FE

Après 5 jours de culture, il y a 53 colonies sur 100 qui ne sont pas dévelloppées. — 6 — — — 10 es LE = = ht = == 30 == — — — 8 — — == 11 — —

— 10 — = = 9 — nn — ENT PTS a Es = APTE = 15 —= — —- — 11 — — = 0 = — —

= 15 0 es er ea

De telles données sont cependant loin d’être absolument générales: dans la pratique, on constate souvent des divergences très étendues. Il faut ne les utiliser qu'avec une confiance toute relative.

En maintenant les cultures à une température plus élevée, on arrive plus vite à faire une numération dans de bonnes conditions. En prenant certaines précautions dans la confection du milieu, comme ila été dit I, page 243, en se servant de gelée contenant au moins 15 p. 100 de gélatine, il est possible de mettre les cultures dans une étuve réglée à 23° ou au moins à 22°; le développement est beaucoup plus rapide; après quatre ou cinq jours, on peut faire une numération définitive. Mais 11 suffit d'un petit écart pour détruire les cultures.

Pour faire cette numération, on se sert avantageusement d’une simple ardoise, ou d’une ardoise portant un quadrillage blanc au centimètre carré, facile à faire. Avec les cultures en boîtes de Petri, on retourne la boîte et on compte les colonies, en les marquant au fur et à mesure d'un point d'encre pour ne pas faire double emploi.

Pour les cultures assez.peu riches en colonies, on compte toutes les colonies d’une culture, pour celles plus riches, on fait la numération dans la moitié ou le quart seulement; enfin, pour celles qui montrent de nombreuses colonies, on peut souvent établir une moyenne par centimètre carré, en comptant sur cinq ou six centimètres carrés, en des endroits divers de la culture, et établissant une moyenne. On peut se servir d'un papier ou d’une ardoise sur lesquels on a tracé le dessin représenté I, fig. 136, p. 292, qui permet d'opérer dans des conditions très variées.

Pour compter les colonies dans un centimètre carré, on place la culture sur l’ardoise portant une division en centimètres carrés, ou on se sert d’une lame porte-objet portant en son milieu, tracés au diamant, quatre carrés de 1 centimètre de côté, que l’on superpose à la face postérieure de la boîte de Petri. On compte. en marquant de pointss d'encre, le nombre de colonies que renferment ces carrés, en opérant à des endroits différents, choisis comme représentant en apparence une bonne moyenne de colonies, et on établit la moyenne. Avec les boites de Petri, le nombre total est vite obtenu en multipliant cette moyenne obtenue par la surface donnée par la formule +R?. La numéralion peut se faire à l'œil nu ou, au besoin, à la loupe.

D'habitude, on rapporte le nombre des microbes d’une eau au centimètre cube.

Pour que ces dernières opérations aient une précision assez satisfaisante, il est nécessaire d’avoir des boîtes à fond bien plat, de façon que

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la couche de gélatine ait une épaisseur à peu près semblable partout.

Lorsqu'on peut compter toutes les colonies, cette précaution n'est pas nécessaire. \

Les chiffres obtenus sont certainement inférieurs aux chiffres réels. Il est en effet des espèces qui demandent un temps plus long pour se développer; d’autres ne croissent même pas dans la gélatine: D'un autre côté, lorsqu'on utilise des dilulions, si une petite erreur est commise dans la numération, elle se trouve considérablement grossie dans les opérations ultérieures; elle n’a toutefois souvent qu'une importance minime, par la raison qu'ici les unités sont toujours d’un ordre très élevé.

Malgré de tels inconvénients, la numération des colonies fournit un élément très précieux pour l'appréciation définitive.

Cultures sur plaques de gélose. — Si la gélatine a des avantages comme milieu de culture pour la confection des plaques, elle a aussi des inconvénients. Les principaux sont la liquéfaction rapide du milieu par certaines espèces et l'impossibilité de soumettre les cultures à une température convenable.

Certaines espèces produisent une liquéfaction si rapide de la gélatine qu'il devient impossible d'utiliser les plaques parfois dès le troisième ou quatrième jour des cultures, si les colonies liquéfiantes sont un peu nombreuses. À ce moment, beaucoup de colonies n’ont pas apparu ou sont encore trop petites pour pouvoir être facilement reconnues. Les résultats obtenus sont inexacts.

