CHAPITRE VU

METHODES niVKR^KS POUR FAIRE t.F.S COlPEf^ FIIN'Eiti

Comme les objets qu'on regarde au microscope sont vus pour la plupart à la lumière transmise, il est nécessaire que ces objets soient transparents, et la première condition pour qu'ils laissent passer la lumière, c'est qu'ils aient une épaisseur très-peu considérable. U faut donc, pour les tissus qui ne se laissent pas dissocier comme les muscles, ou étendre comme les membranes, en couper des tranches aussi minces que possible. Conditions Ccrtalus tissus se trouvent naturellement dans un état de dureté

des

coupes fmes. suffisant })Our v lilirc des coupes : tels sont, par exemple les cartilages , et quelques parenchymes. Mais la plupart sont beaucoup trop mous ; si l'on . essayait de les diviser à l'état frais, le rasoir glisserait sur la pièce, ou bien les différentes parties de cette pièce, glissant les unes sui; les autres, empêcheraient d'en faire une coupe d'épaisseur uniforme. Il est donc nécessaire de soumettre ces tissus à un traitement préalable qui leur donne le degré de dureté suffisant pour qu'on puisse commodément en faire des coupes. D'autres tissus au contraire, comme par exemple les os ou les dents, sont trop durs à l'état normal pour que le rasoir puisse les entamer; si l'on arrive à en détacher un copeau mince au moyen d'un scalpel à trempe trèsdure, ce copeau fragile s'écaille et se fendille en même temps qu'il se sépare du reste, et au lieu d'avoir une lame homogène, on n'a plus qu'une substance inégale où les éléments du tissu se con-

fondent avec les fentes de la préparation et l'air interposé. Pour faire des coupes sur ces tissus avec le rasoir, il faut leur faire subir un traitement préalable qui les ramollisse suffisamment, ou bien en détacher des lames par un autre procédé que nous allons indiquer tout à l'heure.

Nous aurons donc à traiter, dans ce chapitre, des coupes à faire sur les tissus qui n'ont besoin d'aucun traitement préalable ; des coupes sur les os et les substances ossiformes ; des différents procédés pour durcir suffisamment les tissus mous, et de la manière de pratiquer les coupes sur les objets préalablement durcis.

Coupes sur les tissus qui n'ont pas besoin de subir nn trai- ^surîes^

tement préalable. — Ccs tissus pcuvcnt être plus OU moius durs ;

parmi les plus durs, il faut compter les ongles et les substances 'es cannages.

cornées en général. On fait usage pour ces coupes d'un scalpel

ou d'un rasoir à trempe très-dure; si l'objet est trop petit pour

être tenu à la- main, il doit être placé dans une fente pratiquée

dans un morceau de liège.

Les cartilages se rangent aussi parmi les tissus dont on peut faire des coupes à main levée et sans aucune autre préparation. Ces coupes se font, soit à sec, comme les précédentes, soit en mouillant le rasoir avec de l'eau alcoolisée, pour permettre à la lamelle détachée de glisser sur la surface du rasoir dans la mince couche de liquide qui s'y trouve.

Les tissus plus mous, les parenchymes, présentent plus de diflicultés: d'une part la mollesse du tissu empêche de le maintenir parenchymes

et les tissus

soUdement; d'autre part, grâce au liquide dont ils sont imbibés, fibriiiaires. les él.éments glissent les uns sur les autres. Avec un peu d'exercice, on peut cependant arriver à faire des coupes sur ces tissus, par exemple sur le foie. Après avoir mouillé le rasoir, que l'on a soin de tenir bien horizontalement, on pratique un premier avivement que l'on fait hardiment et tout d'un trait; puis on fait la seconde coupe; mais le plus léger mouvement des doigts qui tiennent la pièce change le rapport des parties, et la seconde face de la coupe est dentelée et irréguhère.

Si Tonne réussit pas à faire ces coupes à main libre, on peut ^uSm se servir du couteau double de Valentin (voy. plus haut, page 47). Comme les deux faces de cet instrument ne sont pas rigoureusement parallèles, au lieu de le promener sur l'organe, il vaut mieux l'enfoncer directement par sa pointe jusqu'à la garde. Au moyen d'une légère torsion, on dégage la coupe que l'on a Ranviek, Histol. g

du coutciui (il- Valcntin.

82 TRAITK TECHNIQUE D'HISTOLOGIE.

faite et que l'on retrouve en écartant les deux lames du couteau.

Il est encore plus difficile de faire des coupes dans des tissus de structure fibrillaire, comme par exemple dans le tendon d'Achille. Pour y arriver, il faut les comprimer fortement.

Au lieu d'affronter ces difticultés, il vaut mieux recourir à l'une des méthodes que nous décrirons tout à l'heure et qui servent à durcir les tissus. Mais auparavant nous allons indiquer les procédés usités pour faire les coupes sur les os.

