Essence.] P, — Baume

£1. — Passage à

d'étude aqueux (ceci termine la préparation par voie humide).

G'. — Montage au baume (ceci termine la préparation par déshydratation d'un objet entier).

Comme -on le voit, si l'objet a été coloré en bloc au stade C ou E, la méthode des coupes ne diffère de celle qui est employée pour les objets

entiers que par l'intercalation des stades 6 dire entre l'alcool et le baume.

J entre F et G*, c'est-à-

4. Procédés spéciaux. — Par Tune et l'autre de ces méthodes, ranalomisle ébauche son travail, et souvent même l'achève. Ensuite vient, s'il y a lieu, l'étude de points spéciaux à l'aide de méthodes spéciales, telles que l'examen des éléments des tissus à' l'état vivant et in &itu^ ou bien dans des « liquides indifférents i ; telles aussi que l'emploi de colorants divers, ou la dissociation par des procédés mécaniques ou par la macération ; puis, la décalcification, la dépigmentalion^ etc.

Nous allons essayer de donner dans les paragraphes suivants de ce chapitre une description suffisante de ces méthodes générales, et nous réserverons pour des chapitres spéciaux la discussion des points de détail et des procédés auxiliaires.

5* Fixation et lavage. — La préparation d'un organisme ou d'un tissu quelconque doit toujours débuter par la Fixation de ses éléments. Le mot fixation implique deux choses : les éléments doivent être lues avec une rapidité suffisante pour ne pas leur laisser le temps de changer de forme ou de quitter Tattitude qui leur est propre pendant la vie ; — et ils.doivent en même temps acquérir, par l'effet du réactif, un degré de durcissement qui les mette en état de résister à toutes les manipulations subséquentes et à l'action des réactifs les plus divers, sans se déformer. On ne saurait trop insister sur ce point, qui est d'une importance capitale. Sans une bonne fixation, les objets ne sauraient fournir ni de bonnes colorations, ni de bonnes coupes, ni aucune autre sorte de préparations ayant de la valeur.

L'objet ayant été soumis à l'action de l'un des agents fixateurs que nous allons étudier dans le chapitre suivant, il est, en général, nécessaire de lui faire subir un Lavage soigné, dans le but d'éloigner des tissus jusqu'aux moindres traces de l'agent fixateur. Cela est nécessaire d'abord parce qu'une action trop prolongée des substances coagulantes dont on se sert pour fixer serait préjudiciable à la conservation des éléments, puis aussi parce qu'il est en général nécessaire de le faire dans l'intérêt des procédés de coloration et d'imbibition avec des nitUeux d'une réfringence voulue dont on se servira dans la suite.

La manière dont ces lavages doivent se faire n'est point indifférente. Si Ton a fixé à l'acide osmique ou à l'acide chromique, le lavage se fait généralement à l'eau. Mais si l'on a fixé avec l'acide picrique, par exemple, il est nécessaire d'éviter de laisser agir l'eau sur les tissus, et on la remplace par l'alcool. La pratique se fonde ici non seulement sur des considérations relatives aux diverses solubilités des réactifs eu question, mais aussi sur des considérations d'un ordre

IKTRODUCTIOS 5

tout autre, que voicL Les acides que nous avons mentionnés en premier Heu, de même que tous les composés des métaux lourds dont on se sert comme agents fixateurs, paraissent former des combiaaisoQâ chimiques avec les éléments des tissus, qu'ils rendent insolubles dans Teau ; de sorte que le durcissement opéré par ces réactifâ peut résister au traitement par Teau. L'acide picrique, au contraïre^ ne paraît nullement entrer en une combinaison semblable avec les éléments des tissus, et ne leur donne pas de durcissement persistant. Si l'on fait le lavage à Feau, Tacide se laisse eniièrement enlever, tout en laissant les lissua dans un état mou dans lequel ils subissent raclion nuisible de Teau qui les gonfle et les désagrège. Heureusement, l'alcool sert à enlever l'acide et à durcir les éléments en même temps. Nous aurons soin d'indiquer la manière dont il convient de faire des lavages pour chacun des réactifs fixateurs dont nous traiterons,

