INTRODUCTION

sublimé, il pourra prendre le liquide de Flemming; et, au lieu de colorer l'objet entier, il pourra colorer les coupes (collées sur porteobjets par l'albumine de Mayer), avec la safranine ou le bleu Victoria. Ce n'est qu'après s'être perfectionné dans l'art de la teinture par la méthode de Flemming avec un seul colorant que nous lui conseillerions de s'essayer à une coloration double, telle que par le violet de gentiane suivi de la fuchsine acide.

Nous engageons beaucoup le lecteur à consulter Tadmirable exposition des principes de la technique histologique moderne qui a été donnée par Paul Mayer dans les Alitth. Zool. Stat, Neapel, II, 1881, p. 1. (On en trouvera des comptes rendus dans/oMrn. Roy. Mie, Soc.^ II, 1882, p. 866-881, et Amer, NaturaL, XVI, 1882, p. 697-706, ces derniers mentionnant quelques améliorations qui avaient été imaginées depuis la publication du travail de Ma^-er.)

13. Introduction^ — Par le mot fixation des tissus, on a coutume d'enlendre les diverses opérations qui ont pour effet de tuer d'une fae^on inslantanëe les clémenls an atomiques, tout en leur conservant ia forme qu'ils possédaient pendant la vie, et en leur prêtant un degré de durcissement artîGciel qui leur permet de subir sans se déformer Taclion des substances colorantes, durcissantes, éclaircissantes, isolantes, enrobantes, ^— en un mot, toutes les manipulations chimiques et physiques qu'on détire mettre en œuvre pendant le cours de la préparalion ultérieure.

Voici un exemple qui servira à faire comprendre Futilité des agents fixateurs. Si Ton traite une portion de rétine vivante soit avec de Thumeur aqueuse de Tûcil, soit avec du sérum, soit avec n'importe lequel des liquides dits indifférents des micrographes, ou avec Tune ou Tautre des liqueurs conseriifitrices qu'on emploie pour la conaer* valion permanente des pièces histologiques, on trouve invariablement que les cônes et bâtonnets ne conservent que pendant un temps très court l'apparence qu'ils ont pendant la vie ; après quelques minutes au plus, on voit commencer une série de changements post mortem, à la suite desquels les segments externes soit des cùnes, soit des bâtonnets se brisent en un certain nombre de disques et deviennent à la fln désintégrés au point d'être entièrement détruits. Puis encore, dans la même préparation, on observera qu'en un temps tout aussi court les fibrilles nerveuses, de lisses qu*elles étaient pendant !a vie, deviennent variqueuses, présentant un grand nombre de nœuds fus i formes, pour ne point parler des autres altérations post morlem qu'elles subissent* Si, au contraire, nous traitons une rétine vivante avec une solution con* centrée d'acide osmique, nous trouverons^ après vingt-quatre beureSj

EXTENSION j FIXATION ET DrRClSSEBIENT 13

que la totalité des cônes et des bâtonnets esl parfaitement conservée, et que les fibrilles nerveuses ne montrent que peu ou point de varicosîtés. Et après ce durciasement préliminaire nous pouvons traiter la rétine avec de Feau {procédé qui ruinerait entièrement une rétine non fixée)^ nous pouvons même la laver dans de Teau pendant des jours entiers, sans qu'elle en soufTre ; nous pouvons la colorer, la durcir, la déshydrater, Fenrober, la couper au niicrolome, el monter les coupes dans un milieu résineux ou aqueux, sans que ses éléments aient éprouvé d'altération sérieuse par suite de ces manipulations.

il résulte de tout ce que nous venons de dire que la fixation des tissus est la condition siîie quâ non de toute préparation à laquelle on veut donner une valeur scientiliqiie (nous parlons de préparations normales de parties molles, cela va de soi). « On a proposé depuis longtemps des liquides qui auraient la propriété de conserver indéflnimeut les tissus qu^on y a mis à Fétat frais ; mais^ eu réalité^ aucun de ces liquides ne possède ces avantages. II n'est pas à dire pour cela qu'on ne puisse avoir des préparations persistantes des éléments de l'organisme même les plus délicats ; pour atteindre ce but, il convient d'employer, non pas un seul liquide conservateur, mais une série de réactifs, dont les uns servent à fixer les éléments dans leur forme et à les rendre plus ou moins inaltérables, d^autres à les colorer, d'autres enûn à les mettre à Tabri de modiÛcations ultérieures « ■ (Ranvier») ^