..„?^-"l?'^'' Coupes sur les os et les substances ossiforme!*. — LcS COUpCS

sur les os avec

la sciu. sur les OS se font avec la scie. A cet effet, le morceau d'os est pincé dans un étau, et par un premier trait de scie, on affranchit une surface bien plane, et, autant que possible, verticale. Puis on fait une seconde coupe parallèle à la première, de manière à comprendre une épaisseur d'un millimètre au maximum. Pour cela, appuyant l'ongle à l'endroit choisi, on donne un pi'emier trait de scie ; puis on continue à scier verticalement en se guidant sur la lame fit le dos de la scie qui forment points de mire, et sans s'interrompre pour regarder son trait. C'est ainsi que se font les meilleures coupes.

La lamelle obtenue de cette façon est loin d'être assez mince ; de plus, elle a sur ses deux faces des raies correspondant aux dents de la scie. Pour les enlever, on use la lame en la frottant sur une pierre ponce. On choisit, comme nous l'avons dit plus haut, une pierre ponce coupée dans le sens de ses fibres ; on y met un peu d'eau, on appuie sur la lame d'os avec deux doigts, et l'on frotte jusqu'à ce que les inégalités aient disparu. Puis on la retourne et l'on en fait autant sur l'autre côté. La lame osseuse est ensuite placée entre deux pierres ponces à section bien plane que l'on frotte l'une sur l'autre ; elle se trouve bientôt fixée sur l'une des pierres ponces par une sorte de ciment formé des débris de la pierre et des parcelles de l'os, et l'autre polit sa face libre.

Ce temps de l'opération doit être fait avec précaution pour ne pas casser la lame osseuse devenue très-mince. Lorsque celle-ci est à peu près transparente, on enlève les raies produites par la pierre ponce et l'on finit d'amincir la préparation en la frottant avec les doigts sur une pierre du Levant ou sur une pierre lithographique, avec de l'eau. La lamelle est alors bonne pour l'ob-

MÉTHUUJiS FOUH LES COUPKS. .s;]

serviilion microscopique ; nous dii'ons plus loin (voy. Tissu osseux) <'omnienton achève la préparation.

On a décrit d'autres procédés pour l'aire ces coupes, mais ils sont inférieurs à celui dont nous venons déparier: ainsi on conseille de coller la lamelle osseuse sur un bouchon avec de la cire à cacheter, et de la promener ainsi sur une surface de grès. C'est plus long et cela ne réussit pas aussi bien.

II est impossible de diviser avec une scie l'émail des dents, sur'ies^dems. parce qu'il est beaucoup Irop dur et se casserait en éclats. Il faut, pour le scier, se servir de iils d'acier tendus, en interposant de fémeri très-fin entre la dent et le fil d'acier, avec une petite quanrilé d'eau; si l'on ne veut faire qu'une préparation avec une dent, on a plus vite fait de l'user à la meule. On prend la dent avec les doigts et on l'applique sur la meule, de manière à l'user peu à peu jusqu'à ce qu'on ait atteint le plan que l'on s'est fixé ; puis elle est retournée, et usée de l'autre côté jusqu'à ce qu'on soit arrivé à la moindi-e épaisseur possible. Ensuite, par quel- <puî procédé que l'on ait obtenu cette tranche de dent, il faut l'user entre deux pierres ponces, et pratiquer le polissage des <l(Hix laces sur une pierre du Levant imbibée d'eau, comme nous l'avons dit pour les os.

Coupes sur les tissus préalablement durcis. — Procédés à Kuivre pour le durcissement des tissus. — Congélation. — Un

<les premiers procédés qui soient venus à l'esprit pour fixer et <lurcir les tissus, c'est de les faire geler.

En soumettant les tissus à la congélation, on leur donne une grande fermeté par le fait de la solidification de l'eau qu'ils contiennent et de la fixation des différents éléments qui les constituent. ' Cette méthode donne d'excellents résultats pour l'élude d'un grand nombre d'organes et de tissus; elle est d'une application facile quand on est bien outillé.

Voici lo procédé le plus simple. On prend un petit ci'cuset du uiétal, solidement fermé par un bouchon. A la partie inférieure de ce bouclion et plongeant dans le creuset, est fixé l'objet que l'on veut faire geler. Ce creuset est placé dans un liiélange ••éfrigéranl de glace pilée et de sel marin (2 de glace pour 4 de sel marin), mélange dans lequel on fait également plonger le rasojr, parce (praulmment la chaleur de la lame ferait fondre le tissu qu'on se pro].ose de couper. Pour faire la cmipe, on relire le i-asoir, on l'essuie, on enlève le bouchon du crcusel, et l'on

pratique rapidement deux ou trois coupes sur le tissu. C'est là le procédé que F. BoU a suivi dans son étude des glandes salivaires. Cette méthode offre plusieurs inconvénients : d'abord le mélange réfrigérant ne se maintient pas longtemps; ensuite le rasoir est mouillé, et il est nécessaire de l'essuyer chaque fois avant dé faire des coupes ; enfin le maniement du petit creuset au miUeu du mélange est lent, gênant et incommode.

