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Méthode des cultures sur plaques.

La méthode à recommander est certainement la vraie méthode des cultures sur plaques. Il faut toutefois reconnaître que la manière de faire

(1) Miquer, Annuaire de l'Observatoire de Montsouris, 1880 à 1881, et Analyse bac=" tériologique des eaux. Paris, 1891, Gauthier-Villars.

de Miquel conduit peut-être à des résultats plus complets et permet d'obtenir des espèces que né donnent pas les cultures sur les gelées employées pour les plaques. Certaines Bactéries semblent en effet ne pas pouvoir croître sur ces gelées, tandis qu'elles végètent très bien dans les bouillons: en particulier plusieurs ferments de l’urée décrits par Miquel (p. 537) se comportent de cette facon. En outre, 1l en est qui demandent pour commencer à se multiplier un temps assez long, de quinze jours à un mois parfois. Or, il est rare que les cultures sur plaques puissent se maintenir aussi longtemps dans un élat convenable pour l'observation ; elles se détruisent presque toujours beaucoup plus tôt, à cause de la présence d'espèces qui liquéfient la gélatine ou de la dessiccation. Comme procédé véritablement scientifique, devant être employé pour les recherches très minutieuses, dans des services largement installés, celui de Miquel serait encore parfois préférable, ou tout au moins pourrait fournir une base plus sûre. Le procédé des cultures sur plaques a pour lui sa commodité excessive, sa grande facilité d'exécution et donne en somme des résultats parfaitement satisfaisants. Complété par certaines méthodes complémentaires d'isolement de quelques espèces importantes et, au besoin, par l'étude générale de l’action des microbes de l’eau sur l'organisme animal, c'est la véritable méthode d'analyse bactériologique de l'eau qui peut entrer dans la pratique courante.

Le milieu à employer pour la préparation des plaques est la gélatine ou la gélose, préparées comme il a été dit I, pages 240 et suivantes.

Pour les plaques, on peut employer la gélatine ou la gélose, non pas indifféremment comme il est dit trop souvent, mais suivant les conditions que l’on doit rencontrer.

Une des principales conditions à faire entrer en jeu iciest la température. Alors que les gelées à base de gélatine fondent vers 22°, même en mettant une forte proportion de gélatine, celles à base de gélose résistent beaucoup plus, ne fondant qu'à des températures supérieures à celles que lon est exposé à subir.

Il suit de là que, si l'on doit travailler à une température qui peut être supérieure à 2°, il n’y a guère à employer la gélatine, mais recourir à la gélose. Au-dessous de 20°, la gélatine convient parfaitement.

De même, si l'on veut soumettre les plaques à la température de l'étuve ordinaire, vers 37°, ou à plus forte raison à des températures supérieures, pour rechercher par exemple les Bactéries qui ne végètent qu'à une telle chaleur, ou bien si l’on veut employer une température d’étuve pour hâter le développement, il est nécessaire d'utiliser la gélose.

Il faut cependant faire remarquer, à ce dernier propos, que la majorité des Bactéries de l’eau n'aiment pas les températures hautes, poussent même mieux vers 20° qu'à 37°. Pour obtenir un plus grand nombre d'espèces et un développement meilleur, un nombre de colonies qui se rapproche le plus de l'exactitude, il semble donc préférable de soumettre les cultures à une température avoisinant 20°, ce qui permet alors l'usage de gélatine.

Cependant, lorsque la température extérieure est élevée, risque, à certains moments au moins, de dépasser 22°, en plein été ou dans les pays chauds par exemple, l'emploi de la gélatine fait courir de grands

risques de destruction des plaques; ou bien il faut recourir à des procédés de réfrigération souvent délicats à installer (I, p. 218). Dans ce cas, l'usage de gélose rend de grands services.

On a beaucoup discuté sur la valeur relative, pour ces cultures d’analyses bactériologiques d'eaux, de la gélatine ou de la gélose, préparées suivant les indications ordinaires ou additionnées de produits spéciaux destinés à leur donner une valeur nutritive plus grande, permettant un développement plus abondant.