14« Préeautionâ prélimîtiaires. BxtenBion mécanique. — Dans la grande majorité des cas, ou commence la préparation d'un objet en soumettaut l'orgaoe ou Torganisnie a étudier à Taction aussi complète et aussi immédiate que possible de Tun des agents fixateurs que nous allons étudier. Et cela se fait en prenant Torgane ou l'organisme à l'état vivant et normal ; on se fie alors à l'agent fixateur pour produire, avec la rapidité voulue, en même temps la mort de l'organisme et la mort des éléments des tissus. On ne peut cependant pas agir ainsi dans tous les cas. Il est des tissus qui^ au moment ou l'on fait agir sur eux les réactifs dont nous allons parler, se rétractent, se plissent, et donneraient de mauvaises préparations si Ton ne parvenait à les maintenir en Tétat d'extension physiologique pendant la fixation.

S* agît-il d cléments aïlongés^ soit plats, soit filiformes, il suffit souvent de les placer sur une lame de verre et d'en fixer les deux extrémités avec de la cire à cacheter ou avec une goutte de paraffine fondue. Ainsi pour tes tendons et les petits muscles. Ou bien on peut

mettre en œuvre le procédé de Ranvier {Traité^ p. 729) pour les nerfs à myéline. « On prend une petite tige de bois (une allumette par exemple) dans laquelle on pratique un évidement; au niveau de celui-ci on dispose Je nerf et on le fixe au degré d'extension convenable au moyeu de ligatures placées à ses deux extrémités. > Puis on porte le tout dans le liquide fixateur.

Pour les membranes, on peut les tendre, comme la peau d'un tambour, sur un verre de montre, un petit godet, ou le goulot d'un flacon, et les y attacher avec un tour de fil. On trouvera très commodes pour cette opération les anneaux histologiques des Hoggan et d'ÉTEUKO» que nous décrirons au chapitre des Imprégnations. Des organes membraneux tels que la vessie peuvent être maintenus en extension en les gonflant au moyen d'une seringue, soit d'un liquide indifférent, soit du liquide fixateur lui-même.

Le procédé de la « demi-dessiccation > (Ranvier, Traité^ p. 69) « consiste à étendre sur une lame de verre une membrane à Taide des doigts appliqués sur ses bords. Tant que la membrane est humide, elle se rétracte du moment qu'on l'abandonne à elle-même. Mais lorsqu'elle commence à sécher (et par suite de la chaleur des doigts qui la tendent, elle sèche plus vite sur les bords), ses bords restent adhérents au verre, et en l'attirant successivement sur ses différents cotés, on arrive à la tendre d'une façon très complète ».

On trouvera d'autres indications, très détaillées, dans le classique Traité de Ranvii^r-

15. Hxtensioii par intoxication. — Il est bon nombre d'animaux, de coiisiâtance molle, manquant de squelette rigide, et doués d'une puissance considérable de contractilité — les Cœlentérés, les Bryozoaires, les Serpulides en fournissent assez d'exemples — qui, si on les traite sans autre précaution par un agent fixateur, se contractent avec violence, retirent leurs tentacules ou leurs branchies, et meurent en un état recoquillé qui fait de l'objet conservé une caricature de la vie-

Les animaux qui ne se contractent que lentement^ tels que Alcyoniiwi et VeretiUum^ et quelques Tuniciers, tels que Pyrosoma, peuvent être luéB en extension si on les jette brusquement dans un liquide fixateur assez énerpque pour les tuer avant que leurs éléments n'aient eu le temps de se contracter.

L'acide acétique criâtallisable (méthode de van Beneden) est un excellent réactif k cette liu, et réussit, par exemple, très bien avec Pyrosoma et certaines Méduses (voy. au chapitre v et chapitre xxxui). Le sublimé corrosif, gortôut à chaud, donne aussi souvent de bons résultats.

L'application brusque de la chaleur est aussi un procédé dont on peut tirer parti. Par ce moyen, les éléments sont fixés en même temps que les organes sont immobilisés. C'est aussi une méthode qui a Tavantage de se prêter mieux qu'aucune autre à Texamen micro-chimique des tissus, car elles n'y introduit rien qui puisse en altérer la composition ni gêner les réactions.