Nous nous servons dans notre laboratoire, pour congeler les objets, d'une glacière artificielle, système Penant, à laquelle nous avons fait une légère modification.

Cette glacière se compose d'une boîte cylindrique d'environ 25 centimètres de haut et 40 centimètres de diamètre intérieur, formée de deux enveloppes métalliques séparées par du feutre, et qui se ierme au moyen d'un couvercle maintenu par une vis à pression. C'est dans cette boîte que l'on met le mélange réfrigérant. Dans ce mélange plonge un cylindre métallique muni à sa partie supérieure d'un rebord qui le maintient et recouvert d'un disque de caoutchouc sur lequel vient appuyer le couvercle à vis de la boîte, de manière à l'occlure complètement.

Au lieu du mélange d'acide chlorhydrique et de sulfate de soude qu'emploie l'inventeur, nous nous servons du mélange de glace et de sel marin indiqué plus haut. Aussi avons-nous dû munir le récipient intérieur d'une pointe de fer qui permette de l'enfoncer dans la masse.

Pour se servir de cet appareil, on commence par mettre dans la boîte, par couches alternatives, les proportions de glace et de sel marin indiquées plus haut ; puis on enfonce dans celte masse le récipient intérieur dans lequel ont été placés, d'une part le rasoir, de l'autre les tissus à congeler. A cet effet, sur un morceau cylindrique de moelle de sureau est pratiquée dans la hauteur une section bien plane, le fragment de tissu y est appliqué et maintenu avec de petites épingles ; ce cylindre est enfoncé dans un troii pratiqué dans une petite lame de liège, de façon que la direction des coupes à faire soit parallèle à la surface de cette lame. Le tout est introduit dans le récipient; le disque de caoutchouc placé dessus et le couvercle refermé. L'appareil est abandonné à lui-même pendant quelques minutes; puis le rasoir et la lame de Irége sont retirés, et les coupes sont faites en maintenant le fragment au moyen de cette lame, de sorte qu'il ne se réchauffe pas par le contact des doigts.

Dessiccation. — llenle a tiré un grand parti de cette méthode; si elle ne conserve pas les éléments, elle permet en revanche de se rendre im compte exact de leurs rapports. Elle convient surtout pour les membranes.

Il Auit prendre, pom- les dessécher, des fragments d'organes très-petits ; étendus sur une plaque de liège avec des épingles, ils sont abandonnés à l'air; mais il faut que la température soit un peu élevée et que l'air soit très-sec, autrement les objets pourrissent, si on ne leur a pas fait subir auparavant un autre traitement. Pour préserver sûrement une pièce, il faut la faire macérer auparavant pendant vingt-quatre ou trente-six heures dans l'alcool. Celui-ci se substitue à l'eau du tissu, et si ce tissu est ensuite étendu à l'air, il sèche rapidement et sans qu'on ait craindre de voir la putréfaction s'en emparer.

Si l'on veut avoir une dessiccation rapide, on peut se servir du moyen suivant. L'objet, une fois tendu sur une plaque de liège, est placé sous une cloche rodée reposant sur une glace dépolie. Sous la cloche, on dispose dans une soucoupe du chlorure de calcium. Toute l'humidité de l'air est absorbée par le chlorure, et le tissu, se trouvant dans un air complètement sec, se dessèche très-rapidement. Lorsqu'on dispose d'une étuve à incubation, il suffit, pour obtenir une dessiccation très-convenable, de placer sur le couvercle de cette étuve les plaques de liège sur lesquelles ont été fixés les tissus.

La condition essentielle de toute bonne dessiccation, c'est que le tissu soit bien tendu. Si l'on a affaire à une membrane disposée autour d'une cavité naturelle, on peut l'insuffler. Ainsi, pour dessécher une portion du tube intestinal, il suffît déplacer deux ligatures à ses extrémités et d'insuffler la partie intermédiaire. On obtient ainsi un manchon qui sèche rapidement. Pour le poumon, il suffit de prendre un fragment près du bord, et d'y mettre une ligature. Quand on serre la ligature, l'air est refoulé dans le fragment, le distend, et si l'on coupe le morceau au delà de la ligature et qu'on l'expose à l'air, il se dessèche facilement.

Les coupes sur les tissus desséchés exigent des rasoirs durs ; les rasoirs mous seraient ébréchés. Lorsque l'air est sec et que les tissus .sont desséchés depuis longtemps, ils ont une telle dureté qu'ils feraient dévier le rasoir; il est nécessaire de les humecter un peu, et pour cela le meilleur procédé est de , souffler dessus. L'haleine vient rendre un peu d'humidité à une couche

THAITK TECHNIQUE D'HISTOLOdlE.

infmiment minco do la superficie cl la ramollir, landis qu'audessous le tissu rcsU; dur et sert de guide à ki lame du rasoir.