D'un autre côté, l'impossibilité de mettre les cultures à l'étuve, à une température fav orable au bon développement de bien des germes, fait que l'apparition et l'accroissement des colonies sont toujours relativement lents. Il est difficile de se faire vite une idée, même approximative, du nombre des colonies à obtenir. C’est un grand obstacle lorsque le temps presse.

Pour remédier à ces désavantages, on a remplacé la gélatine par la gélose, dans la confection des plaques (#.

Avec la gélose, il devient possible d'éviter la destruction des cultures par une liquéfaction des plaques, les espèces liquéfiant la gélose dans ces conditions aérobies étant plutôt rares, el d'exposer les cultures à l'étuve, à une température hâlant le développement des colonies, permettant par conséquent d'obtenir plus vite les résultats qu'ure eau peut donner. Il devient possible d'observer en deux ou trois jours le développement de la majorité des colonies qui peuvent pousser dans certaines conditions. C’est un avantage qui semble très réel; 1l reste à en apprécier la valeur.

Si l’on compare les résultats d’une numération de cultures sur gélose, après quarante-huit heures à 47°, avec ceux que donnent, dans le même laps de temps, des cultures sur gélatine à 20°, l'avantage est cerlaine-

(1) Hesse et Nrepxer, Die Methodik der bakteriologischen Wasseruntérsuchung (Zeitschr. für Hygiene, XXIX, 1898, p. 494). — Jourerovrreu, Étude sur l'emploi de l’agar-agar pour les analyses bactériologiques quantitatives de l’eau. Thèse de Genève, 1899. — Warpaum, Zur Methodik der bakteriologischen Wasseruntersuchung, mit Angaben über Bereitung der Nähragars (Centralbl. für Bakt., XXX, 1901, p. 790), — Prazz, Beitrag zur Kenntniss der Nährbôüden für die Bestimmung der Keimzahl im Wasser (Arb.aus dem kaiserl. Gesundheitsamte, XVIII, 1902, p. 436). — GaGe et Puezrs, Untersuchungen von Nährbôüden zur quantitativen Schätzung von Bakterien im Wasser und Abvwässern (Centralbl. für Baktl., XXXII, Orig., 1902, p. 920).

ment de beaucoup pour la gélose. Mais avec le temps les différences s'atténuent; des numérations faites vers le huitième ou dixième jour donnent l'égalité; du douzième au quinzième jour même, l'avantage est pour la gélatine. Quoique l'absence dela liquéfaction permette de conserver les cultures sur gélose plus longtemps et d'attendre le développement d'espèces très lentes à pousser, la gélose ne reprend plus le pas sur la gélatine.

Mais le point important sur lequel il est nécessaire d’insister est que les colonies sur gélose offrent beaucoup moins de particularités dis- Linctives, de caractères utiles pour la diagnose que les colonies sur gélatine. Un très grand nombre des premières sont très semblables, très peu différenciées, ne montrent pas les signes distinctifs si précieux qu'on est habitué à rencontrer avec la gélatine et qui rendent tant de services pour la détermination spécifique. Si, pour la simple numération des colonies, la gélose peut encore aller de pair avec la gélatine, elle ne peut pas soutenir la comparaison au point de vue de la diagnose des espèces.

Pour user de gélose, on se sert de la même manière de faire qu'avec la gélatine. On prend une gelée faite avec 1£',50 de gélose, 2 grammes de peptones et100 grammes d’eau (I, p. 246). D'après Hesse et Niedner(1), ou obtiendrait les meilleurs résultats en employant, pour 100 d’eau, 1 de gélose et 1 de milieu de Heyden, albumose pure obtenue d’albumine d'œuf. Mais les bonnes peptones habituelles donnent des résultats bien semblables. À cé point de vue, comme du reste avec la gélatine, il y a de très grandes différences avec les peptones; il est nécessaire de faire des essais pour fixer son choix.

Les tubes de gélose sont fondus à 80°, puis ramenés très peu audessus de 40° pour l'ensemencement de l’eau. Seulement le milieu est assez visqueux; la répartition complète est plus difficile qu'avec la gélatine. Les quantités d'eau à ensemencer sont déterminées comme il a été dit plus haut.

La couche de gélose adhérant mal au verre, il est à recommander d'ajouter au milieu, avant stérilisation, quelques gouttes d’une solution de gomme arabique.

On coule surtout en boîtes de Petri, aussi en tubes d'Esmarch.

Les boîtes sont mises à l’étuve, couvercle en bas, pour empêcher la dessiccation.

On peut faire la numération après quarante-huit heures, en procédant comme il a été dit pour les plaques de gélatine.