Il sufHra en général d'exposer les animaux pendant quelques secondes à une chaleur suffisante. On peut mettre de petits objets tels que Protozoaires, Hydraires, Bryozoaires, dans une goutte d'eau placée dans un verre de montre ou sur une lamelle, et les flamber au-dessus d'une lampe à alcool. Des animaux plus grands peuvent être jetés brusquement dans une quantité d'eau chauffée préalablement. On conserve très bien les grands Némertiens en les jetant dans de l'eau douce chauffée. On peut aussi mettre les pièces dans une très petite quantité d'eau contenue dans un tube de verre et plonger ce tube pendant quelques secondes dans de l'eau bouillante. Aussitôt fixées, les pièces doivent être passées dans l'alcool (50 p. 100 environ).

La difficulté de cette méthode consiste à atteindre la température mortelle sans la dépasser de plus de quelques degrés. Il ne faut guère aller au delà de 80® C, en aucun cas, et une chaleur de 60® C. suffira très souvent. C'est en somme une méthode qui peut rendre des services, mais il ne faut pas trop s'y fier dans les recherches histologiques délicates, car le moindre excès de chaleur provoque des gonflements très considérables de certains éléments cellulaires.

Mais dans le cas d'animattx qui se contractent très rapidement, on est souvent obligé d'avoir recours à Timmobilisation préalable par un des procédés d'intoxication ou d'anesthésie que nous allons décrire.

16. Fumigation au tabac (Hertwig, Die Actinien, 1879). — On place les animaux dans une cuvette avec de Teau, et on les recouvre d'une cloche de verre ou d'un cristallisoir, destiné à confiner la fumée de tabac. On fait alors passer de la fumée sous la cloche par le moyen d'un tube de verre courbé. Après y avoir introduit une quantité sufïïsante de fumée, on abandonne les animaux pendant quelques heures, aûn que la narcotisation puisse se compléter. On constate le progrès de l'anesthésie en irritant l'animal de temps à autre ; aussitôt qu'on observe qu'il ne réagit plus que lentement, que, par exemple, si l'on touche un tentacule avec une aiguille, cet organe ne commence à se rétracter qu'après un laps de temps considérable, on peut estimer que le sujet est suffisamment engourdi. On verse alors dans l'eau une dose de liquide fixateoir suffisante pour le tuer avant qu'il ait eu le temps de changer d'attitude ; et, une fois qu'il est parfaitement mort, on peut changer à volonté le liquide où il se trouve.

i6 CHAPITRE II

Si Ton nous demande notre avis quant à l*utilité de cette méthode, nous dirons qu'elle peut rendre de réels services, et nous conseillerons de ressayer toutes les fois qu'on n'est pas arrivé au but par une voie plus commode. La fumigation produit, par exemple, chez les Actinies, une bien véritable intoxication qui sert parfaitement à les maintenir étalées ; mais cet état ne s'établit que lentement : il faut plusieurs heures pour produire l'immobilité voulue chez une Actinie.

En conséquence, c'est un procédé peu agréable à appliquer, c'est pourquoi l'on a imaginé le suivant.

17. Nicotine. — Andres [Atti R. Acad. dei Lincei, V, 1880, p. 9 ; Joum, Roy. Mie. Soc. (N. S.), II, 1882, p. 884) a imaginé d'employer la nicotine en solution aqueuse, au lieu de l'administrer sous forme de fumée de tabac. Il se sert d'une solution d'un gramme de nicotine dans un litre d'eau de mer. Il place l'animal à narcotiser dans un bocal contenant un demi-litre d'eau, et il y conduit la solution de nicotine très graduellement par le moyen d'un fil faisant siphon. La grosseur du fll doit être telle qu'il puisse vider le litre de solution de nicotine en douze heures.

18. Chloroforme. — D'autres substances anesthésiques peuvent être ajoutées par petites quantités à l'eau qui contient les animaux à endormir. Le chloroforme donne quelquefois de très bons résultats quand il est employé de cette manière; nous avons vu de belles Méduses très bien chloroformées dans une attitude parfaitement étalée, en une heure ou deux de temps. Il convient de projeter le chloroforme, par quantité de quelques gouttes à la fois, vigoureusement dans l'eau avec une petite seringue ou une pipette munie d'une poire de caoutchouc, l'une ou l'autre ayant l'orifice assez petit pour que le chloroforme soit pulvérisé à la sortie. On répète la dose toutes les cinq minutes, jusqu'à ce que l'animal soit immobilisé. Notons ici que Andres a trouvé que cette méthode ne convient pas pour les Actinies, car chez ces animaux la macération des tissus survient avant que l'insensibilité soit établie.