La tranche que l'on enlève ne doit pas blanchir; autrement, ce serait un signe que l'air pénètre dans ses parties, cl que par conséquent le tissu est fendillé.

Les tissus desséchés sont souvent trop minces pour qu'on puisse les tenir à la main. Il faut .alors les entourer d'une gaînc de liège, de moelle de sureau ou deFerdinamla. Il est difficile d(t faire au scalpel ou au rasoir une fente dans un morceau de moelle de sureau ; on risque de le casser ou de l'émietter. 11 faut tracei" à la scie une rainure dans laquelle est insérée la lame desséchée sur laquelle on veut faire des coupes. On peut aussi, quand il s'agit de lames très-minces, les coller avec de la gomme épaisse le long d'un moi'ceau de moelle de sureau. Les coupes se font ensuite très-facilement. Il faut que la gomme soit épaisse, pour ne paslroj) imbiber le tissu sur lequel on expérimente.

Les coupes de tissus desséchés ont besoin, plus (jue les autres, d'être d'une extrême finesse; en effet, quand elles sont placées, dans l'eau, le tissu se i-egonfle et reprend son épaisseur primitive, qui peut être deux fois plus considérable que lorsqu'il était sec.

Réactifs durcissants. — Les l'éactifs chimiques sont beaucoup plus employés aujourd'hui que les deux méthodes dont nous venons de parler; ils donnent aux tissus la dureté convenabl»^ en maintenant mieux la forme et les rapports des éléments. On emploie dans ce but l'alcool, l'acide chromique, le bichromal(^ de potasse ou d'ammoniaque, l'acide picrique, etc.

Alcool. — L'alcool est le réactif le plus anciennement employé et c'est celui dont on se sert encore le plus aujourd'hui. Il faut prendre de l'alcool fort, à 36 ou 40 degrés ; il importe d'y plonger les tissus encore bien frais avant qu'ils aient subi un commencement de putréfaction. Les morceaux de tissu doivent être petits ; ils doivent avoir un centimètre cube en général, et en tout cas ne jamais dépasser 2 centimètres. Pour un morceau de 2 centimètres, il faut de 25 à 40 centimètres cubes d'alcool fori . Il est nécessaire de maintenir par un fil la préparation à une ceitainc distance du fond du vase ; l'eau et les matières albuminoïdes et salines exsudées forment en effet à cet endroit avec l'alcool une sorte d'atmosphère mixte, qui empêcherait bientôt l'alcool de continuer son action ; si au contraii e la pièce flotte dans le liquide.

l'eau et ralbuminc, éUint plus lourdes que l'alcool, vont gagner le fond, et la pièce se trouve toujours dans un milieu d'alcool fort.

Un point très-important est la question de savoir combien de temps une pièce doit être laissée dans l'alcool pour obtenir un durcissement convenable. On croit généralement qu'elle peut y rester indéfiniment sans préjudice, mais c'est une erreur. Pour avoir de belles préparations, c'est-à-dire des préparations où les éléments se voient bien, il ne faut pas dépasser vingt-quatre ou quarante-huit heures ; pour les tissiis délicats, comme les muqueuses, il faut faire l'examen le lendemain du jour où on les a plongés dans l'alcool.

Les coupes des tissus ainsi durcis doivent être faites à main levée, soit d'avant en arrière, soit plutôt d'arrière en avant, avec un rasoir très-tranchant et fortement évidé ; on guide alors la lame sur l'ongle du pouce et l'on acquiert plus de sûreté. Elles exigent une grande habileté de main, parce qu'il est nécessaire qu'elles soient faites à main levée.

Acide chromique. — Ce réactif a été employé pour la première fois par Ilannover en 1840. C'est une idée d'économie qui l'y avait poussé ; quoi qu'il en soit, son emploi, surtout pour les centres nerveux et pour les nerfs, constitue un véritable progrès. Pour en tirer tout le profit possible, il est indispensable d'en connaître exactement la technique, de bien peser et mesurer les doses, et de ne pas s'en rapporter, comme on est trop souvent tenté de le faire, à la couleur du mélange.

L'acide chromique durcit les tissus à la dose de 2 à 5 pour 1 000. Il faut commencer par des solutions faibles et les prendre trèsabondantes. Frey ' insiste avec raison sur ce dernier point; en effet, si le liquide est en petite quantité, il arrivera un moment où la diffusion des matières albuminoïdes à l'extérieur et la diffusion du liquide dans la pièce s'arrêteront, parce que l'équilibre sera établi. Si l'on emploie, au contraire, de grandes quantités de liquide, il continuera toujours à s'en diffuser dans la pièce.