Aux désavantages d'emploi de la gélose cités plus haut, il fautencore ajouter l'influence défavorable des températures de 40° sur certains microbes très sensibles et l’action d'une température d’étuve, 38°, moins propice pour beaucoup que la température de 20° environ. La raison donnée, qu'une température de 37° favorise plus le développement des Bactéries susceptibles de se développer dans l'organisme, est ici plutôt spécieuse, puisque ce que l'on recherche c’est un résultat global, les indications particulières devant être fournies par d’autres méthodes complémentaires.

(1) Hesse et Nienner, Die quantitative Bestimmung von Bakterien in Flüssigkeiten (Zeitschr. für Hygiene, LIII, 1906, p. 259).

Cependant, on doit reconnaitre que la gélose peut ici rendre de très grands services en divers cas; quand on “veut aller très vite d'abord, puis quand on courrait le risque de voir fondre la gélatine pendant les opérations d'analyse, lorsque la température pêut s'élever au-dessus le 22°

Comme conclusion, il est surtout à recommander d’user d’une façon courante de gélatine pour les cultures sur plaques d'eaux, et de ne recourir à la gélose que quand sont Hnposees les conditions particulières qui ont été énoncées.

Un point important est que les milieux que l’on emploie, gélatine ou gélose, aient une constance de composition suffisante pour que l'on obtienne des résultats à peu de chose près semblables avec les milieux de diverses préparations auxquels on est forcé de recourir. Les plus grands soins doivent être apportés à la préparation des milieux. Il est préférable qu'ils soient toujours faits par la même personne: c’est le meilleur moyen de les avoir à peu près semblables: je m'astreins toujours à les préparer moi-même. Il faut surtout apporter la plus grande attention à la neutralisation; un milieu acide ou un peu trop alcalin montre souvent des différences très grandes en moins dans le nombre des colonies obtenues.

J'emploie toujours une méthode d'étalonnage pour la gélatine : Je n'use d’une gélatine de nouvelle fabrication qu'après avoir préalablement comparé les résultats qu'elle donne, pour l'analyse d'eau, avec ceux que donne le milieu préparé précédemment ; ce qui est très simple en opérant avec une même eau. Ces gelées, préparées par une même personne, dans des conditions en apparence identiques, présentent souvent, dans celte pratique, des différences notables, dues à des particularités minimes de la facon d'opérer. C'est ce qui montre combien il est difficile, illusoire même, d'arriver, en procédant de la manière habituelle, à obtenir une uniformisalion absolue des milieux à employer ; on peut seulement chercher à se rapprocher le plus péssible de condiions déterminées, ce qui semble bien suffisant dans la pratique pour pouvoir fructueusement comparer des résultats obtenus par des expérimentateurs divers.

Recherche des anaérobies.

Dans l’analyse bactériologique de l’eau faite comme il vient d’être dit, les seules colonies qui se développent appartiennent à des espèces microbiennes, aérobies, pouvant se développer dans les conditions

employées. Ilestun groupe de Bactéries que l’on ne peut Jamais espérer

pouvoir isoler de cette facon : ce sont les espèces anaérobies.

De telles espèces existent cependant dans les eaux.

Depuis assez longtemps, on avait signalé, dans les vases ou dépôts de certaines eaux, certains anaérobies pathogènes, Vibrion seplique (p.12), Bacille du lélanos (p. 34), Bacillus enteritidis sporogenes (p. 47); puis quelques saprophytes, particulièrement du groupe du Bacillus butyricus. On ne s’était nullement préoccupé d’une signification ou d'une indication à utiliser.

C'est Vincent (1) qui a le premier attiré l'attention sur les espèces de cette catégorie, en faisant remarquer que les eaux contaminées étaient toujours plus ou moins riches en microbes anaérobies. Guillemard (2) a montré qu'on pouvait obtenir des indications intéressantes d'une évaluation numérique des anaérobies et surtout du rapport entre leur nombre constalé et celui des aérobies, rapport que Vincent (3) propose de nommer l'ëndice anaérobique.

Ces anaérobies des eaux ont bien souvent une origine intestinale, provenant d'apports de matières fécales, de purins, d'eaux d'égout. Ils peuvent venir aussi de matières organiques en putréfaction, animales ou végétales, où les processus d’anaérobiose sont communs.

De telles espèces sont par contre absentes ou très rares dans les eaux pures, bonnes eaux de sources ou de cours d’eau non contaminés. L'eau en général n’en contient que lorsqu'elle a reçu des apports qui en renferment.

