MÉTHODES DE DIS80CIATI0I\ ET DE DISSECTION

Pour étudier les éléments de certains tissus, il est nécessaire de les écarter et de les isoler les uns des autres, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens chimiques, soit par la combinaison de ces deux espèces de moyens.

ivio.Tens mécaniques. — Dissociatioii civcc les ttiguilles . — Lorsqu'il s'agit de séparer à l'aide des aiguilles les parties élémentaires d'un tissu, il se présente à l'histologiste des difficultés de divers ordres. Il est nécessaire, en premier lieu, de voir trèsnettement l'objet, ce qui n'est pas toujours facile ; en second lieu, il faut posséder sur la structure du tissu que l'on veut dissocier quelques notions élémentaires préalables, afin de ne pas appliquer les aiguilles au hasard, ce qui pourrait, ou bien empêcher de séparer les éléments, ou bien altérer précisément les parties que l'on veut examiner.

Si la dissociation se fait à l'œil nu, avec une simple loupe ou avec la loupe de Briicke, il faut avoir soin de se placer dans le meilleur jour ; mais cette précaution ne suffit pas. Si la lame de verre sur laquelle est placé le fragment de tissu repose directement sur la table de travail, il peut se faire qu'on ne le distingue pas nettement; aussi faut-il choisir un fond approprié : noir si les tissus sont blancs, blanc si les tissus sont colorés; de cette manière on voit beaucoup mieux l'objet. Mais, lorsqu'il est sur

fond blanc, on ne lu dislinyiio pas encore nellement, parce que les ombres projetées parles dilïerenles parties du tissu sur le ibnd que l'on a mis au-dessous de la lame de verre viennent se môleiavec l'image de l'objet et en altèrent la netteté. Pour éviter cette difiiculté, les histologistes, au lieu de poser directement la lame de verre sur laquelle ils dissocient sur la table ou sur une feuille de papier, peuvent la faire reposer sur les bords d'un petit baquet de porcelaine, de manière à se procurer un fond distant de l'objet, et où l'ombre projetée obliquement ne se confond plus du tout avec l'image de cet objet.

Nous nous servons dans notre laboratoire d'un ^cûijjhotophore, Piwiophore. qui réunit les différentes conditions nécessaires pour dissocier avec avantage à l'œil nu ou avec la loupe de Briicke. Il se compose d'une petite caisse de bois d'environ 5 centimètres de haut, sur 10 à 12 centimètres de long et de large. La paroi antérieure est enlevée, et la paroi supérieure est formée par une lame de glace. Dans cette caisse, on dispose un miroir de glace incliné en bas et en avant et formant avec l'horizon un angle de 25 à 30 degrés, de manière à renvoyer directement de bas en haut les rayons lumineux.

Sur la plaque de verre qui recouvre la caisse, on place la lame €11 se trouve la préparation, et elle est aussi bien éclairée que possible. Pour voir bien nettement les objets colorés, il suffit déplacer sur le miroir une feuille de papier blanc; les objets se détachent admirablement sur ce fond, et leur ombre, réfléchie obliquement et en arrière de la préparation, ne vient pas nuire à la netteté de leur image. Quand on a affaire à des objets blancs, on remplace l'écran blanc par un écran noir sur lequel toutes leurs parties se détachent avec netteté. Cet appareil ne doit pas avoir plus de 5 à 6 centimètres de hauteur; autrement il devient incommode, parce que les mains n'ont plus un point d'appui solide sur la table de travail.

Lorsque les éléments qu'il s'agit de séparer et d'isoler sont trop potits pour être visibles à l'œil nu ou à la loupe de Briicke, il devient nécessaire de se servir du microscope. On peut alors procéder de deux façons. Ou bien placer la préparation sous le microscope, la considérer attentivement avec un faible grossissement, de manière à se rendre bien compte de la façon dont est situé l'objet à isoler : une cellule nerveuse par exemple, par rapport à des pai-ties de tissu assez considérables pour être visibles

Dissociation

sous le microscope.

■72 TRAITÉ TECHNIQUE D'HISTOLOOIE.