6. Précautions contre la déformation par les courants osmotigues ou de diffusion. — Dans la préparation de toutes les sortes d'objets, mais surtout d'organes ou d'organismes enliers et revêtus d'un tégument peu perméable aux liquides, il faut veiller à ce qu'il ne se produise pas de gonflements des tissus par endosmose lors de leur passage de l'un des liquides employés à un liquide de densité moindre, ni des ralatinements lors du passage à un liquide de densité plus grande. (Cet inconvénient se fait surtout sentir au moment du passage du dernier alcool à Tessence éclaircissante, mais il existe aussi à toutes les étapes de la préparation, c'est pour cela que nous en parlons ici,) Pour Téviter, on a soin, autant que possible, d^inciser largement les téguments de Tobjet que Ton prépare, pour que les deux liquides puissent se mêler librement et rapidement. Ensuite on a soin de faire en sorte que le passage de tun à Vautre liquide .wit rendu aussi graduel que possible* Cela peut se faire de deux manières.

S'il s'agit de porter l'objet dans un liquide inoins den^e que celui où il se trouve, il faut, autant que possible, le faire passer par des bains successifs de mélanges des deux liquides qui contiennent une proportion toujours croissante du deuxième liquide, Yeul-on passer de Teau h l'alcool fort, il est bon de passer par des bains successifs d^alcool au tiers, d'alcool â 70 p, 100, d'alcool à 90 p. 100 et finalement d'alcool â 9o p. 100. (Gela vaut mieux que d'ajouter par petites quantités de Talcool fort à l'eau où se trouve la préparation, procédé qui donne lieu à un dégagement de bulles d'air dans le liquide, ce

qui est à éviter.) Veut-on transporter dans de l'alcool à 70 ou à 90 p. 400 un objet qu'on vient de fixer avec un fixateur aqueux, on aura soin d'y porter l'objet au moyen d'une pipette ou d'une petite cuillère, de sorte qu'il se trouve enveloppé dans une petite atmosphère de liquide aqueux à laquelle l'alcool ne se mêlera que lentement. Gela suffira le plus souvent, mais il est des objets très délicats qui rendent désirable l'emploi de précautions encore plus minutieuses.

Pour de tels objets il convient de disposer un appareil servant à régler la diffusion. On peut mettre les objets avec un peu de liquide, dans un tube bouché à Tun de ses bouts et fermé à l'autre par un diaphragme de peau de chamois ou une autre membrane convenable, puis plonger ce tube dans un récipient qui contient de l'alcool du titre auquel on désire passer, et laisser le tout jusqu'à ce que, par diffusion lente à travers la membrane, le liquide du tube et celui du récipient soient devenus de densité égale. Ou l'on peut employer le « différentiateur > de Cobb, dont on trouvera la description dans Proc, Linn. Soc, N, S. \V., V, 1890, p. 457, ou dans Joum. Boy, Mie, Soc, 1891, p. 821 . Ou bien, ce qui sera en général plus commode, l'appareil de Haswell. (Proc, Linn, Soc, N, S, W,, VI, 1891, p. 433 et Jown, Rot^ Mie. -Soc, 1892, p. 696.) Cet appareil consiste en deux flacons de lavage réunis par un tube et portant, en outre, l'un un tube de dégagement pour le trop-plein, l'autre un tube à robinet ou à pince, qui le relie à un réservoir d'alcool du titre auquel on veut arriver. On met dans le premier flacon les objets avec un pou du liquide dans lequel ils se trouvent ; on met également un peu de ce même liquide dans le deuxième flacon ; puis on ouvre le robinet. Le mélange de liquides se fait donc dans le flacon qui ne contient pas les objets, et c'est ce mélange qui est graduellement conduit, par le siphon qui réunit les deux flacons, dans le liquide primitif qui contient les objets. Citons aussi l'appareil à déshydratation rapide de CuEATLE,/owrn. of Pathol, and BacterioL, I, 1892, p. 253, ou Journ, Boy, Mie, Soc.y 1892, p. 892.

