'alcool, pour les objets petits et moyens; il est moins recommandable pour les objets très volumineux, parce que le durcissement trop énergique des couches extérieures de la masse fait obstacle à la diffusion nécessaire pour que le durcissement de l'intérieur se produise. Il arrive parfois que le collodion devient opaque sous l'action du chloroforme ; en ce cas, il n'y a qu'à attendre, car il s'éclaircit toujours par la suite, après un temps plus ou moins long. Il est très important d'employer du chloroforme absolu, car celui qui contient de l'eau ne produit pas la réaction voulue. En faisant usage de la méthode d'inclusion dans un tube, il convient de retirer la masse de l'éprouvette aussitôt qu'elle est suffisamment durcie pour permettre cette manœuvre, et de la mettre dans un récipient convenable avec une quantité considérable de chloroforme, jusqu'à ce qu'on ait obtenu la consistance voulue de toute la masse.

Cette méthode est incomparablement plus rapide que celle de l'alcool, et d'après mon expérience, elle donne une consistance pour le moins aussi bonne, souvent meilleure.

Depuis quelque temps je fais mes durcissements à la vapeur de chloroforme. Pour cela il suffit de mettre la masse liquide (après en avoir éloigné les bulles, si elle en contient, par la vapeur d'éther comme nous Tavons dit plus haut) dans un dessiccateur sur le fond duquel on a versé un peu de chloroforme. L'action est très rapide, et il me semble que la transparence de la masse se maintient mieux qu'avec le chloroforme liquide et que la consistance défmitive est meilleure. Nous reviendrons sur ce sujet, numéro 297.

Florman (Zei7. f. wiss. Mik., VI, 2, 1889, p. 184) a conseillé de renoncer à tout durcissement secondaire et d'achever le durcissement en continuant soigneusement Tévaporation graduelle de la manière décrite au commencement de ce numéro, en ayant soin de dégager la masse de son récipient et de la retourner fréquemment. Je puis constater qu'on peut arriver au but par ce moyen, mais il faut les plus grandes précautions pour éviter un ratatinement nuisible.

Une pratique récente consiste à compléter le durcissement du collodion par la congélalion, A cet effet, on durcit d'abord la masse par l'alcool selon l'une des méthodes que nous avons décrites. Puis on la met dégorger pendant quelques heures dans Teau, pour enlever la majeure partie de Talcool (il n'est pas bon d'enlever l'alcool entièrement, car en ce cas la masse peut facilement acquérir par la congélation une dureté excessive). On trempe finalement la masse pendant un moment dans une solution de gomme qui sert à la faire adhérer à la platine du microtome, et l'on fait geler. A mesure qu'elles sont faites, on met les coupes dans de l'eau chaude. Si la masse est devenue d'une dureté trop grande pour fournir de bonnes coupes, on y remédie en chauffant le couteau dans de l'eau chaude.

293. Conservation des blocs. — Si l'on ne désire pas passer immédfalement à la mise en coupes, on peut conserver indéfiniment les blocs de collodion durci dans de l'alcool faible (70 p. 100). Ou bien, en les plongeant daas de la paraffine fondue (Apatuy, ZeU. f. wiss. MiLy V, 1, 1888, p. 45).

Des numéros d'ordre peuvent être écrits avec un crayon tendre sur le fond des boîtes de papier servant à l'inclusion, ou avec un crayon gras sur le fond des verres de montre. Après dégagement de la masse durcie, on trouvera l'écriture imprimée sur le collodion (Apathy, ibid,).

294. Mise en coupes. — Le collodion formant une masse très transparente, il est quelquefois difficile d'apercevoir les contours des coupes à mesure qu'on les fait, ce qui nous prive d'un secours utile pour Torientution de coupes de petits objets sur le porte-objet. Il est donc souvent bon d'employer pour l'inclusion du collodion teint (par exemple, par l'acide picrique dissous dans Talcool) assez pour que les contours des coupes puissent être aperçus.