à l'œil nu; puis retirer la préparation de la platine, et, en la plaçant sur le photophore, la dissocier avec les aiguilles comme nous allons le dire tout à l'heure, en calculant approximativement le point où se trouve la cellule nerveuse. Ce procédé est sujet à bien des chances d'insuccès, et cela se comprend lacilement; cependant il donne entre des mains exercées d'assez bons résultats. L'autre procédé est de disséquer et d'isoler les éléments directement sous le microscope. Il y a alors à vaincre deux difficultés : la première est la dimension considérable que prend l'image des aiguilles; la seconde, c'est le renversement de l'image, par suite duquel on croit porter l'aiguille à droite quand on la porle à gauche, et l'éciproquement. Avec un peu d'exercice, cet inconvénient est moindre qu'au premier abord.

l'rismcs r\ • . > i • i • i i .

v,iivsscms. Un a mvente, pour y obvier, des prismes redresseurs places audessus de l'oculaire.

Avant de quitter ce sujiM, nous indiquerons un moyen qui nous a paru avantageux pour termin(ir l'isolation d'une cellule nerveuse. Il consiste à laisser tomber sur l'endroit où elle se trouve une pctile goutte de li([uide qu'on y apporte à la pointe de l'aiguille. Le liquide écarte les librilles et les petits objets voisins, et souvent par ce procédé nous avons obtenu, libre et isolée, une cellule nerveuse que nous n'aurions séparée avec les aiguilles qire'n sacrifiant un ou plusieurs de ses prolongements. Manière Eu sccoud Hcu, avous-uous dil , il est indispensable, avant d'apaijriiiiies. pliquer les aigunles à un tissu, d'avoir quelques notions élémentaires sur sa structure. On ne dissocie pas en effet tous les tissus de la même façon, et il est urgent de savoir dans quel sens les éléments sont disposés, s'ils sont parallèles ou entrecroisés, de manière à agir suivant la direction où l'on obtiendra le plus facilement l'isolai ion.

Ainsi pour les muscles, il est essentiel, avant de procédera leur dissociation, de savoir qu'ils sont composés de fibres parallèles, et de se rendre compte du sens dans lequel elles sont dirigées. Cette structur(^ fibrillaire se voit parfaitement à l'œil nu; aussi faut-il prendre pour le dissocier un fragment dont la longueur corresponde à la direction d(3S fibres. Gela (ait, on applique les aiguilles à l'une des extrémités du fragment de tissu, on les écarte de manière à produire une fente de dissociation que l'on augmente en écartant de plus en plus les aiguilles jusqu'à diviser rol)jet en deux. Puis, sur une des moitiés, on répète l'opération en

MKTIIODKS DE DlSSOClATlOiN. 73

plaranl toujours l(3s aiguilles au mènm bout du IVai^uKiiit uiusculaire, et on les employant pour le séparer en filaments de plus en plus fins. Les aiguilles doivent être appliquées toujours au même point de la préparation, parce que les fibres musculaires qu'il s'agit de dissocier sont si délicates, que tous les points loucbés directement par l'aiguille sont altérés et ne peuvent plus servir à l'observation. En opéi'ant comme nous venons d'indiquer, on peut arriver à dissocier jusqu'aux faisceaux primitifs sans avoir altéré autre ciios(^ qu'un(i des extrémités des faisceaux.

S'il s'agil de dissocier des nerfs, il (ssl nécessaire aussi de savoir (|u'ils sont composés de faisceaux et de tubes nerveux parallèles disposés dans le sens de la longueur du nerf; il faut déplus savoir que les faisceaux nerveux sont entour(''s d'une gaîne résistante, et qu'on ne peut séparer les tubes dont ils sont composés qu'après avoir enlevé cette gaine. Partant de ces notions, le nerf, convenablement préparé, est débarrassé de sa gaine, et son contenu est dissocié avec les mêmes précautions que nous venons d'indiquer pour les fibres musculaires, car les tubes fierveux sont encore plus lacilcment altérables que ces fibres.