Si, au contraire, il s'agit de porter l'objet dans un liquide plus dense que celui où il se trouve, on emploiera, selon les cas, soit la méthode de bains successifs de liquides mélangés, ou bien l'élégante méthode imaginée par Giesbreght, pour opérer le passage graduel de l'alcool absolu à une essence éclaircissante. Elle consiste à mettre le liquide éclaircissant sous l'alcool qui contient les pièces à éclaircir. Par exemple, on verse dans un récipient convenable — un verre de montre ou mieux un petit tube — quelques gouttes d'essence de cèdre ou de girofle, on verse doucement sur l'essence une quantité suffisante d'alcool. Ou bien, on verse l'alcool en premier lieu et l'on introduit ensuite l'essence sous l'alcool à l'aide d'une pipette. On met les objets à éclaircir dans l'alcool. Ils nagent d'abord à la surface de séparation des deux liquides, où ils se trou-

INTRODUCTION î

vent dans un milieu mixte dont la densité augmente aussi graduellement que possible de haut en bas. Ils se pénètrent peu à peu d'un milieu qui est un mélange des deux liquides employés, et à mesure qu'ils s'en pénètrent ils Téchangent de nouveau par diffusion contre un milieu toujours plus dense. Ils passent donc par gradations insensibles à travers des mélanges de densité croissante, jusqu'à ce qu'ils soient entièrement pénétrés par le liquide plus dense. Alors ils lombent au fond de ce dernier ; on enlève avec une pipette Talcool qui surnage, et l'opération est terminée.

Cette méthode est de beaucoup plus délicate que celle qui consiste à faire pénétrer les objets successivement par un mélange de deux parties d'alcool et d'une partie d'essence, par un mélange d'une partie d'alcool et d'une partie d'essence, et ainsi de suite; méthode que nous voyons cependant pratiquer journellement.

Il va sans dire qu'on peut opérer de même lorsqu'il s'agit de liquides

aqueux ; par exemple, pour passer de l'eau à la glycérine.

7. Coloration d'objets entiers. — Après cette digression sur la manière de faire passer les objets à travers les divers réactifs, reprenons notre revue de la marche normale de la préparation. Nous avons décrit la fixation et les lavages; la préparation préalable esl terminée. On peut maintenant, si Ton veut, procéder à la coloration dê& tisstis. On peut bien ajourner cette opération, et colorer en détail après que les coupes ou les dissections nécessaires auront été faites. Cela peut être même rendu nécessaire par certaines considérations, telles que le trop grand volume de l'objet, qui peut faire obstacle à la coloration ou bien la nécessité de contrôler de près lacoloralion et la décoloration, ainsi qu'il faut le faire si Ton désire pratiquer des colorations nucléaires selon la méthode régressive ou méthode de Flemiung, avec des couleurs d'aniline.

Naturellement si l'objet est destiné à être conservé en entier, et non à être débité en coupes, c'est maintenant qu'il faut le colorer. S'il s'agit au contraire de faire des coupes, les deux voies sont ouvertes, et l'étudiant pourra nous demander laquelle il vaut mieux suivre. Or il ne paraît pas utile de former une règle générale à cet égard. Tout ce que nous pouvons dire, c'est que personnellement nous avuns à peu près abandonné la pratique de colorer en masse les objets destinés à être coupés. La coloration des coupes présente le grand avantage de permettre à l'opérateur de suivre pas à pas le progrès de Ja teinture et d'y apporter de temps à autre toute modification qu'il voudra. Les colorations par les couleurs d'aniline, qui ont pris de nos

jours une si grande importance, ne se peuvent pratiquer en général que sur des coupes, et c*est là une considération des plus importantes. Mais ce genre de colorations demande une certaine adresse, et pour ce motif le débutant fera peut-être bien de s'en tenir à Tancienne méthode et de colorer en bloc par un procédé éprouvé, tel que celui du carmin au borax de Grenadier. Nous donnerons du reste des explications plus détaillées sur ce sujet au chapitre Des teintures.