Si les objets ont été enrobés sur du liège ou sur de la moelle de

ANAT. UICROSC. 15

sureau, il n'y a plus qu'à adapter le tout à Tétau du microtome. Si Ton a employé des boîtes de papier ou des godets de porcelaine, il faut prendre un morceau de liège ou de moelle de sureau, ou, ce qui vaut souvent mieux, de bois tendre, et le couvrir d'une couche de collodion qu'on laisse sécher. On retire la masse contenant l'objet, on la taille de manière à obtenir une surface lisse en dessous, on mouille cette surface avec une goutte d'alcool absolu, puis avec une goutte d'éther, et on l'applique fermement sur le morceau de bois tendre ou de moelle de sureau, sur lequel on a préalablement déposé au moment même une nouvelle goutte de collodion très épais. On met le tout pendant quelques heures dans l'alcool faible pour achever la réunion des pièces; ou bien dans le chloroforme, qui consolidera le joint beaucoup plus vite, quelquefois en peu de minutes.

M. LiNDSAY Johnson m'écrit qu'il trouve très commode d'employer pour cette opération un mastic fait d'environ une partie de cire avec deux parties de colophane. Il faut bien sécher le fond du bloc de collodion, chauder légèrement le porte-objet du microtome, si possible, au-dessus d'une flamme, laisser tomber dessus quelques gouttes du mastic fondu, et appliquer le bloc de collodion. L'union est parfaite en quelques secondes.

Il est un avertissement que nous croyons devoir donner. S'il s'agit d'objets volumineux et résistants, il faut bien se garder de les fixer sur un morceau de liège et de mettre celui-ci entre les mors d'une pince de microtome. Car ce liège n'est pas un corps rigide : lorsqu'on serre la pince, il se déforme, et la masse élastique de collodion qu'il porte se déforme avec lui. Nous avons vu des embryons se courber sous l'influence de la pince à tel point que les coupes obtenues étaient de véritables calottes. Si donc on se sert d'un microtome dont le porte-objet est muni d'une pince, nous recommandons de coller les objets sur un morceau de bois tendre. Le nouveau porte-objet à cylindre mobile, du microtome Thoma, n'a pas l'inconvénient dont nous parlons, et permet d'employer le liège.

Jelinek (Zext. f, wiss. MiL, XI, 2, 1894, p. 237) conseille de monter les objets sur du < stabilité >, qui est un matériel de caoutchouc employé comme isolant électrique. On en trouve des blocs convenables chez Hermann DuMLER, 25, Mariahilferstrasse^ Vienne (VI, 1).

Les coupes se font avec le rasoir oblique^ largement mouillé d'alcool (de 70 à 85^). Il est avantageux d'employer une disposition permettant de faire tomber automatiquement de l'alcool goutte à goutte sur la lame pendant toute la durée de l'opération des coupes. Il est

quelquefois nécessaire de couper entièrement sous Talcool, ce qui n'est guère praticable sans le secours d'un microtome ad hoc, tel que celui de Gudden ou celui de Malassez.

295. Traitement des coupes. — Les coupes doivent être transportées dans l'alcool (de 70 à 85 p. 100), à mesure qu'elles sont faites. On peut ensuite les traiter par les réactifs colorants ou autres, ou les monter dans la glycérine, sans qu'il soit nécessaire d'enlever la masse.

Certaines couleurs d'aniline cependant colorent fortement le collodion. Si on les emploie, il faut prendre le parti d'enlever la masse ensuite.

Pour monter dans le baume, il faut quelques précautions, si l'on ne veut pas voir se dissoudre la masse, qui remplit la fonction très utile de maintenir en place les parties détachées des préparations. Il faut déshydrater avec un alcool d'un titre qui ne doit jamais être supérieur à95^ NiKTFOROw (Zei7. f, wiss Mik,, VIII, 2, 1891, p. 189) déshydrate dans un mélange à parties égales d'alcool et de chloroforme.

Pour éclaircir ensuite les coupes, on a recommandé l'essence de bergamote, l'essence de bois de santal ou l'essence d'origan. On recommande surtout d'éviter Tessence de girofle, qui ordinairement dissout le colludion très rapidement. 11 y a cependant des échantillons d'essence de girofle qui le dissolvent très lentement et peuvent être employés. L'essence d'origan donne, selonl'échantillon qu'on emploie, des résultats très divers : tantôt elle n'éclaircit pas le collodion, et tantôt elle le dissout. On recommande de prendre ÏOleum origani Creticij et non VOL orig. Gallici, mais voyez pour cette essence au chapitre des Agents éclair cissants.