La constatation de la présence d’anaérobies dans l’eau, leur nombre, peuvent alors donner de bonnes indications, montrant l'apport de contaminalions de l’une ou l’autre de ces origines et pouvant faire apprécier son intensité. D’où l'importance de la recherche des Bactéries de cette catégorie.

Il y a lieu cependant de distinguer ici les anaérobies stricts ou obligés et les anaérobies facultatifs. Beaucoup de ces dernières espèces existent dans les eaux, poussent en cultures aérobies et sont alors comptées dans les résultats de la numération des cultures ordinaires, faisant ainsi, et pour une large part, double emploi. Parmi les espèces qui se comportent ainsi, on peut par exemple citer le Colibacille et les espèces du même groupe, qui se trouvent d'ordinaire en grand nombre dans les eaux souillées. Il y aurait donc intérêt à employer des procédés ne donnant que les anaérobies stricts, comme le fait remarquer Vincent.

On peut confectionner des plaques suivant l’une ou l'autre des méthodes ordinaires qui viennent d’être citées et les placer dans un

des appareils décrits I, p. 294, où l’on peut faire le vide ou faire arriver -

un gaz inerte. Il est plus simple de recourir aux milieux privés d’air par ébullition ou par addition de substances absorbant loxygène (TE, p. 302).

Le simple procédé de Vignal (I, p. 300) est assez pratique. La gélatine, bouillie au préalable, puis refroidie vers 35° sous une couche d'huile stérilisée, est ensemencée en proportions voulues avec l’eau à examiner, puis aspirée dans un long tube de verre de 3 à 4 millimètres de diamètre, stérilisé d'avance, dont l'extrémité plongeant dans la gélatine est étirée, l'autre fermée par de la ouate ; après remplissage, on fond l'extrémité étirée et la partie voisine du niveau supérieur de la gélatine. Avec une dilution suffisante, les colonies qui poussent en anaérobiose sont assez éloignées les unes des autres; pour les isoler, on coupe le tube au niveau voulu; les fragments peuvent encore

{1} Vincexr, Importance de la recherche des microbes anatrobies dans l'analyse des eaux de boisson (C. R. de la Soc. de Biol., 27 mai 1905).

(2) Guisremarp, La culture des microbes anatrobies appliquée à l'analyse des eaux (Ann. de l'Inst. Pasteur, XX, 1905, p. 155).

{3) Vixcenr, Recherches sur les microbes anaérobies des eaux (/Zbid., XXT, 1907, p- 62).

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être conservés, en obturant aussitôt à la cire leurs extrémités ou-

vertes.

Guillemard recommande l'emploi d'une pipette de Pasteur un peu crande, de 9 à 10 centimètres cubes, effilée à sa partie inférieure et étranglée à sa partie supérieure pour y loger un tampon d'ouate. La pipette est branchée sur un appareil à hydrogène et remplie d'une gélose à 1 p. 100, ensemencée et solidifiée sous le courant d’hydrogène. L’effilure et l'étranglement sont fermés à la flamme après l'opération.

Vincent préfère avec juste raison la gélatine à la gélose, en raison surtout des différences plus marquées que présentent les colonies dans ce milieu.

Il conseille d'user d’une gélatine à 10 à 15 p. 100, additionnée de 1 p. 100 de glucose et 1 p. 100 de glycérine, à laquelle on ajoute, au moment de s’en servir, une petite quantité de sulfo-indigotate de soude (I, p. 302). L'eau à étudier est ensemencée, en proportions voulues, suivant sa souillure probable. Pour des eaux très impures, on emploie de 1/10 à 1/100 de centimètre cube; pour les autres, de 1/2 centimètre cube à 1, 2, jusqu’à 5 centimètres cubes. Le mélange est aspiré dans une série de tubes de Vignal de 50 centimètres de long qui, après remplissage, sont scellés aux deux extrémités et mis à solidifier dans de l’eau froide.

On pourrait, de cette facon, distinguer les anaérobies stricts des anaérobies facultatifs. Ces derniers forment presque toujours des colonies tassées, ramassées, opaques, blanches ou grises. Les colonies d’anaérobies stricts ont presque toujours des contours diffus, sont muqueuses, floconneuses, émettant parfois des prolongements très ténus ; elles donnent assez souvent des gaz. On peut aisément les compter et les isoler par section du tube.

Il sera parlé plus loin de leur signification et de leur spécification.