Il est de nombreux partisans exclusifs de l'emploi de la gélose, qui proclament son grand avantage. D'autres préconisent non moins exclusivement la gélatine.

Il semble plutôt que l’on doive être éclectique et recourir à l’une ou à l’autre suivant les conditions d'expérience.

Puis, surtout, on ne peut pas comparer les résultats obtenus avec les deux milieux dans le même laps de temps, puisque l'emploi de gélose

comporte l’étuve, celui de la gélatine une température inférieure.

Une très longue pratique montre qu'en usant de milieux préparés avec très grands soins, la gélose ne présente nullement, en laissant de côté la rapidité plus grande du développement, l'avantage qu’on veut souvent lui attribuer, la possibilité d'obtenir le développement d’un plus grand nombre de colonies, un résultat quantitatif plus exact. Le développement peutse faire assurément plus vite avec la gélose ; en quarantehuit heures, à 37°, on obtient autant de colonies qu'après six à sept jours avec la gélatine : : mais, à la fin, ce dernier milieu prend le dessus, et en faisant la numération au dixième, ou mieux au douzième jour, on constate ou une égalité ou un avantage au profit dela gélatine.

Enfin et surtout, commeila été dit I, p. 290, les caractères des colonies sont bien moins particuliers, bien moins distincüifs sur gélose que sur gélatine. C’est là ici un point extrêmement important; avec une certaine habitude, il devient bien plus aisé de reconnaitre un grand nombre d'espèces à l'inspection de leurs colonies en cultures sur plaques de gélatine, alors que les caractères différentiels sont beaucoup plus rares sur gélose.

Quel que soit le produit employé, on ne peut pas regarder comme rigoureusement identiques des milieux préparés avec des substances différentes ou dans des conditions autres. Il est certain que les géloses ou surtout les gélatines d’un côté, les peptones de l’autre, ne peuvent pas être considérées comme formant des produits définis, toujours rigoureusement identiques à eux-mêmes ; ils’en faut de beaucoup, même quand on compare des produits de même marque mais d'une autre fabrication. De plus, dans la préparation des milieux, il est d’autres conditions, actives aussi, qui dépendent de lexpérimentateur et peuvent aisément varier ; telles sont la neutralisation, le chauffage, etc.

Ceci fait qu'avec de tels produits il n’est pas possible de songer à une

uniformisation rigoureuse des milieux, comme on peut l'obtenir, par exemple, avec des milieux composés uniquement de produits chimiques bien définis. L’uniformisation serait très désirable, puisqu'elle permettrait une comparaison exacte de résultats énoncés par des expérimen- .tateurs différents, mais il n'estpas possible de l’obtenir. On ne peut pas songer à formuler un de ces milieux dont la composition puisse être considérée comme rigoureusement constante. Il faut alors se borner à

admettre un type de milieu dont il serait facile de chercher à se rappro-

cher le plus possible.

C'est que le milieu d’abord, puis les conditions dans lesquelles on opère, influent sur les résultats; en particulier, le nombre des colonies obtenues peut varier suivant le cas. D’où, résultats différents obtenus par les observateurs selon des variantes dans la manière de faire; les données peuvent donc ne pas être tout à fait comparables.

Si cependant l’on se conforme rigoureusement aux conditions prescrites, surtout si l’on apporte à la confection du milieu tous les soins voulus en se conformant toujours aux modus faciendi admis, on arrive à réduire les différences à fort peu de chose, et à pouvoir raisonnablement compter sur les résultats constatés.

L'emploi de la gélatine pour les cultures sur plaques d’eaüx paraît bien devoir être préféré pour les raisons données plus haut.

Cultures sur plaques de gélatine. — La marche à suivre pour la préparation des cultures sur plaques de gélatine a été exposée précédemment (I, p. 281). La gelée qui doit servir renferme de 8 à 10 p. 100 de gélatine, lorsque la température est assez basse ; en été, il faut employer 12 et jusqu'à 15 p. 100. Les gelées plus concentrées donnent un certain retard dans le développement ; les colonies y sont un peu plus petites et la liquéfaction progresse plus lentement lorsqu'elle se produit. Des gélatines plus fortes que les dernières ont plutôt des inconvénients. IL vaut mieux se servir de gélatine faite avec de l’eau et des peptones que de gélatine au bouillon de viande; cette dernière est trop favorable à la végétation de certaines espèces très liquéfiantes, surtout le Bacillus {luorescens liquefaciens qui peut détruire trop vite les cultures.