Pour obtenir de bonnes coupes de la tige très contractile des Siphonophores, Korotneff [Mitth. Zool. Stat. Neapel^ V, Hfl 2, 1884, p. 229 ; Zeit. f. wiss. Mikroskopie^ 2, 1885, p. 230) commence par anesthésier les animaux avec la vapeur de chloroforme. On attend que les animaux se montrent un peu tranquilles dans le bocal qui les contient. On fait flotter alors sur l'eau un verre de montre contenant du chloroforme, et l'on couvre le tout avec une cloche. Le chloro-

forme endort les Siphonophores, qui demeurent étalés. On enlève alors la cloche, et Ton fixe les animaux en les inondant subitement d'acide chromiqûe ou de sublimé chaud.

19. L'alcool et l'éther peuvent s'employer de la même manière que le chloroforme. Pour les Actinies, Andres a obtenu de bons résultats avec le mélange suivant (dû à S. Lo Bianco) : glycérine, 20 parties ; alcool (70 degrés), 40 parties ; eau de mer, 40 parties. 11 faut verser ce liquide avec précaution sur Teau qui contient les animaux, et Attendre qu'il s*y soit mêlé lentement par diffusion. Il faut pour cela souvent plusieurs heures. C*est ainsi que Ëisig emploie l'alcool.

20. Alcoolméthylique(CoRi,Zezï./. wjtss. Jlfa.,VI,4,1890,p.438). — Ce réactif a l'avantage, entre autres, de n'avoir que peu d'action sur les albumines. On fait un mélange de 10 ce. d'alcool méthylique, ei 90 ce. d'eau de mer ou d'eau douce (si on prend de l'eau douce ^n ajoute 6 grammes de chlorure de sodium). On ajoute ce mélange par petites quantités à l'eau qui contient les animaux ; et si cela ne suffit pas, on les inonde du mélange non dilué. On peut ajouter au mélange quelques gouttes de chloroforme.

21. GhloraJ. — Fokttinger {Archives de Biologie, VI, p. 115) a obtenu des résultats très complets avec l'hydrate de chloral. Il opère en laissant tomber au fond du vase qui contient les animaux quelques cristaux de chloral. Pour des Alcyonelles, il emploie 35 à 50 centigrammes de chloral pour 100 grammes d'eau. Au bout de trois quarts d'heure, la colonie est devenue insensible, ne réagit plus et peut être 0xée. Foettinger a ainsi obtenu de bons résultats avec des Bryozoaires aquatiques et marins, des Annélides, des Mollusques, des Némertiens. Ces derniers deviennent insensibles sans avoir craché leur trompe. L'expérience n'a pas réussi avec les Hydroïdes. Les résultats obtenus avec les Actinies étaient assez satisfaisants. Des Astéracanthions ont pu être endormis.

Je sais que cette méthode donne souvent de bons résultats, mais elle ne réussit pas toujours. Je l'ai essayé avec des Némertiens, et je n'ai jamais eu le moindre succès.

Verworn [Zeit.f. wiss. ZooL, XLVI, 9, 1887, p. 99 ; Journ. Boy. Mie. Soc.^ 1888, p. 148) s'en sert pour les Bryozoaires d'eau douce. Il laisse des colonies de Cri$tatella pendant quelques minutes dans une solution de chloral à 10 p. 100.

KÛKENTHA.L [Jen. Zeit.y XX, H. 4, 1887, p. 511; Journ. Roy. Mie. Soc.^ 1888, p. 509) a obtenu de bons résultats avec quelques Annér

ANAT. UICROSC. 2

CHAPlTtlE II

lides au muyea d une sûlulion de ehloral à 1 p. 1000 dans Teau de mer.

Je pense que le ehloral ne doil être employé qu'avec précaution^ car il macère très vite. J'ai vu des animaux dont Tépiderme était très macéré avant que Tin sensibilité fût établie

22. Chlomre de magnéalum {Tulliïerc, ytrcA. Zool. Expér, et Gén., X. 1892, p. il). — Pour des Aclinics, faire une solution à 33 p. 100 et l'ajouter graduellement à Teau qui conlieul Tanimàl étalé, jusqu'à ce que cette eau contienne 1 p. 100 du sel. Ainsi pour l litre d*eau de mer ajoutez 33 ce. de la solution. H faut une trentaine de minutes pour arriver à Tanesthésie. Pour des Invertébrés d'eau douce ou terrestres il faut prendre une solution un pen plus forte.

