Acide picrique. — Solution saturée

Nous avertissons que Vacide picro-sulfurique doit être évité pour les décalcifications, parce qu'il donne lieu à la formation de sulfate de chaux. On peut employer cependant Tacide picro-nitrique, ou l'acide picro-chlorhydrique.

640. Phloroglucine (ândeer, CentralhL f. d. med. Wiss., n. 12, 33, p. 193, 579; Intern. Monatsch., I, p. 350; Zeil. f. wiss. Mik., 1885, p. 375, 539). — Andeer recommande un mélange de phloroglucine avec de l'acide chlorhydrique. Il prend pour des os de Batraciens, 5 à 10 p. 100 d'acide; pour des Ghéloniens et des Oiseaux, 10 à 20 p. 100 ; pour des Mammifères, 20 à 40 p. 100. Dans ces mélanges les os sont décalcifiés en peu d'heures. Ils y deviennent si tendres qu'il est nécessaire de les durcir par la suite.

Haug [Zeit. f. wiss. J/iA;., YIII, 1, 1891, p. 8) explique que la phloroglucine n'agit pas en elle-même comme dissolvant des sels calcaires; son rôle dans les mélanges est de protéger de telle façon les éléments des tissus contre l'action des acides minéraux que ceux-ci peuvent être employés à des doses plus fortes qu'on ne pourrait le faire sans cette adjonction. Haug recommande la marche suivante :

1 gramme de phloroglucine est ajouté à 10 ce. d'acide nitrique pur (pas fumant, densité 1,4). On chauffe très graduellement tout en agitant doucement. Il se forme une solution (vraisemblablement de nitrate de phloroglucine). On allonge cette solution de 100 ce. d'eau et on ajoute 10 ce. d'acide nitrique. On obtient ainsi une solution contenant 20 p. 100 d'acide, ce qui est la bonne dose. (On peut allonger d'eau jusqu'à avoir en tout 300 ce, si l'on ajoute en même temps la proportion voulue d'acide, mais il ne faut pas dépasser ce point sous peine de voir diminuer l'action protectrice de la phloroglucine.)

La marche de la décalcification dans ce mélange est extrêmement rapide et doit être surveillée. Des os fœtaux ou jeunes deviennent tout à fait tendres en une demi-heure ; de petits morceaux d'os vieux et durs (tels que le fémur, le temporal) le deviennent en quelques heures. Les dents demandent plus de temps. Si l'on est pressé, on peut employer pour ce tissu une solution contenant 38 à 45 p. 100 d'acide nitrique.

Après décalcification on lave pendant deux jours à Teau courante.

On peut également faire la solution avec de l'acide chlorhydrique au heu d'acide nitrique. On prend alors 30 p. 100 d'acide, et l'on ajoute 0,5 p. 100 de chlorure de sodium.

Veut-on une décalcification lente, on peut prendre ou bien une

solation contenant seulement 2 à S p. 100 d'acide nitrique ; qvl bien un mélange contenant une partie de phloroglucine, 5 d'acide nitrique, 70 d'alcool, et 30 d'eau distillée.

DÉSILICIFICATION

541. Acide àuorhydrique (Mayeb, Zool. Anzeig.^ 1881, p. 593). — On met les objets à désilicifîer dans un récipient de verre enduit de paraffine. On ajoute de Tacide fluorhydrique goutte à goutte, en veillant soigneusemeut à ne pas s'exposer à ses vapeurs. De petits fragments d*éponges siliceuses peuvent être désilicifiés en quelques heures, une Wagnerella borealis en quelques minutes. Les tissus ne sont pas endommagés.