Lorsqu'on a affaire à un tissu dont les éléments sont entre- .los^ccàtiou. ci'oisés, comme le tissu con jouet if par exemple, il survient une nouvelle difliculté : si les aiguilles sont appliquées dans un sens, le tissu se laisse étirer dans cette direction ; mais lorsqu'on, l-es applique dans une direction perpendiculaire à la première, il se laisse étendre dans ce sens, et revient sur lui-même dans l'autre, de sorte qu'on ne peut l'étaler convenablement. Le meilleur moyen d'obvier à cette difficulté, c'est de placer le tissu sur la lame de verre sans liquide et de l'étendre modérément, lise dessècbe peu à peu, et les parties à demi dessécbéesadlièrent assez à la lame pour former un point d'appui et résister à la traclion qu'on exerce àl'autre exirémilé. Nous reviendrons, à propos du tissu conjonctif, sur les détails pratiques de cette niélbode; nous ajouterons seulement ici qu'il faut opérer rapidement avant que la dessiccation soit trop avancée, et que ce procédé ne peut être employé pour des objets que la d(Mni-dessiccation pourrait altérer dans leur forme.

Lorsque des fragments de lissu à demi isolés gênent l'observateur, il arrive facileiueut à les séparer en un point quelconque en appliquant fortement à c(î j)oint sur la lame de verre l'aiguille à dissocier, qui agit connue un scalpel.

Ces exemples suffisent pour monli'cr les précautions qu'il faul jjrendre dans la dissociation avec les aiguilles, pour être assuré, d'avoir de bons résultats.

Dissociation par agitation dans les liquides. — Lorsque les éléments sont retenus faiblement les uns aux autres, comme par exemple les cellules d'un épithélium, il est facile de les dissocier sans y toucber. L'objet est mis avec un liquide neutre dans un tube que l'on agite; les cellules se détachent les unes des autres^ et une goutte du liquide prise au fond du tube en contient suffisamment pour les examiner.

line méthode analogue consiste à placer un petit fragment de l'obj(!t sur une lame de verre avec une goutte du liquide additionnel. On incline la lame d'environ 20 degrés, de manière que la goutte se rassemble un peu au-dessous de l'objet, mais pas assez pour qu'elle s'écoule, et, avec une aiguille, on agile l'objet dans le liquide de manière à en détacher quelques cellules. Ces cellules ont gagné, à mesure, la partie inférieure de la goutte d'eau, ainsi (]u'on peut s'en assurer par l'examen microscopique.

Méthode des injections interstitielles, ou œdèmes artificiels. — Lorsque des tissus sont constitués par des réseaux de filaments intriqués dans tous les sens, on réussit très-bien à les séparer de manière à les voir nettement à l'aide des injections interstitielles,, qui rentrent ainsi dans cette méthode générale de dissociation. On se sert pour cela d'une seringue hypodermique montée soit en argent, soit en caoutchouc durci, et munie d'une canule d'or. On peut injecter de l'eau, du sérum, des matières colorantes, du nitrate d'argent, ou aussi des substances solidifiantes comme de la gélatine.

Si l'on injecte de l'eau ou un liquide analogue, il faut pousser l'injection rapidement, par exemple dans le tissu cellulaire souscutané; les fibres sont refoulées les unes contre les autres, et il se • fait une boule de liquide entourée par ces fibres qui forment autour d'elle comme une membrane d'enveloppe. On coupe alors un fragment du tissu, on l'étalé sur la lame et l'on recouvre. Il est nécessaire de faire toutes ces manœuvres rapidement ; autrement, le liquide s'écoule, les éléments écartés reviennent sur euxmêmes, et l'injection n'a produit aucun eflet utile. Il faut donc disposer, avant de procéder à l'injection, une lame et une lamelle bien nettoyées, avoir sous la main ses instruments, de manière à

MliTHODES DE DISSOCIATION.

liiiro la coupe et à appliquer la lamelle immédiatement. Une fois (pie la lamelle est placée, la capillarité la fixe et empêche les [)arties de se déplacer.

Quand on injecte de la gélatine, on peut aller plus lentement. La gélatine se solidifie et maintient les éléments dans la situation que leur adonnée l'injection.

Moyens chimiqticii. — H v a certains réactifs qui, conservant ou môme augmentant la solidité de quelques éléments, ramollissent ou dissolvent les autres, de telle sorte que les premiers peuvent ensuite être très-facilement séparés.

Au nombre des réactions dont il s'agit ici, on peut ranger les premières modifications chimiques qui se passent au sein des tissus après la mort. Ainsi, si l'on sacrifie un animal et que l'on expose l'épithéfium de l'intestin à l'air pendant seulement quelques minutes, les cellules épithéliales s'en détachent, il se produit un liquide lactescent dans lequel on peut voir ces éléments isolés.