Les fragments de tissu peuvent être un peu plus grands que dans l'alcool, mais la limite extrême doit être 3 centimètres de côté, et il vaut mieux môme s'en tenir à des fragments de 2 cent imètres. Il faut au moms200 gi'amnnes de liquide par fragment d'un centimètre.

Pour durcir la moelle, qui est formée d'un tissu très-serré et qui

' Frey, Das Mikroskop und die mikroskopische Teclinik, 1871, p. 77.

88 TRAITÉ TECHNIQUE D JIISTOLOGIE.

Durcissement Contient beaucoup de graisse, ce qui gêne considérablemenl la la moelle, diffusion, il ne faut pas prendre des Iragments de plus d'un centimèlre et demi de côté. Il faut deux litres de liquide pour une moelle épinière d'homme, et il est nécessaire de le renouveler au bout de quelques jours. Une moelle met six semaines à deux mois pour durcir; mais une fois que le durcissement est complet, il ne faut pas laisser l'acide agir plus longtemps; autrement le tissu devient friable, et l'on n'obtient plus que des préparations fendillées. Quand la pièce est convenablement dure, elle est mise un jour ou deux dans l'eau ordinaire et conservée ensuite dans l'alcool à 36 degrés. Cette conservation est presque indéfinie; la moelle acquiert alors une teinte verdatre, une homogénéité plus complète, une consistance plus grande, et se colore plus facilement par le carmin. La même méthode peut être employée pour la conservation d'une série de tissus , les parenchymes glandulaires , la peau , les diverses tumeurs, etc.

L'acide chromique a la propriété de ramollir les os et les tissus ossiformes, en dissolvant les sels calcaires ; aussi peut-on l'employer pour préparer une pièce qui contient à la fois des os et des tissus mous, lorsqu'il s'agit de voir le rapport de ces différents tissus. Il faut prendre des fragments osseux très-petits, de 5 à 6 millimètres de côté. Les os embryonnaires, qui sont moins compactes, et par conséquent contiennent beaucoup moins de sels calcaires peuvent être pris en fragments un peu plus gros.

Bichromate de potasse et bichromate cV ammoniaque . — Le bichromate de potasse et le bichromate d'ammoniaque sont des équivalents au point de vue histologique ; on les emploie à des doses dix fois plus fortes que l'acide chromique, c'est-à-dire en solutions de 2 à 5 pour 100. Le durcissement se fait avec une très-grande lenteur ; mais avec le temps il devient bien suffisant et les pièces présentent une très-bonne consistance. Elles ne deviennent jamais cassantes, comme il arrive souvent pour celles qui sont très-complétement durcies dans l'acide chromique.

Liquide de Millier. — II. Mûller a conseillé, pour les préparalions de la rétine, un liquide très-souvent employé dans les laboratoires et qui a conservé son nom. En voici la formule :

Eau

Bichromate de potasse Sulfate de soude

Au bout (le quelques semaines de séjour dans ce liquide, un œil est assez durci pour que l'on puisse faire de bonnes coupes de la rétine.

Acide picrique. — Cet acide s'emploie en solutions saturées à froid. Pour les préparer, il suffit de mettre des cristaux d'acide picrique dans un flacon rempli d'eau filtrée ; comme la solution est lente à se faire, il est bon, pendant les deux ou trois premiers jours, d'agiter ou de retourner le flacon une fois par jour; autrement le fond seul du flacon contiendrait une solution saturée. La solution peut aussi se faire à chaud; par le refroidissement, l'excès d'acide se dépose et la solution reste concentrée.

Pour obtenir un durcissement convenable avec ce réactif, il faut deux conditions : d'abord, la solution doit être bien saturée ; ensuite les pièces que l'on y place doivent être relativement petites : un fragment de 1 à 2 centimètres de côté, par exemple, pour 150 à iOO grammes de liquide. Contrairement à ce qui convient pour les réactifs dont nous avons parlé plus haut, il vaut mieux ici laisser la pièce au fond du vase et ajouter quelques cristaux d'acide ; de cette façon on est certain que la pièce est bien réellement dans un milieu saturé.

Le durcissement produit par l'acide picrique ne ressemble pas à ceux dont nous avons parlé jusqu'ici. L'alcool durcit les objets en coagulant l'albumine et en se substituant à l'eau ; il les dessèche ; l'acide chromique se combine avec les éléments des tissus et produit une sorte de tannage; l'acide picrique produit une modification beaucoup moins complète, les éléments ne sont pas soudés les uns aux autres ; il ne se combine pas non plus avec les tissus comme l'acide chromique. Les pièces jaunissent dans l'acide picrique, mais les coupes qu'on en fait se décolorent quand on les lave à l'eau, tandis qu'avec l'acide chromique elles restent jaunâtres. • Comme les tissus sont moins solidifiés qu'avec l'alcool, il faut, pour obtenir une bonne coupe, y mettre beaucoup plus d'attention et d'habileté.