TlEDEMiAUGn [Amer. NaL, 1895, p. 399 ; Journ. Roy, Mie. Soc, 1895, p. 'à%'û} prend le sulfate de magnésie, qu'il emploie soit en solution, soit sous forme de cristaux.

23. Cocaïne {Rtcuahd, ZqoL Anzeîg^^ 188S, p. 332). — Richard se sert d'une soliitioa de chlorhydrate de cocaïne au centième. Les animaux à narcotiser (Bryozoaires) sont placés dans un verre de montre avec S ce, d'eau. On ajoute, peu à peu, de la solution de cocaïne^ Après cinq minutes les animaux ne réagissent plus que faiblement ; on ajoute encore un demi-centimètre cube de la solution, et, un instant après, il faut exciter directement les tentacules, à l'aide d'une aiguille, assez fortement pour leâ voir se contracter. Dix minutes plus tard, les animaux doivent être morts épanouis, et peuvent alors être traités par les procédés ordinaires de fixation. Celte méthode convient pour les Bryozoaires, les Hydres et certains Vers,

24. Hydrosylamlne. — Hofeb {Zeii. f. wiss. Mik., Vil, 3, 1390, p. 318) a employé Thydroxy lamine avec succès pour les organismes les plus variés. On peut prendre ou bien le sulfate de la base ou bien rhydrochlorate, ce dernier de préférence- L'hydrochlorate du com* merce contient hahiluellenient de Tacide chlorhydrique. II faut le dissoudre dans de l'eau douce ou de Teau de mer (pas dans de l'eau distillée) f et neutraliser exactement par addition de carbonate de soude. On prend pour des Infusoires une solution d'une concentration de 0,1 p. 100 et on les y laisse trente minutes ; pour des hydres, 0."iy p. lOOj et on les y laisse de quinze minutes à une heure; pour liirudo, 1 p, 100, 30 minutes à deux heures ; pour Hélix et Anodonta, même concentration, dix à vingt heures.

L*hydroxy lamine est un agent réducteur très énergique. Les animaux paralysés ne doivent donc pas être tués par un agent Qxateur facile à réduire^ telqueTâcide osmique, Tacidechromique, le sublimé.

EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT ft9

etc.^ à moins qu'il ne soit possible dô les bien laver à Teau auparavant.

25. Acide carbonique (Fol, Zool. Anzeig., n*" 128, 1885, p. 698. Aussi, Bulletin de la Société Belge de Microscopie^ t. IV, 1882, p. 83). -* Il faut saturer graduellement diacide carbonique Teau dans laquelle nage Tanimal à immobiliser; celui-ci devient bientôt complë* tement insensible et immobile, tout en conservant son aspect naturel. Il reste sans changement pendant des heures et même des jours entiers ; mais il reprend toute sa vivacité aussitôt que Teau chargée d*acide carbonique est remplacée par de Teau pure* Le procédé ne réussit ni avec les Poissons ni avec les Mollusques, mais il réussit avec la plupart des animaux dont le système nerveux conserve son caractère épiblastique, c'est-à-dire, par exemple, avec la plupart des Cœlentérés et des Ëchinodermes.

J'ai essayé cette méthode avec de petits Annelides et des Hirudinés, et j'ai eu des résultats excellents. Il n'est pas nécessaire d'employer, un générateur pour fabriquer le gaz. Il suffit de prendre un siphon d*eau gazeuse du commerce, et d'en ajouter à l'eau qui contient les animaux.

26. Empoisonnement. — On obtient quelquefois de fort bons résultats en empoisonnant les animaux avec de petites doses d'un liquide Qxateur. L'acide osmique et la liqueur de Kleinenberg s'em-» ploient souvent à cet effet. Nous avons vu tuer des Méduses d'une manière très satisfaisante par le sublimé corrosif en nature, ajouté par pincées à l'eau contenant les Méduses. Voici une méthode pouf conserveries Ascidies avec leurs oriQces naturellement ouverts, due à Salvatore Lo Bianco, l'habile préparateur de la Station zoologique de Naples. On ajoute, peu à peu et très doucement, à l'eau qui contient les animaux, une solution d'acide chromique à 1 p. 100, additionnée d'acide acétique, en faisant en sorte que ce liquide nage à la surface de l'eau de mer et ne s'y mêle que lentement. Il faut quatre à cinq jours pour mener l'opération à bonne fin. (Garbini, Manuale per la Technica Modema del Microscopio^ p. 163.)