Nous pensons que personne n'entreprendra cette opération si dangereuse à moins de nécessité absolue. Des éponges siliceuses peuvent très bien être coupées au microtome sans désilicidcation ; les spicules se brisent devant le couteau.

dépigmentation; blancuiment

642. Emploi du chlore (Mayer, MiUh. Zool. StaL Neapel, 1881, p. 8). — On met les objets à décolorer dans l'alcool de 70 à 90**. On ajoute assez de fragments de chlorate de potasse pour couvrir le fond du flacon. On ajoute avec une pipette quelques gouttes d'acide chlorhydrique; il se dégage bientôt du chlore, reconnaissable à sa couleur verte ; on agite alors le mélange et l'on chauffe si le dégagement de chlore n'est pas suffisamment énergique. La plupart des objets peuvent cependant être décolorés en une demijournée sans l'application de la chaleur. Les tissus ne souffrent nullement.

Au lieu d'acide chlorhydrique, on peut employer l'acide nitrique; en ce cas Tagent décolorant est l'oxygène au lieu du chlore.

La méthode de décoloration par le chlore fut imaginée pour blanchir des préparations qui ont été noircies par l'action excessive de l'osmium ; on peut l'appliquer à la décoloration d'organes pigmentés (yeux d'Insectes, etc.).

643. Emploi du chlore (Marsh, Section Cutting, p. 89). — Marsh fait dégager du chlore dans un flacon en traitant des cristaux de chlorate de potasse avec de l'acide chlorhydrique fort, et conduit le gaz à travers un tube de verre courbé deux fois à angle droit jusqu'au fond d'un autre flacon contenant les objets à décolorer.

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544. Eau de chlore (Sargent, Journ, Hoy, Mie, Soc, 1883, p. 151).

Chlorate de potasse 1 gr. 5

Eau 28 ce.

Acide chlorhydrique X gouttes.

Faire macérer dans cette solution pendant un ou deux jours. Nous faisons observer que ce procédé n'est applicable qu'à la préparation de parties de squelette, les tissus mous étant détruits par ce traitement, qui ne revient guère à autre chose qu'à un blanchiment par Teau de Javelle.

545. L'acide nitrique est connu pour avoir une action plus ou moins dissolvante sur les pigments animaux. Il faut le prendre plutôt fort, 5 à 10 p. 100, ou plus.

548, Chloroforme. — D'après Sazepin, le chloroforme sert à éclaircir la chitine fortement pigmentée ; en ajoutant après quelque temps une goutte d'acide nitrique concentré, on arrive à une décoloration complète. (Voyez au chapitre des Arthropodes.)

547. Mélange de Grenadier pour yeux d'Arthropodes et autres (Grenacuer, Abh. nat. Ges. Uall-a-S,^ Bd. XVI ; Zeit. f. wiss. Mik., 1885, p. -244).

Glycérine 1 partie.

Alcool à 80 degrés 2 —

EL pour 100 volumes de ce mélange, 1 à 3 d'acide chlorhydrique.

Le pigment se dissout dans ce liquide et forme une teinture qui, en douze à vingt-quatre heures, produit la coloration des noyaux de la

piT[>aration.

548. Créosote (Pouchet, Journ. de VAnat.^ 1876, p. 8 et suiv.). — D'après le mémoire que nous citons, il parait que la plupart des pigments animaux granuleux sont solubles dans la créosote.

549. Eau oxygénée (peroxyde d'hydrogène) (Pouchet, Précis de iM. DuvAL, p. Î234). — L'eau oxygénée est un décolorant assez énergique. Pouchet conseille de faire macérer les pièces dans la glycérine additionnée d'eau oxygénée (5 ou 6 gouttes pour un verre de inoatre de glycérine).

On peut souvent se procurer de Teau oxygénée chez les coiffeurs, qui s'en servent comme teinture pour les cheveux, et en vendent sous le nom d* « Auréoline », etc.

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Nous avons indiqué au numéro 40 le procédé d'OvERTON pour le blanchiment de tissus noircis par Tosmium.