L'acide picrique enlève aux os leurs sels calcaires et permet d'en faire des coupes avec le rasoir; seulement il faut y plonger des morceaux d'os extrêmement petits.

Méthode de Bruche. — Cette méthode de durcissement, employée pour la première fois par Briicke, est assez complexe ; elle consisle à infiltrer un tissu avec de la gomme arabique que l'on précipite ensuite pai- l'alcool.

i»0 TKAITK TKGUNIQUK D'HISTOLOGIK.

Voici comniont on procède : Un peliL fragment (de 5 millimè- Ires à 1 centimètre de côté) d'un tissu préalablement durci dans l'acide chromique ou dans le liquide de MûUer est placé dans un petit cornet de papier blanc collé ordinaire; par-dessus l'objet on verse dans le cornet une solution sirupeuse de gomme arabique, et le tout est placé dans un verre à expériences rempli d'alcool. L'alcool pénètre peu à peu dans le cornet et y solidifie la gomme, de sorte que l'on finit par avoir un moule de gomme dans lequel se trouve inclus l'objet.

cisMîmeni Cqiiq métliodc cst asscz complexe et exige beaucoup de temps ;

gomme, emploie actuellement, dans plusieurs laboratoires allemands, entre autres dans celui de Rindlleiscli, la métbode suivante : La pièce est mise d'abord dans du bicbromatc de potasse, jusqu'à ce que ce liquide ait pénéti'é dans toute son épaisseur, ce qui a lieu généralement le lendemain, puis plongée dans une solution sirupeuse de gomme pendant vingt-quatre à trente-six heures et plus. Quand elle en est bien imbibée, on la met dans de l'alcool à 40 d(!grés ; l'alcool y dill'use, et elle prend une consistance convenable pour ([u'on imissc en faire des coupes. Cette méthode convient spéciahiuient pour les tumeurs, mais elle a l'inconvénient de gènin- beaucoup la coloration.

On substitue avantageusement dans ce procédé l'acide picrique au bichromate de potasse, en o[)érant du reste absolument de môme ; on peut aussi commencer par mettre le fragment de tissu d'abord ])endant vingt-quatre heures dans l'alcool, ensuite dans l'acide picrique pendant vingt-quatre heures, puis employer la gomme et l'alcool comme ci-dessus.

Acide osmique . — Cet acide est employé comme durcissant à la dose de 1/4 pour 100, jusqu'à la dose de 2 pour 100. (M. Schultze '). Les fragments de tissu doivent être très-petits, de quelques millimètres de côté seulement. Ils sont placés dans un tube de verre qui contient la solution d'acide osmique et qui doit être bien bouché. Au bout de dix à vingt-quatre heures l'action du réactif est complète. Si le durcissement n'est pas suffisant, la

' Ce réactif est indiqué pour la première fois dans les Archives de Max Schultze, 1865, p. 132. Son introduction en iiistologie est généralement attribuée à M. Schultze, mais cet auteur raconte lui-môme, à l'endroit que nous citons, que l'acide osmique lui a été recommandé par un autre histologiste, F. E. Schuîze, avec les indications générales pour son emploi. Depuis lors, Max Schultze a trouvé des applications si nombreuses de ce réactif, qu'on a l'habitude de lui en attribuer la découverte. — Nous n'en parlons ici que comme réactif durcissant, renvoyant au chapitre des imprégnations ce que nous avons à en dire à ce point de vue.

MÉTHODES FOUR LES COUPES. fil

pièce est placée dans l'alcool, ou mieux encore dans une solution de gomme pendant vingt-quatre heures, puis dans Talcool.

Chlorure d'or. — La dose que l'on emploie est de \ à ^1 pour \ 00. (Cohnheim '.) Ce réactif n'est pas, à proprement parler, un rétictil' durcissant. Il est employé surtout pour colorer certains éléments; mais nous le plaçons ici parce qu'il produit dans quelques tissus, la cornée par exemple, une légère augmentation de la consistance qui permet d'y pratiquer facilement des coupes.

Manière de pratiquer les coupes sur les objets durcis. —

H faut distinguer deux cas : celui où les objets sont assez grands pour être tenus à la main, et celui où les fragments sont trop petits pour qu'on puisse les tenir.

Il y a plusieurs précautions à prendre pour faire une bonne coupe.

La surface de la pièce peut être salie par le contact des doigts, de la table, etc. ; elle est inégale et rugueuse par suite du rétrécissement qu'elle a subi ; il faut donc commencer par aviver cette surface avec le rasoir, et en couper une première tranche d'épaisseur variable. Celte première coupe doit être faite d'un seul coup, sans liachures. On peut la faire soit d'avant en arrière, soit d'arrière en avant. La section peut être pratiquée avec un rasoir à deux faces excavées, mais on la fait mieux avec un rasoir dont une des faces est plane : c'est celle que l'on applique sur l'objet. Puis on fait la seconde coupe aussi d'un seul Irait, el aussi franchement cpie possible.