D'autres ajoutent à l'eau de mer des cristaux d'alun. On a aussi employé de cette manière la morphine, le curare, la strychnine^ l'acide prussique et autres agents paralysants.

27. Asphyxie. — On sait que, pour faire mourir étendus les Gastéropodes pulmonés terrestres, il est d'usage de les mettre dans

0n bocal rempli d*eau qui a été privée d'air par rébullition et hermétiquement «los. On trouve les animaux morts étendus après douze à vingt-quatre heures. Nous ajouterons qu'on nous a assuré que cet effet s'obtient plus promptement si Ton a soin d'ajouter à Teau du bocal un peu de tabac.

Quelquefois on arrive au but simplement en laissant des animaux aquatiques épuiser d'eux-mêmes l'oxygène de l'eau dans laquelle on les a confinés. J'ai réussi ainsi avec des Holothuries et d'autres Échinodermes. Ward {Amer. Nat., XXV, 1891, p. 398) a eu de bons résultats de cette manière avec des Hydraires, des Actinies, etc. Si les animaux se montrent imparfaitement étalés lorsque la narcose s'est établie, il faut les mettre pendant un instant dans de l'eau pure ; ils s'étendront, et à cet instant on les jette dans un liquide fixateur (Ward).

28. Autres procédés. — Certains Vers meurent lentement et étendus si on les met dans de Teau chaude.

Le jus de citron m'a donné de bons résultats avec de petits Hirudioés qu'il fait mourir instantanément dans une attitude étalée.

L'eau douce sert quelquefois très bien pour étendre des animaux marins.

29. Pratique des fixations. — Les agents fixateurs s'emploient soit à l'état de liquides, soit à l'état de vapeurs. Nous ne connaisgons que l'osmium qui soit généralement employé de cette dernière façon; cependant l'alcool et l'acide sulfureux ont été récemment employés à l'état de vapeur avec fruit par Gilson et Carnoy, et nous ne serions nullement étonné de trouver que d'autres substances peuvent être utilisées avec avantage de cette façon (acide formique).

Pour fixer un objet avec la vapeur d'un de ces réactifs, on procède comme nous le disons au numéro 38.

Pour fixer un objet dans une solution quelconque, il va sans dire qu'on le plonge dans le liquide et qu'on l'y laisse jusqu'à ce que la réaction soit accomplie. Nous indiquons ici quelques précautions à prendre.

It faut veiller avec soin à ce que les tissus, les éléments ou les organismes soient pai^faUement vivants au moment de les fixer; si on les laisse mourir avant de les exposer à l'action de l'agent fixateur, on ne fixe que des états pathologiques, ou des altérations pos^ mortem.

Il faut veiller à ce que les objets à fixer soient aussi petits que

possible, pour que l'agent fixateur puisse les pénétrer rapidement et d'une façon égale. Des organes ou organismes entiers doivent être largement ouverts, si cela est possible.

On jettera les objets dans une quantité de solution fixatrice très grande par rapport au volume des objets ; il s'agit, en effet, d'empêcher que la composition de la solution fixatrice ne se trouve changée par l'addition des liquides ou des substances solubles des tissus.

En cas de nécessité, on facilitera Faction du fixateur en l'employant à chaud. La chaleur de Tétuve d'incubation sera souvent suffisante, mais quelquefois il faudra employer des liquides bouillants (sublimé bouillant pour quelques Goralliaires et Hydrozoaires, alcool absolu bouillant pour certains Arthropodes à téguments très imperméables).

Certains Qxateurs demandent qu'on ne laisse les oi3Jets dans le liquide que juste le temps nécessaire pour que la fixation s'accomplisse, tel, par exemple, le sublimé corrosif; si on les y laisse séjourner trop longtemps, les tissus deviennent souvent cassants, et les coloralions sont gênées. D'autres, au contraire, comme le liquide de Flemming, sont tels qu'on peut y laisser les objets pendant des jours ou des semaines sans inconvénient.