8. Déshydratation et conservation. » La coloration une fois faite, il se peut que la préparation se trouve bien près d'être achevée. Si Ton ne désire faire ni coupes, ni dissections, il ne reste plus qu'à transporter l'objet dans le liquide c additionnel > ou conservateur dans lequel on veut l'étudier ou le conserver, et le monter sur porteobjets en préparation permanente ou temporaire. Nous parlerons au long de ces liquides dans les chapitres xvii et xix, et nous nous bornerons à rappeler ici que ce transport doit être fait d'une manière aussi graduelle que possible, comme nous l'avons expliqué au numéro 6.

Le passage à travers des alcools successifs jusqu'à l'alcool absolu ou très fort s'appelle c déshydratation >.

Ce passage forme une étape de la préparation qui nous présente comme une pause naturelle, où Ton peut s'arrêter si l'on veut. En effet, si l'on désire ne pas pousser la préparation plus loin pour le moment, il n'y a qu'à laisser les objets dans l'alcool à 70 p. 100 jusqu'à ce qu'on désire les soumettre à des manipulations ultérieures. Il vaut en général mieux ne pas prendre pour cette c conservation * des pièces de l'alcool plus fort. Gai* par l'action déshydratante et coagulante prolongée de l'alcool fort les tissus se trouvent altérés dans leur structure intime ; ils deviennent durs et cassants, et se ratatinent, et leur capacité de fournir à la teinture des colorations précises se trouve être sérieusement diminuée.

KuLTSCHiTZKY {Zctt. f. WÎS8, Mik., IV, 3, 4887, p. 349) a proposé de remédier à cet inconvénient en conservant les pièces dans de l'éther, ou dans du xylol ou du toluol (toluène), liquides qui n'ont pas cette action sur les tissus. Flemming (Arch. /*. miL Anat.y XXXVII, 1891, p. 685) recommande de les conserver dans un mélange (environ à parties égales) d'alcool, de glycérine et d*eau. Les pièces ainsi conservées souffrent beaucoup moins, soit sous le rapport de leur consistance, soit sous celui de leur capacité de coloration, que les pièces alcooliques. Et cette méthode a en outre l'avantage qu'elle permet ou bien de préparer les objets pour l'inclusion dans la paraffine par un simple traitement par l'alcool, ou bien de les ramollir rapidement pour la dissection ou pour la dissociation par un simple traitement avec de l'eau. Nous pouvons recommander cette méthode que nous avons beaucoup pratiquée. Nous ajoutons souvent au liquide un peu d'acide acétique (0,5 p. 100 environ).

Toutefois, si les pièces sont destinées à être coupées dans la paraffine,

INTRODDGTION »

nous recommandons de procéder aussitôt à rinclution et de les garder dans la paraffine même ; elles s'y conservent admirablement sous tous les rapports. (Je viens, h titre d'essai, de couper et de colorer (en teinture double par ]e Kernscbwarz et la safran ine) une pièce qui a été conservée dans la paraffine depuis six ans et huit mois. La coloration est moins énergique que celle des coupes qui ont été prélevées sur Torganc le jour même de son inclusion, mais elle est largement aussi précise^ et elle me semble même plus belle, La conservation des cellules^ saus être parfaite^ parait cependant excellente, La pièce est devenue un peu friable et se coupe mal.)

La plupart des auteurs recommandent de pousser la déshydratation par Faicool jusqu'au titre d*alcool al/^otu, avant de passer à Tessence écîaircissaute qui sert d'iotermédiaire enlro ralcool et le baume ou la paraffine. Or i7 nesi pas nécessaire d'aller jusqu'à alcool absolu ; Takool à 90 p* iOO ou au surplus à 95 p. 100 sufJira dans la plupart des cas. Car la trace d'eau qui peut rester dans les tissus après qu'ils ont été traités par de Talcool de ces degrés se laissera parfaitement éloigner par le bain d'essence, pourvu qu'on ait soin d'employer une essence qui soit un bon agent éclaircissant. L'essence de bois de cèdre prendra bien toute l'eau qui reste dans les tissus après traitement par ralcool à 95 p, 100 ; l'essence do bergamote cclaicira après ralcool à 90 p. 100, et Thuile d'aniline après Talcool à 70 p. 100.