550. Peroxyde de sodium (Carazzi, Zool, Anz,, 444, d894, p. 138). — Le peroxyde de sodium, Na'O*, est une poudre jaunâtre qui au contact de Teau pure dégage de l'oxygène et donne à Teau une réaction alcaline. Avec Teau acidifiée cette alcalinité du liquide ne se produit pas. Carazzi recommande de mettre une solution d'acide tartrique ou acétique à 10 p. 100 dans un récipient convenable, puis de mettre sur le fond du récipient une petite quantité de peroxyde, puis d'ajouter avec précaution de l'alcool (à 70 p. 100) à la surface du liquide, et de mettre dans cet alcool les objets (préalablement imbibés eux-mêmes d'alcool). L'oxygène se dégage du fond du liquide, monte et se dissout dans l'alcool, blanchissant les objets qui s'y trouvent.

Il ne faut pas employer d'acides minéraux, et il ne faut pas ajouter de grandes quantités de peroxyde à une petite quantité de liquide, la réaction dans ces conditions étant très violente.

551. Acide sulfureux. — M. le professeur Gilson me fait observer que l'anhydride sulfureux (SO*) en solution alcoolique est un réactif très commode pour décolorer les pièces fixées par le bichromate. 11 suffit de quelques gouttes.

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552. Méthodes générales. — Il n*existe pour ainsi dire pas de méthodes embryologiques spéciales, et la plupart des méthodes générales qui ont été exposées dans la première partie de cet ouvrage sont applicables à Tétude des embryons. Nous croyons cependant devoir donner avec quelques détails les modes de préparation et d'étude d'un certain nombre d'embryons, pour que ces exemples puissent servir de guide au débutant dans les recherches qu'il entreprendra.

Pour un assez grand nombre d'œufs d'animaux, surtout parmi les Invertébrés, on peut suivre, à l'état vivant, le développement sous le champ même du microscope, en examinant les œufs par transparence ou à la lumière directe. Tels sont, par exemple, les œufs de certains Poissons osseux, de l'Épinoche, de la Perche, du Macropode et de plusieurs espèces pélagiques, les œufs du Chironomus, de VAsellus aquaticus, des Ascidies, du Planorbe, de beaucoup de Cœlentérés, etc. On devra, autant que possible, suivre les phases du développement sur les œufs vivants et dessiner les différents stades, afin d'avoir des points de repère lorsqu'on étudiera les œufs par la méthode des coupes.

Pour examiner les œufs des animaux aquatiques, il suffit de les placer sur une lame de verre dans une goutte d'eau douce ou d'eau de mer, suivant l'habitat de l'animal, et de les recouvrir d'une lamelle munie à ses angles de petites boulettes de cire à modeler, ce qui permet d'exercer une pression modérée comprimant légèrement les œufs et les maintenant en place. Souvent de simples petits morceaux de papier, d'épaisseur variable, interposés entre le porte-objet et la lamelle, suffisent pour empêcher les œufs d'être écrasés. Ce dispositif

permet de faire tourner les œufs et d'examiner leurs différentes faces, en imprimant de légers mouvements à la lamelle. Il a aussi le grand avantage de pouvoir faire arriver au contact des œufs différents réactifs dont on règle Faction à Taide d'une petite bande de papier à filtrer placée sur le bord de la lamelle, du côté opposé à celui par lequel on fait arriver le réactif. On peut, de cette manière, obtenir des préparations permanentes d'objets délicats en les soumettant successivement aux réactifs durcissants, colorants, etc.

Lorsque les œufs sont un peu volumineux, on les placera sur une lame portant une excavation ; s'ils sont très résistants, l'emploi des compresseurs pourra rendre de grands services.

Certains œufs d'Insectes et d'Arachnides, qui sont complètement opaques quand on les examine soit à la lumière transmise, soit à la lumière directe, deviennent transparents si on les place dans une goutte d'huile ; en ayant soin de laisser leur surface simplement imprégnée d*huile, ils continuent à se développer normalement. (Méthode du professeur Balbiani.)