Le rasoir doit toujours être mouillé; autrement la lamelle du tissu que l'on vient de détacher adhère au métal, s'y plisse ou s'y déchire ; lorsque le rasoir est mouillé, elle flotte sur une légère couche d'eau, el se détache facilement lorsque l'on plonge le rasoir dans l'eau. Le rasoir doit être tenu parfait ement horizontalement, pour que le liquide y reste.

Le meilleur liquide poiu" mouiller le rasoir est l'eau alcoolisée ; il arrive, en eJIel, le plus souvent, que les tissus contienneni des matières grasses ou sont inclus dans des substances grasses; le rasoir se graisse légèrement, et si on le mouille avec de l'eau pure, la graisse empêche l'eau d'y adhérer, el le rasoir n'esl mouillé que par places. Une légère proportion d'alcool empêche l'action de la graisse, et le liquide se répand également sur

• Cnhnheim, Ueber die EndiRung dcr sensiblcn Nervcn in dcr Hornhaut dcr Siiugeliiicre. — C.entralhlalt, 18G6, p. /iOi.

Inclusion dans la moelle fin sureau.

Inclu>ion

avec Is aroinme.

Inclusion dans la paraffine.

toute la lame. Dans le cas où l'on fait des coupes après durcissement dans l'alcool, le rasoir doit être mouillé avec ce réactif.

Quand les objets sont trop petits pour qu'on puisse les tenir à la main pour faire des coupes, on se sert de procédés divers pour les renfermer, les inclure dans une autre substance; on a alors un objet plus volumineux dans lequel on peut facilement faire des coupes qui comprennent à la fois l'objet inclus et la masse qui l'environne.

Hannover a proposé d'inclure les tissus dans d'autres tissus de l'organisme : ainsi- d'inclure des nerfs dans des muscles, dans des fragments du foie, etc. Cette méthode n'est plus guère en usage.

L'inclusion dans la moelle de sureau est un procédé d'un emploi généralement facile.

Si c'est un corps filiforme que l'on veut insérer, comme un filet nerveux ou un filament musculaire, on perce un trou dans la moelle d'e sureau avec une aiguille et l'on y introduit l'objet. Le trou doit être naturellement plus grand que l'objet et celui-ci n'y est pas maintenu; la moelle est alors plongée dans l'eau, et les portions refoulées par l'aiguille se dilatent et viennent s'appliquer exactement sur l'objet inclus.

Si l'objet est plus volumineux, on fait un trou dans la moelle à l'aide d'une lime ronde appelée queue-de-rat. Il faut faire le trou plus petit que l'objet, et d'autant plus petit que l'objet doit être plus comprimé. On l'élargit ensuite au moyen d'une baguette de verre avec laquelle on en comprime les parois; on y insère la pièce, et en plaçant le tout dans l'eau ou dans un liquide conservateur, la moelle revient sur l'objet et l'entoure exactement.

On peut aussi appliquer la pièce contre une lame de moelle de sureau et l'y coller avec de la gomme arabique, lorsque le tissu ne risque rien à être desséché.

Lorsque l'on ne craint pas pour le tissu l'action de l'alcool, on met une petite couche de gomme sirupeuse sur une de ses faces, que l'on appHque sur un morceau de moelle de sureau, et l'on plonge le tout dans de l'alcool fort ; la gomme est solidifiée par ce réactif, et l'objet se trouve fixé sur la moelle de sureau. Pour éviter que la gomme ne soit trop dure, on y ajoute de la glycérine en proportions variables, suivant le degré de dureté qu'il s'agit d'obtenir.

L'inclusion se fait aussi dans la paraffine. On fiibrique un petit baquet de papier, dans lequel on place l'objet, èt l'on verse par-

dessus de la paraffine fondue. Il ne faut pas que la paraffine soit trop chaude, autrement elle ratatine l'objet ; pour être assuré qu'elle est au degré voulu, il suffit d'attendre, pour la verser, qu'elle commence à se solidifier dans la capsule. Lorsque la paraffine est refroidie, l'objet se trouve inclus dans une masse de cette substance, et l'on peut y faire des coupes. Pour reconnaître l'endroit où se trouve l'objet, il est bon de le fixer avec une aiguille avant de verser la paraffine ; la position de l'aiguille indique celle de l'objet.

Stricker ' emploie pour les inclusions un mélange de cire vierge et d'huile fondues ensemble, et dont il fait varier les proportions suivant le degré de dureté qu'il veut obtenir.

Le beurre de cacao, que l'on a aussi proposé pour faire des inclusions, a été expérimenté dans notre laboratoire, mais ne nous a pas paru avoir d'avantage particulier.