B. ÉelaircissemeiLt et dissections fines. — Les objeU une fois déshydratés doivent maintenant être pénétrés soit par une essence ou un autre agent éclaircissant, s'ils sont destinés à être moutés tout de suite dans le baume, ou par la même essence ou un autre dissolvant de la parafline soit autre masse d'iuclusioa si Ton veut en faire des coupes. Pour le détail de ces opérations noua renvoyons aux chapitres Agents éclairciss.4nts, Liquides additionnels -

11 reste cependant à noter ici que si l'objet doit âubir une dissedion fine à la loupe, c^est pendant qu'il se trouve dansFessence qu'il convient le plus souvent de faire cette opération^ Nous recommandons beaucoup à cette fin Fessence de bois de cèdre, qui prête aux tissus une consistance très favorable^ pendant qu'en même temps sa viscosité considérable aide à soutenir les éléments délicats. L'essence de girofles a la propriété de rendre très cassanls les tissus qui y ont séjourné quelque temps, c'est là une qualité qui peut être utile ou non selon les cas. Cette essence a aussi la propriété de ne pas s'étaler largement k la surface du verre, mais d'y former des gouttes très convexes ; c'est là aussi une qualité dont on peut tirer parti.

10. Inclnsion et coupes. — Les coupes se font par Tune ou Fautre des Méthodes d*inclusion dont nous donnons Fck position détaillée au chapitre xxi et aux suivants. Nous Dotons seulement ici qu'il y a deux méthodes principales d'inclusion, là méthode de la parafHne et la méthode du coltodion* Les avis sont encore partagés sur la valeur

la CIIÂFITRE PREMIER

respective de ces deux mélhodes. Nous admettons, et en cela nous sommes certainement d'accord avec la grande majorité des anatomisLes^ que le procédé à la paraffine est la méthode par excellence pour les petits objets (c'est-à-dire des objets n*ayant pas. plus de 7 millimètres environ de diamètre) ; tandis que le procédé au collodion convient mieux pour les objets très volumineux.

11. Traitement déflBltif des coupes. — Les coupes une fois obtenues, il ne reste plus (si Tobjet a déjà été coloré en entier) qu'à en éloigner la paraffine au moyen d'un dissolvant convenable, et à les monter dans le baume. Cela se fait en général à l'aide du collage des coupeB en svncs su?* le porte-objets. Les coupes ayant été faites à see (c est-à-dire sans que !e rasoir ait été mouillé pendant qu'elles se faisaient) sont rangées en ordre sur un porte-objets enduit de collodion ou de Tune des autres substances qui ont été préconisées à cet effet, de la fai^on que nous expliquerons au chapitre xxiv. On porte alors le tout à la température de fusion de la paraffine, on chasse la paraffine fondue avec une goutle d'un dissolvant convenable (du xylol, par exemple), on ajoute une goutte de baume de Canada et un couvreobjets, et la préparation est terminée.

Si la coloration n'a pas déjà été faite, voici comment on procède. Au lieu de porter les coupes dans le baume, on éloigne avec de l'alcool la substance qui a servi à dissoudre la paraffine, on les porte dans la solution colorante, et après coloration on lave, on déshydrate, Ton éclaircit de nouveau et Ton monte.

12, Résumé et observations additionnelles. — Voici en très abrégé un cadre de marche générale que nous recommandons à l'étudiant débutant. Fixez au sublimé ; lavez à l'eau d'abord ; puis longuement à i'alcool à 50 p. 100; colorez au carmin boracique alcoolique de Grenacher ; décolorez comme il est dit au paragraphe qui traite de ce réactif; passez par des alcools successifs de la manière que nous avons dite au numéro 0 ; éclaircissez par de l'essence de bois de cèdre, et montez au baume, si vous ne désirez pas faire des coupes. Si vous désirez faire des coupes, au lieu de mettre la pièce dans le baume, vous la mettez dans un bain de paraffine et procédez comme il est dit au cliapître xxi ; coupez; collez les coupes sur la lamelle avec ïe collodion de Seh.'ellîbaum ; enlevez la paraffine avec du xylol, et montez dîrectejuent dans le baume.

L%Hudiant qui s'est perfectionné dans cette marche pourra ensuite aborder une variante un peu plus difficile. Au lieu de fixer par le