Avec l'essence de bergamote on réussit ; [mais on lui reproche de ratatiner les coupes. Minot recommande le chloroforme. L'essence de bois de cèdre a l'inconvénient d'agir très lentement, mais elle donne en déflnitive les meilleurs résultats pour celui qui a la patience de les attendre.

DuNUÂM (d'après Minot, Zeit. f. toiss. Mik.y 1886, p. 175) recommande particulièrement un mélange de 3 parties d'essence blanche de thym {white oil of thyme) avec 1 partie d'essence de girofle. Ce mélange éclaircit rapidement, et ramollit la masse juste assez pour empêcher le ratatinement qui se produit par l'emploi de l'essence de thym seule. Minot trouve que ce mélange donne de meilleurs résultats que tout autre éclaircissant, sans excepter le chloroforme.

FiSH {Amer. Mie. Soc, Proceedings, 16 th Ann. Meeting, 1893)

recommande un mélange d'essence rouge de thym, 1 partie, avec 3 parties d'huile de ricin (celte dernière est ajoutée en vue de la nature volatile de l'essence rouge de thym). Fisii explique que l'essence rouge est le produit de la première distillation de l'essence brute, l'essence blanche étant le produit d'une deuxième distillation. L'essence rouge a une réaction neutre et se dissout facilement dans l'alcool. D'après une communication récente (écrite, dont j'ai à remercier M. Fisu), on peut avec avantage substituer l'essence blanche à l'essence rouge du mélange ; cela facilite les orientations. On a recommandé l'acide phonique ; mais c'est là un réactif qui n'est pas du tout bon pour certains tissus.

Weigert {Zeit, f. wiss. Mik.^ IH, 4, 1886, p. 480) a conseillé un mélange de 3 parties de xylol avec i partie d'acide phénique anhydre. Ce mélange ne doit pas être employé après des colorations aux anilines basiques, car elle les décolore. Pour celles-ci, prendre 1 partie d'huile d'aniline à la place de l'acide phénique dans le mélange.

L'aniline seule éclaircil bien, mais elle brunit les préparations si Ton n'a pas soin de Téloigner parfaitement. On y arrive en mettant les préparations pendant vingt-quatre heures dans le chlorororme (van Gieson, Journ, Roy. Mie. Soc.^ 1887, p. 519, revue de tous ces éclaircissants).

La créosote a été recommandée par Max Flescii.

Eyclesiietmer (ibid., 189:2, p. 563) emploie un mélange de parties égales d'essence de bergamote, essence de cèdre et acide phénique.

296. Revue. — Dans les paragraplies précédents, nous avons exposé la marche de la méthode du collodion telle qu'elle se pratiquait habituellement jusqu'à il y a deux ou trois ans. C'est une méthode minutieuse, longue et compliquée. Après une opération longue et délicate de pénétration par le collodion, elle exige une opération longue et encore plus délicate de durcissement par évnporation suivi d'un autre durcissement par l'alcool. Puis il faut se soumettre à l'obligation de tenir les pièces constamment mouillées d'alcool pendant l'opération des coupes. Et même la manipulation subséquente des coupes exige quelques précautions spéciales. Plusieurs de ces inconvénients sont écartés par la pratique récente à' éclaircissement avant coupes, méthode qui me paraît certainement destinée, du moins pour bien des objets, à remplacer l'ancienne. Ellr donne des masses aussi transparentes que le verre, ce qui facilite plus qu'aucune autre méthode d'inclusion l'orientation de l'objet dans lo microtome. Elle donne une meilleure consistance à la masse et per-

met ainsi de réaliser des coupes beaucoup plus fines. Elle abolit Tobligation de tenir Tobjet mouillé d'alcool pendant les coupes. Elle permet de conduire beaucoup plus rapidement toutes les opérations à partir de Tinclusion définitive.