Le milieu doit être légèrement alcalin ; le papier de tournesol rouge doit passer franchement à la nuance violacé bleuâtre, l'expérience, démontrant que, dans ces conditions, on obtient le maximum de colonies.

Onprocèdede la façon suivante : un nombre suffisant de tubes, préparés comme il a été indiqué, renfermant de 15 à 20 centimètres cubes de gélatine, sont mis à fondre au bain-marie et ramenés à une température de 35° à 40°, On fait alors l'ensemencement. La prise d'eau se fait à l’aide d’une petite pipette, soit graduée exactement, soit confectionnéeavec un tube de verre étiré et vérifiée, donnant 20 gouttes au centimètre cube, que l'on a soigneusement stérilisée à l'avance. On en prépare une petite provision qui est stérilisée en bloc dans un étui métallique où l’on puise au fur et à mesure du besoin. Les conditions qui doivent être

employées pour recueillir l’eau à étudier seront exposées plus loin

(p. 820). Le flacon est fortement agité, au préalable, de manière à réparlir les Bactéries dans la masse, le plus uniformément possible. On plonge la pipelte par l'orifice du flacon, l'extrémité effilée tournée en bas, et on laisse monter le liquide jusqu’à une certaine hauteur. On débouche un tube de gélatine et, à l'aide de la pipette, on y laisse tomber la quantité d'eau voulue que l’on mélange intimement à la gelée, en secouant légèrement le tube et le roulant fortement entre les deuxmains demanière à éviter le plus possiblela formation de bullesd'air; on doit toujours s'assurer que le mélange est bien opéré en examinant le tube par transparence, toute striation doit avoir disparu. La quantité d'eau à employer varie forcément avec la richesse, présumée au moins, en Bactéries. Il faut en effet arriver à obtenir, dans les cul-

tures, des colonies suffisamment isolées les unes des autres pour pouvoir les compter assez aisément à l'œil nu ou sous la loupe, etau besoin pour pouvoir isoler celles que l'on désire soumettre à des procédés d’investigation ultérieurs, surtout examen microscopique et cultures.

Or, pour faire convenablement une numération, dans les conditions habituelles, il est nécessaire que les plaques ne renferment guère plus de 300 à 400 colonies au maximum. Ce chiffre est même bien élevé pour permettre de faire des prélèvements de colonies, qui sont alors bien rapprochées; il est préférable de se tenir au-dessous.

D'un autre côté, les résultats semblent meilleurs lorsqu'on met en culture une quantité d’eau un peu grande, la plus grande possible pour ne pas dépasser ces limites.

Avec des eaux peu microbiennes, on peut ensemencer 1 centimètre cube, 2 centimètres cubes même. Avec des eaux plus riches, il faut en mettre moins, et de moins en moins à mesure que l’on a affaire à des eaux plus chargées ; on ensemence 1/2, 1/4,1/10,1/20 decentimètre cube, soit avec des pipéttes jaugées pour de telles quantités, soit en usant de pipettes donnant exactement 20 gouttes au centimètre cube et ensemençant alors 10, 5,2, 1 gouttes. Même avec des eauxtrès microbiennes, eaux de rivières, de canaux, de puits, surtout eaux de mares ou d'égout, eaux-vannes, il faut pousser plus loin la division. On dilue alors l’eau à étudier dans une une déterminée d’eau stérilisée de façon à avoir unedilution à 1/10ou1/100,en ajoutant 1 centimètre cubed’eau examiner à 9 centimètres cubes d’eau stérilisée, ou 1 centimètre cube à'99 centimètres cubes, même plus haute pour des eaux extrêmement microbiennes, et on opère comme ci-dessus en ensemencant de cette dilution 1 centimètre cube, 10, 5, 2, 1 gouttes. On tient compte naturellement du degré de dilution pour établir les résultats.