On aura soin de faire ensuite les lavages nécessaires pour enlever le réactif fixateur avec le liquide approprié; il n'est, par exemple, nullement indifférent de prendre l'eau ou l'alcool après tel ou tel réactif. Quelquefois l'eau défait toute l'œuvre de la fixation, quelquefois l'alcool donne lieu à des précipités qui ruinent les préparations. Nous tâcherons d'indiquer pour chaque cas le liquide de lavage qu'il convient d'employer.

Dans certains cas, on facilitera l'enlèvement de l'agent fixateur en faisant les lavages à chaud. L'acide picrique, par exemple, est presque deux fois aussi soluble dans l'alcool à la température de 40^ qu'à la température ordinaire des appartements (Fol).

Les liquides soit de fixation, soit de lavage, doivent être renouvelés aussitôt qu'ils deviennent troubles.

Les objets une fois fixés et convenablement lavés peuvent être conservés indéfiniment dans de l'alcool (de 70 à 90 p. 100) ; mais il vaut toujours mieux les y laisser le moins longtemps possible.

En fait de considérations plus spéciales, nous ferons observer que : l'acide osmique est à éviter pour les structures peu perméables ; — l'acide picro-sulfurique est à éviter pour les structures qui contiennent une proportion notable de tissu conjonctif, vu qu'il fait gonfler ce tissu ; il est donc, en général, peu propre à l'étude des organes des Vertébrés.

2â CHAPITRE II

Il faut éviter Temploi d'instruments métalliques pour manier les objets qu*on a mis dans des solutions de sublimé corrosif, d'acide acétique ou de chlorure d*or, vu que les solutions de ces sels se pré* cipitent au contact des métaux.

30. Fixation d'animaux marins. — On remarquera que les tissus des animaux marins sont en général plus réfractaires envers les agents chimiques que ceux des animaux terrestres ou d*eau douce des mêmes groupes. Il convient donc d'employer pour les animaux marins des solutions plus fortes (selon Langerhans^ deux ou trois fois plus fortes que pour les animaux terrestres).

Outre cette précaution, il en est une autre, indiquée par Paul Mayer, qu'il est bon de ne pas perdre de vue. Ce naturaliste insiste avec raison sur la nécessité qu'il y a à débarrasser les animaux de leur* eau de mer avant de les mettre dans de l'alcool ou dans un réactif qui soit capable de précipiter les sels contenus dans l'eau de mer. Si Ton néglige cette précaution, ces sels se précipitent autour de ranimai et à la surface de ses organes en une croûte qui forme un obstacle, beaucoup plus sérieux qu'on ne le croirait à première vue, à la pénétration d'abord de l'alcool lui-même, puis des solutions colorantes. Comme résultat, on a des macérations des tissus et des colorations défectueuses.

On évitera donc de se servir d'alcool pour la fixation des animaux marins ; on n'emploiera pas non plus, comme nous avons vu proposer de le faire, des solutions faites avec l'eau de mer comme menstrue ; mais on emploiera des solutions faites avec l'eau distillée, et de nature à maintenir en dissolution, et finalement à enlever, les sels dont nous parlons. Ces conditions se trouvent réalisées, par exemple, dans la liqueur de Kleinenberg et dans les liquides de Paul Mayer.

31. Choix d'un fixateur. — Tout agent fixateur devrait posséder les propriétés suivantes : tuer aussi rapidement que possible ; ne pas exercer sur les tissus d'action chimique nuisible; causer le moins possible le ratatinement des tissus; et ne pas avoir des eficts qui puissent nuire aux opérations ultérieures, comme cela arrive par exemple lorsqu'on pratique la fixation avec des substances qui noircissent les tissus, ou les rendent cassants, ou bien qui les empêchent de donner les réactions voulues avec les solutions colorantes. Nous croyons qu'aucun des fixateurs connus n'est exempt de la totalité de ces défauts ; on en est réduit à choisir pour chaque cas particulier la

EXTENSION, FIXATION ET DURCISSEMENT t3

méthode dont les imperfections sont les moins gênantes pour le but qae Ton se propose.