Récemment Flemming'^ a recommandé l'inclusion dans du savon transparent sans glycérine. Ce savon est dissous dans l'alcool chaud ; on verse la solution sur l'objet, et quand le mélange est refroidi, le fragment se trouve inclus dans une masse convenable. Ce procédé a l'avantage de fournir une masse qui se coupe très-bien avec le rasoir, et dans laquelle l'objet est aperçu par transparence de façon que l'on peut beaucoup mieux diriger le sens des coupes que l'on veut faire.

Les substances généralement grasses dans lesquelles se fait l'inclusion ne se mêlant pas à l'eau, il faut débarrasser soigneusement les pièces de l'humidité qui pourrait être à leur surface, autrement cette eau reste interposée entre l'objet et la masse environnante, et l'objet n'est pas fixé. On comprend dès lors que ces modes d'inclusion conviennent surtout pour les pièces qui ont été traitées auparavant par l'alcool ; elles ont en eflet été débarrassées par ce réactif de l'eau qu'elles contenaient.

Les substances et les mélanges dont nous venons de parler peuvent aussi servir à inclure des objets durcis dans le microtome. Pour cela, on met au-dessus du petit plateau que supporte la vis du microtome un disque de liège qui ferme exactement la concavité du cylindre et que l'on fait monter plus ou moins haut, de manière à avoir une cavité cylindrique bien fermée par en

Inclusion ilun»

un mélange

de cire et d'iiuile.

Beurre de cacao.

Procédé do Flenimin-;

Inclusion dans le raicrolonic.

• Stricker, Handbuch dcr Lehre von den Gcweben. Leipzig, 1871, p. xxiii. '■2 Flemming,Arch. fur miiiroskop. Anatomic, vol. IX, 1873, p. 121.

bas. Sur la laine de liège, on fixe au moyen d'une épinglf! ou d'une aiguille, dans une position conv(;nable, le fragment di; lissu sur lequel on veut faire des coupes, et l'on verse par-dessus la paraffine ou le mélange de cire et d'huile, ou telle autre masse à inclure que l'on a choisie. L'objet se trouve ainsi solidement tixé dans le microtome, et il suffit de faire tourner la vis qui supporte le plateau et le disque de liège pour faire affleurer l'obj cl au niveau de la plate-forme et en faire dépasser successivement tles tranches aussi minces que l'on voudra.

L'inclusion des objets dans le microtome peut aussi se faire au moyen de la moelle de sureau, et suivant deux procédés. Dans le premier, on choisit un cylindre de moelle de sureau, dans lequel

la pièce à couper peut être conlenuc (B,lig. 33); on y pratique, suivant son axe, un trou avec une finie dite queue-de-rat, comme on le lait en chimie dans un bouchon, poui' y passer un tube. Ce trou doit avoir un diamètre inférieiH' à celui de la pièce. Pour hù faire acquérir une largeur sufiisante, on refoule la moelle de sureau dans tous les sens jusqu'à ce que la pièce entre sans difficulté. Il suffit alors de placer le tout dans l'eau ou dans la solution qui a servi à durcir la pièce, pour voir les parties de la moelle de sureau qui ont été comprimées revenii- sur ellc^s-memes, et s'appliquer sur la pièce de manière à la maintenir solidement. Cette première opération étant faite, le cylindre de moelle de sureau est placé dans le calibre o du microtome, et en tournant la vis, on le fait monter de teUe sorte qu'il affleure la plate-forme ou la dépasse plus ou moins, selon la volonté de l'opérateur.

Le second proc('d(' |)oui' fixer les objets dans le microtome consiste à les y caler au moyen de fragments de moelle de sureau. Après avoir placé la vis surmontée d'un disque de liège à une hauteur convenable, l'objet à inclure est placé sur ce disque et <;alé tout autour au moyen de fragments de moelle de sureau

FlG. 33. — Microlome.

d'une forme appropriée, crubortl comprimés avec les doigts, et que l'on enfonce en exerçant sur eux une certaine pression. Quand l'objet est ainsi à peu près fixé, on verse sur le tout de l'eau alcoolisée; la moelle de sureau s'en imbibe, se dilate et fixe trèssolidement la pièce.

Pour faire des coupes avec le microtome, il est nécessaire de se servir d'un rasoir à face plane ; cette face s'applique sur la plate-forme du microtome et se trouve de la sorte parfaitement guidée pour la coupe. 11 est essentiel en outre que le rasoir et la face supérieure du microtome soient bien mouillés, pour que la coupe que l'on fait glisse facilement sur le rasoir, comme nous avons dit plus haut (voy. page 8-4).

M. Betz ' a conseillé, pour faire des coupes au microtome, un rasoir dont l'une des faces est convexe, tandis que l'autre est évidée: cet instrument ne nous paraît avoir aucun avantage spécial.