Quand on ne peut pas savoir approximativement la richesse microbienne d'une eau à examiner, il faut faire une série de cultures avec des quantités d'eaux nement décroissantes; par exemple, pour les eaux potables, avec 20, 10,5, 2, 1 gouttes; pour les eaux que l’on pense être très riches, avec, en plus, des dilutions établies comme il vient d'être dit. Si les cultures faites avec les taux supérieurs sont trop chargées de colonies, on s'adresse pour l'examen à celles faites avec des quantités moindres.

Quand il s’agit simplement d'isolement de colonies, on peut plus simplement recourir à des dilutions successives faites directement avec un premier ensemencement. Un tube est ensemencé avec la quantité d’eau supposée convenable, puis, avec ce premier mélange, on obtient une dilution en mélangeant une ou plusieurs gouttes du contenu du tube à la gélatine d’un second ; puis de cette dilution une suivante, en procédant de même et ainsi de suile en continuant lorsque les eaux sont très riches en Bactéries.

Au début, la gélatine, un peu refroidie pour la rendre visqueuse et prête à se solidifier, était coulée sur des plaques de verre stérilisées refroidies. 11 est bien plus commode de n’employer que les petits cristallisoirs plats, à couvercle, connus sous le nom de boîtes de Petri (I, p. 285); on évite ainsi bien mieux les contaminations par l'air.

Pour éviter complètement les contaminations par l'air, on peut employer les flacons plats, fioles de Soyka ou boîtes de Roux (I, p. 286),

que l’on stérilise, munies de la quantité voulue de gélatine, fondue au moment du besoin pour le mélange de l'eau à ensemencer. Toutefois, les prélèvements de colonies sont difficiles, souvent impossibles avec ces appareils.

Dans le même but, Esmarch conseille de solidifier la gélatine à l’intérieur d’une grosse éprouvette où s'est fait l'ensemencement de l’eau, commeilestditI, page 286. Ici aussi, ilestsouvent difficile d'atteindre les colonies que l’on veut étudier, et lorsqu'ilse trouve, ce qui est fréquent, des espèces qui liquéfient la gélatine, le liquide produit coule bientôt et vient troubler l’expérience.

En somme, c’est l'emploi des boites de Petri, avec un ensemble de précautions pour éviter le plus possible une contamination étrangère, qui paraît être de beaucoup le procédé le plus pratique. La gélatine ensemencée y sera versée avec soin, en soulevant le couvercle aussi peu qu'il est nécessaire, ne découvrant jamais entièrement la boîte. Du reste, les contaminations sont peu fréquentes au début: plus communes au contraire quand on veut examiner les colonies développées et qu'on arrive alors à découvrir entièrement la boîte; c’est ce qu'il faut faire le moins possible.

Les cultures sont mises à solidificr sur une plaque à vis calantes pour que l'épaisseur de la gelée soit aussi régulière que possible (I, p. 284). Lorsqu'elles ont bien fait prise, elles sont disposées sur une petite étagère placée dans un endroit dont la température est d'environ 18°, au mieux 20°, en arrangeant un léger chauffage lorsque la température est par trop basse. Ces conditionsse réalisent assez facilement dans les laboratoires pendant la saison froide. En été, au contraire, la température s’y élève souvent trop; on risque de voir les cultures fondre et se détruire. Il faut choisir un endroit plus frais, sous-sol ou même cave, par exemple; ou bien user d'installations refroidissantes, ce qui est assez compliqué pour obtenir des effets réguliers. Quand on dispose d'eau dont la température ne dépasse pas 20°, on peut se servir d’un courant d’eau froide; autrement, il faut faire intervenir la glace et bien souvent on obtient des températures trop basses, d’où retard dans le développement (Voy. I, p. 318). Les cultures doivent être examinées après quelque temps, à partir du moment où les colonies ont pu apparaître.