Un procédé analogue consiste à abandonner les tissus à euxuièmes dans un espace clos. L'objet est mis dans un petit baquet sur une lame de glace dépolie et recouverte d'une cloche rodée. A côté du baquet est placé un petit morceau de camphre, ou un peu de papier à filtrer trempé dans de l'acide phénique à 4 pour 10. Si l'on a pris le tissu frais, il peut rester ainsi plusieurs jours sans se putréfier; mais il fout pour cela que le tissu soit tout à fait frais ét ne contienne pas de germes de putréftiction, des bactéries par exemple, autrement ces moyens seraient tout à fait insuffisants. Les tissus ainsi conservés subissent une sorte de macération qui rend les éléments plus facilement isolables.

Ce procédé est surtout à appliquer pour les tumeurs. Ainsi les épithéliomes tubulés sont composés de cellules soudées intimement les unes aux autres, et il est très-difficile d'en détacher à l'état frais. Si on les abandonne sous une cloche, comme nous venons de le dire, on réussit, au bout de vingt-quatre heures, en raclant simplement la surface, à obtenir isolées un grand nombre de cellules avec des dentelures, cellules qui étaient fortement adhérentes les unes aux autres à l'état frais.

Certains réactifs li(piid(^s employés depuis quelques années ont donné pour la dissociation de fort heureux résultats. C'est une méthode dont l'initiative est duc à Max ScbuUze.

Alléraliuii cadavérique.

Tissus abaiiduniiés à eux - mêmes en vase clos.

7(1 TMAITK TKCIlMglE U IUSTOLOIJIK.

Sérum iodé. — Ce rétiolir, invunh'^ par Max Sclniltzi^ a rondii de grands services à l'hislologie. Pour le labriqiier, on lait usage soit du sérum naturel du sang ou de l'anmios, soit d'un séium fait avec; du blanc d'œuf, de l'eau et du sel marin. Jl n'y a que le sérum fabriqué avec l'eau de l'anmios des mammifères qui présente des avantages sérieux ^. Ce liquide est re- (,'.u(3illi à l'état frais dans un llacon au fond duquel on ajoute des paillettes d'iode. Il faut agiter tous les jours le mélange, ou l'etourner le llacon, pour que l'iode se mélangea toute la masse; autrement il ne se trouverait de l'iode qu'au fond du flacon, (ît à la partie supérieure si; formeraient des vibrions et des bactéries.

l.e meilleur procédé i)our avoir un bon sérum iodé consiste

|Miiir labi'U|iiei' ^ i

sérmi'fiodé P^'^'P'^^'*''" ^^J^ llacon qui ne soit pas tro}) grand ou qui

soit très-plat, de manière que le niveau du li([uide ne dépasse pas 52 à ."3 centimètres, de telle façon ([u'il ne puisse pas y avoir une . roucbe considérable de sérum au-dessus de la coucbe plus fortement iodée (lu fond.

On peut aussi employer un autre pi'lDcédé. Le sérum est mélangé avec une forte proportion de teinture d'iode; il m forme un précipité d'iod(\ on fdtre et l'on a une solution fortement iodée. On Verse tous les deux on trois jours un peu de cette solution fortement iodée dans le séi nm ordinaire, qui est ainsi préservé de la putréfaction. 11 est à remarquer qu'au début, l'iode se dissout Irès-lcntement dans le sérum; mais si l'on continue son action, une partie de cet iode ne tarde pas (au bout de quinze jours à trois semaines) à se transformer en iodures ; ces iodures contribuent alors à dissoudre une nouvelle quantité d'iode, et par suite on peut avoir au bout d'un à deux mois un sérum très-fortement iodé. C'est ce sérum très-fortement iodé et présentant une couleur brun foncé qui est le meilleur liquide pour ioder un sérum frais. H est nécessaii-e d'avoir dans un laboratoire diflérents sérums,

' M. Schullzc, Die Anwendung' mit lod conservirter thierisc|ier Fiiissigkeiten als iiiacei'irendes und conservircndes Miltel bei liistologischen Unlcrsucliiingen (IV?-c/t6w'y Archiv., 18G4, vol. XXX, p. 263).