Les petits artifices que nous venons d'indiquer brièvement ne permettent en général d'étudier que les formes extérieures des embryons, à moins que ceux-ci ne soient très petits et très transparents, auquel cas on obtient des coupes optiques en faisant varier la mise au point du microscope. Mais il faut presque toujours en arriver à la méthode des coupes, à laquelle on doit les progrès rapides de l'embryogénie depuis quelques années. De même que pour les autres tissus, les œufs et les embryons ne peuvent être coupés qu'après avoir été convenablement fixés et durcis.

553. Fixation et durcissement. — Gomme en histologie, la fixation est un point des plus importants de la technique embryologique. Nous avons déjà indiqué, dans les chapitres ii, m, iv et v, les meilleurs agents fixateurs pour les embryons ; nous n'aurons donc plus qu'à mentionner dans ce chapitre quelques formules spéciales. Nous ferons cependant observer que le choix de la méthode de fixation doit dépendre de la nature et du volume de l'embryon ainsi que du genre de recherche qu'on se propose. C'est ainsi que l'acide osmique, seul ou associé à d'autres agents, fixe très bien les petits embryons, tandis qu'il ne vaut rien pour les objets plus volumineux. L'acide osmique a une tendance à diminuer le volume des éléments cellulaires, aussi fait-il nettement apparaître les fentes qui séparent les feuillets blastodermiques, les cavités et les canaux en voie de formation ; il noircit fortement les matières grasses et par conséquent

les éléments vitellins, la myéline, etc. ; cet agent fixateur rendra donc de grands services pour Tétude du développement du système nerveux.

L'acide chromique est indispensable pour l'étude de la forme extérieure des embryons ; il accuse très bien les creux et les saillies en conservant admirablement les rapports des parties, mais il a le grand inconvénient d'altérer le plus souvent les éléments cellulaires et d'empêcher leur coloration ultérieure.

Les liquides fixateurs qui ont pour base Tacide picrique, à Tinversé de l'acide osmique, gonflent légèrement les éléments et tendent à effacer les espaces qui peuvent exister entre eux ; malgré cela, Tacide picrique et principalement le liquide de Kleinenberg sont parmi les meilleurs fixateurs ceux qu'emploient de préférence les embryologistes.

Voici une formule de Rabl {Zeit, f. wiss. Mik., XI, 2, 1894, p. 168), que cet auteur a expérimentée longuement avec succès, pour des Vertébrés surtout, mais qu'il recommande également pour d'autres objets :

Sublimé plalinique»

Chlorure de platine, 1 p. 100 1 volume.

Sublimé, solution saturée aqueuse 1 —

Eau distillée 1 —

Pour bien des blastodermes et embryons jeunes (Poissons, Amphibiens. Oiseaux, Mammifères). Les embryons de Téléostéens avancés demandent à être fixés dans le mélange à chaude pour éviter la rupture de muscles et le ratatinement de la chorda. Le sublimé picrique de Rabl a été donné au n* 68. Rabl le recommande surtout pour des embryons plutôt âgés, embryons de Poulet à partir du troisième ou quatrième jour, et pour d'autres embryons de semblables dimensions. Pour les deux, fixation de douze à quarante-huit heures, lavage deux heures dans l'eau.

Le durcissement des embryons se fait comme celui des petits animaux et des tissus délicats. On devra préférer la coloration en masse à Taide d'un agent bien pénétrant tel que le carmin de Grenacher ou le carmin aluné acide ou par l'hémalun ou l'hémacalcium de Mayer. Gomme masse à inclusion, nous avons toujours obtenu d'excellents résultats avec le collodion durci ensuite dans le chloroforme suivant la méthode de Viallanes, ou mieux avec la paraffine. Gette dernière permet la confection de coupes plus minces et plus égales, et l'emploi de l'admirable microtome à bascule de la Société des instruments de

Cambridge {Rocking microtome) qui nous paraît être actuellement rinstrument le plus pratique pour les embryologistes, puisqu'il permet, en quelques minutes, de débiter un embryon en un grand nombre de coupes, toutes d'e'gale épaisseur, et rigoureusement disposées en série continue.