D'ordinaire, les colonies apparaissent de vingt-quatre à trente-six heures sous forme de petits points blancs. À un faible grossissement, ce sont de petites taches discoïdes où sphériques, blanches ou jaunâtres. Elles ne prennent un aspect caractéristique que quelques jours après ; cependant quelques espèces, liquéfiant la gélatine, se développent très vite et atteignent rapidement leur maximum; aussi doit-on suivre attenüivement les cultures à partir de la vingtième heure. C’est d'habitude du deuxième au cinquième jour que les plaques doivent être étudiées avec soin ; elles présentent souvent l'aspect indiqué par les figures 170 et 171. À ce moment, les caractères de beaucoup de colonies sont suffisants pour permettre de les classer avec probabilité, sinon avec certitude absolue.

Pour éviter l'extension trop rapide de la liquéfaction de la gelée par les colonies qui la déterminent, il est à recommander de retourner les plaques de facon que la re solide de la gelée soit en dessous. De

cette manière, lorsque du liquide est produit en certaine quantité, il coule et s'amasse dans le couvercle, sans rester en contact avec la gelée ambiante qui se liquéfierait alors bien plus vite.

Il est possible à ce moment d'obtenir des cultures pures des diverses espèces en puisant dans ces colonies et les ensemencçant, suivant les procédés indiqués dans la première partie de ce livre.

Fig. 170. — Aspect d'une culture sur plaques d’eau, faite sur lame de verre (grandeur naturelle).

Avec les eaux riches en microbes, il esl rare que les plaques faites avec de notables quantités d’eau puissent servir longtemps. Elles contiennent d'ordinaire de trop nombreuses colonies, qui se touchent, se confondent en partie et se gènent dans leur développement. De plus, la couche de gelée est d'ordinaire liquéliée avant le développement suffisant de la plupart des colonies. Les dilutions plus grandes, les cultures faites avec 1 goutte ou avec des dilutions à 1/10çou 1/100 seront utilisables et pourront servir à la numération approximative des colonies

microbiennes. On a cependant toujours intérêt, pour cette numération, à opérer sur les cultures faites avec la plus grande proportion d’eau; l'expérience démontre vite que l’on obtient ainsi les meilleurs résultats.

Numéralion des colonies. — Pour arriver à une numération aussi exacte que possible desgermes pouvant se cultiver sur gélatine que contient l’eau mise enétude, il est nécessaire d’attendreun temps suffisant pour permettre à la plupart d’entre eux de donner des colonies bien visibles. L’expérience démontrera facilement qu'une numération faite vers le quatrième jour, par exemple,ne donnera qu'un chiffre notablement inférieur, du tiers le plus sou-

vent, à celui fourni par une même opé- Fig. 171. — Aspect d’une culture sur plaques d’eau, faite en boîte de Petri (grandeur naturelle).

ration faite sur une culture âgée de dix à douze jours. À partir du moment où les colonies deviennent bien visibles dans ces cultures, vers le troisième jour d'ordinaire, si l’on compte les colonies, chaque jour on voit le chiffre obtenu augmenter progressivement jusque vers le douzième jour environ. À ce moment, il reste à peu près stable, presque tous les germes pouvant se cultiver dans ces conditions ayant formé leurs colonies. Il vaut toujours mieux faire la numération définitive le plus tard possible; on peut prendre quinze jours comme terme habituel. Toutefois, en opérant après douze jours et même après six jours, si les cultures ont été maintenues à une température suffisante, vers 18°, on peut être assuré d'avoir une approximalion suffisante. Lorsqu'on est forcé de faire la numération au quatrième jour, en multipliant le chiffre obtenu par 3, au sixième Jour par 2, on sera assuré de se tenir dans des limites raisonnables; ce sont des chiffres que nous avons établis en nous basant sur de très nombreuses moyennes. ,

Le tableau suivant, donné par Rossi(1), paraît aussi pouvoir êlreutilisé :

Après 1jour de culture, il y a 99 colonies sur 100 qui ne sont pas développées.

— 2 jours — — 85 — — — a Let 2e 76 — OUT NE — — 69 — — —

(1) Rossi, Circa il computo delle colonie in rapporto con la durata del periodo de incubazione nell'esame batteriolosico dell'acqua (Rivista d'Igiene, XV, 1904).