- Pour se procurer de l'eau de l'ainnios, on va dans un abaUoir de Paris demander des gosselins de veau ou de mouton (c'est le nom sous lequel est connu l'utérus gravide). Une incision comprenant la paroi utérine et les membranes donne issue à nu jet de sérum que l'on rct'oit dans un flacon muni d'un entonnoir. Ce liquide doit iHrc parfaitement limpide et d'un jaune cilrin.

METHODES DI-; DISSOCIATIOX. 77

plus ou moins fortement iodés ; on se sert des uns ou dm autres suivant les effets variés qu'on désire obtenir.

Pour déterminer l'action dissociatrice du sérum iodé sur un tissu, il faut prendre un fragment du tissu à étudier inférieur au volume d'un pois, et le placer dans un flacon bien bouclié avec 4 ou 5 centimètres cubes de sérum faiblement iodé; giMiéralement dès le lendemain, on peut pratiquer la dissociation par les moyens généiaux indiqués plus haut. Si le tissu n'est pas encore assez ramolli, il Itmt prolonger son séjour dans le sérum iodé; maison remarque que, dès le second jour, ce sérum est tout à lait décoloré, c'est-à-dire que le tissu a absorbé tout l'iode qu'il contenail, et si on laissait les choses en l'état, la putréfaction ne tarderait pas à survenir. Pour l'empêcher, on ajoute quelques gouttes de sérum fortement iodé jusqu'à ce que le liquide ait repris une légère coloration brune. Le séjour du tissu dans le sérum peut ainsi être prolongé pendant plusieurs semaines sans que la putréfaction survienne, si l'on ajoute du sérum iodé chaque fois que le liquide se décolore. C'est l'addhion successive de nouvelles quantités d'iode qui constitue la clef de cette méthode de dissociation.

Frey* a préconisé le sérum artiliciel suivant :

Eau distillée 135 gram.

Albumine de l'œuf 15

Chlorure de sodium 0 20

Mélangez, fdtrez, et ajoutez :

Teinture d'iode 3 cram.

Le mélange précipité, on liltre de nouveau sur de la flanelle, el Ton ajoute au fond du vase quelques paillettes d'iode. Nous n'avons jamais réussi à obleuir par ce procédi'' un sérum iodé convenable.

Alcool et eau. — D'autres réactifs dissocient les tissus m ramolli.ssant certains éléments, tandis qu'ils rendent les autres plus soUdes. Ainsi, un mélange de 1 partie d'alcool à 36 degrés cl de 2 parties d'eau constitue un moyen de dissociation excellent, par exemple pour les épithéliums. En laissant un intestin de grenouille plongé pendant vingl-qualre licures dans ce liquide, on obtient dfs cMInlcs épiihélialcs isolées d'une netteté admirable.

Alanicru (l'employer le sérum iodt-

dans les dissocinlioiis.

Sérum ai'liliciel.

lMll|ll0l

lU' l';ili'ooI.

' Frey, Das Mikroskop und die mikrosicopisciie Technik, 1871, p. 70.

78 THAlTli TECHNIQUE D IIISTOLOGIE.

llréiTssit aussi bien chez les mammifères, pour la plupart des cpithéliurns et même d'autres éléments. Nous aurons l'occasion d'y revenir dans la suite.

Acide chromique. — A la dose dei à 3 pour 10000, cet acide constitue un excellent liquide dissociateur, recommandé pai- M. Schultze'; il est très-bon pour la plupart des tissus de l'organisme, et en particulier pour les cellules nerveuses. Il en faut prendre 10 centimètres cubes pour un fragment d'environ 5 millimètres de côté. Au bout de vingt-quatre heures de séjour dans ce liquide,le tissu nerveux se dissocie avec facilité.

Bichromate de potasse. — Il s'emploie à des doses dix fois plus considérables, à 2 à 3 pour 4000.

Potasse et soude. — Ces alcalis s'emploient en solutions fortes, de 35 à 50 pour 100 (Moleschott) ; ils dissolvent la substance intercellulaire en ne modifiant que légèrement les cellules, ce qui permet d'isoler ces dernières. On fait agir ces solutions de potasse directement sur la lame de verre où le tissu est étalé.. On n'obtient pas ainsi des préparations durables ; au bout de quelque Icmps il survient de si grandes altérations, qu'on ne peut plus rien apei'cevoir de net.