Les agents fixateurs sont, ou bien un agent physique — la cha* leur — ou des substances qui, agissant apparemment d'une façon chimique, probablement en déshydratant les tissus, produisent une coagulation rapide de leurs principes constituants albuminoïdes, gélatineux ou mùqueux. Au point de vue chimique, ces substances se trouvent être certains oxydes, des acides minéraux et organiques » certains sels des métaux lourds, certains chlorures, l'iode, TalcooL Au point de vue pratique, il conviendra de grouper ces substances de diverses façons. S'agit-il d'obtenir une bonne fixation, ce sont Tacide osmique, Tacide chromique, et surtout les mélanges de ces deux substances, puis le chlorure d'or, qui tiennent le premier rang* S'agit-il, au contraire, d'une grande puissance de pénétration, telle que le demande la fixation des pièces très volumineuses, on préférera dans beaucoup de cas à tous ces réactifs un mélange picrique. S'agit-il enfin, comme c'est en général le cas, de pouvoir produire ensuite de belles colorations, sans trop de peine, par les méthodes ordinaires, on trouvera que ces réactifs se groupent à peu près comme suit (nous ne citons ici que les réactifs qui sont d'un emploi général) :

Fixateurs qui ne gênent pas les Fixateurs qui gênent les cohraiions^ colorations.

Chaleur. Mélanges de Flemming.

AlcooL Acide chromique.

Subhmé corrosif. Chromate d'ammoniaque.

Acide nitrique. Bichromate de potasse.

Nitrate d'argent en solution faible. Nitrate d'argent en solution forte.

Osmium en vapeur. Osmium en solution.

Acide picrique et mélanges picriques. Chlorure de palladium.

Solution de Merkel. Chlorure d'or.

Sels d'uranium.

En donnant cette liste, nous ne voulons nullement donner à entendre que l'emploi des réactifs mentionnés dans la liste de droite porte atteinte à la qualité des colorations qu'on peut obtenir ensuite par les procédés ordinaires ; mais uniquement qu'ils les rendent tellement difficiles que l'opérateur se voit souvent obligé d'avoir recours à des colorants spéciaux autres que ceux qu'il aurait désiré employer s'il n'était pas ainsi limité dans son choix.

L'acide osmique est, de tous points, l'un des meilleurs fixateurs qui soient connus; mais, outre qu'il a l'inconvénient de s'attacher obsli-

nément aux éléments des tissus d'où Ton ne peut le déloger que difCcilement par des lavages répétés et où il a une grande tendance à se réduire et à noircir les préparations ; il a aussi le défaut d'avoir une très faible puissance de pénétration, ce qui fait qu'il ne convient en aucune façon pour des objets tant soit peu volumineux.

Dans bien des cas, il convient, pour des raisons de ce genre, de choisir un réactif qui n'a peut-être pas les émînentes qualités de fidélité de fixation que possèdent l'osmium et l'acide chromique, mais qui, en ne mettant pas d'obstacle aux opérations ultérieures, donne en définitive des préparations plus généralement utiles. Tels sont les mélanges picriques et l'acide nitrique, qui se laissent entièrement enlever des tissus par le lavage à l'alcool, et permettent d'obtenir facilement les colorations les plus précises; tel est le sublimé corrosif, qui, loin de gêner les colorations, les facilite dans la plupart des cas. L'alcool est un réactif des plus agréables à employer, et peut rendre des services dans des cas qui ne demandent pas une fidélité minutieuse de fixation. La solution de Merkel est un excellent réactif pour les pièces petites et délicates, mais son action est trop peu énergique pour que nous puissions la recommander pour le travail ordinaire. Les sels chromiques sont quelquefois excellents, et sont tout spécialement indiqués pour la préparation des centres nerveux des Vertébrés.

L'osmium en vapeur ne peut guère être employé que pour des structures membraneuses ou, du moins, très petites. La chaleur donne des résultats qui laissent un peu à désirer sous le rapport de la con^ servation des détails délicats ; on ne s'en sert donc qu'en cas de néces» site absolue.

On hésite à formuler des règles géùérales en une matière où il y a tant d'exceptions obligées. Nous dirons cependant qu*il y a deux de ces réactifs qui sont généralement employés et que nous recommandons tout spécialement pour les travaux ordinaires d'anatomie microscopique et d'embryologie : ce sont le mélange de Flemming et le sublimé corrosif. C'est bien le mélange de Flemming qui, en général, nous a donné de beaucoup les meilleurs résultats. Mais son emploi gêne à un certain degré les opérations ultérieures, et pour ce motif il nous semble que le sublimé conviendra souvent mieux à l'étudiant débutant. C'est un excellent réactif, presque, sinon tout à fait, de premier ordre, et c'est un de ceux qui gênent le moins les opérations ultérieures.