A doses faibles, au contraire, comme l'a indiqué Moleschott, ils détruisent tous les éléments. On emploie des solutions faibles de ces alcalis pour dissocier les éléments cellulaires des ongles, des poils et de l'épiderme.

Acide sulfurique. — Concentré et à chaud, ce réactif peut être employé pour isoler les cellules des parties cornées, des poils, des ongles, etc.

Pour isoler les fibres du cristallin, M. Schultze place cet organe dans 30 grammes d'eau additionnée de -4 ou 5 gouttes d'acide sulfurique concentré. Au bout de vingt-quatre heures de macération, il suffit d'agiter, un fragment du cristallin dans le liquide pour le voir se décomposer en ses éléments constituants.

Acide azotique. — C'est Kôlliker ^ qui a employé le premier cet acide; il s'en est servi à la dose de 20 pour 100 pour isoler les fibi-es musculaires.

Un petit fragment d'organe qu'on suppose contenir des fibres

1 M. Schultze, Unlersuchungen iiber den BauderNasenchleimhaut, etc. Halle, 1862.

2 Voyez les indications données dans Kôlliker, Éléments d'histologie, traduction française, 1868 ,p. 115.

musculaires lisses, placé dans 5 à 10 cenlimùlres cubes de ce réactif, se laisse, au bout de dix-huit à vingt heures, dissocier avec la plus grande lacilité au moyen des aiguilles.

Kiihne ' a indiqué une méthode où Tacide azotique joue un rôle . Il fait, dans un verre de montre, un mélange de chlorate de potasse avec quatre fois son volume d'acide azotique; une fois le mélange bien homogène, on y enfouit à l'aide d'une baguette de verre un fragment musculaire fi'ais; après une demi-heure ^?nviron, il en est retiré, et, en l'agitant dans un tube rempli d'eau distillée, le muscle se sépare en ses éléments.

Réactifs divers. — Plusieurs auteurs ont essayé de combiner l'action de divers réactifs avec celle de la chaleur.

Ludwig- a proposé, pour dissocier les éléments glandulaires du rein, de chauffer les tissus pendant six à huit heures dans de l'alcool à 40 pour iOO, auquel on ajoute ! pour 300 ou 1 pour iOO d'acide chlorhydrique concentré. On chauffe au bain -marie dans une cornue convenablement disposée pour éviter le dégagement des vapeurs acides; ensuite le tissu est mis à macérer dans l'eau distillée pendant plusieurs jours, jusqu'à ce que, par l'action la plus légère desaiguiUes, on arrive à séparer les tubes urinifèi'es.

Rollelt a employé la coction en vase clos dans une petite quantité d'eau. Le tissu est mis avec un peu d'eau dans un tube scellé à la lampe que l'on chauffe jusqu'à 125 ou 130 dégrés dans un bain de sable. Tout le tissu collagène se transforme en gélatine; le tube est alors brisé dans l'eau chaude, qui dissout la gélatine et permet la séparation des autres éléments.

Compression. — Nous uc citerous que pour mémoire ce moyen de dissociation à peu près abandonné par les hislologistes, et qui était employé autrefois par les zoologistes qui se servaient du microscope. En histologie, la compression est plutôt à éviter.

Quoi qu'il en. soit, ce procédé consiste à comprimer la préparation, lorsqu'elle est en place, au moyen d'une pression exercée par la lamelle. Ce moyen a joui d'une assez grande faveur pour qu'on ait inventé des compresseurs divers. Schick, de Berlin, a labriqué le premier de ces instruments. Il se compose d'un anneau de laiton venant s'appliquer sur une lame de verre soutenue par

' Kûhne, Uebcr die peripherischen Endorgane der motorischcn Ncrvcn. Leipzig, 1862.

2 C. LiMg, von der Niere. {Slricker's Haudbuch, p. 506.)

80 TRAITÉ TlïCHiNIQUE D"JIISTOLOGIK.

une plaque de liliton percée d'un trou correspondant à l'anneau. Celui-ci est maintenu appuyé par un ressort qu'on peut modéreiau moyen d'une vis. On met la préparation et la lamelle entre l'anneau et la lame de verre.

Ce procédé n'est plus en usage aujourd'hui.