CHAPITRE VIII

MÉTHODE!!» UC COLORATIOIK ET DE TEIiVTURE. — IMPRÉGIVit- TIO^S. — ÉCLAIRCISSE.VIEI^T DES OBJETS OPAQUES

Pour la coloration des tissus, il est important de bien connaître les méthodes et de tenir compte exactement de tous les détails des procédés ; une même matière colorante agit en effet d'une façon tout autre sur le même tissu, suivant qu'il est vivant ou qu'il est mort, suivant qu'il a subi telle ou telle préparation, qu'il a été traité préalablement par un réactif ou par un autr(\

Prenons par exemple les cellules à cils vibratiles de l'épilhélium de l'œsophage de la grenouille. Examinés dans le sérum ou dans l'eau pure, ces cils vibratiles continuent à se mouvoir. Si on les met à ce moment en contact avec une solution de carmin ou de toute autre matière colorante qui ne les tue pas immédiate-

K Betz, Archiv. fur mikroskop. Aiiatomie, 4873, )). 108

Teintures et imprégnalioiis

Election lie la matière colorante.

y« TRAITÉ TECHNIQUE D'HISTOLOGIE.

ment, la cellule demeure incolore , les cils continuent leur mouvement. Dès qu'ils s'arrêtent, dès que la cellule est morte, la matière colorante y diffuse ; le noyau se colore en rouge et la cellule en rose, tandis que le plateau et les cils demeurent incolores.

Si au contraire on a placé ces cellules dans l'acide chromique avant de les mettre en contact avec la matière colorante, le plateau et les cils se colorent, la cellule prend une teinte rosée et le noyau reste complètement incolore.

On voit combien il est essentiel, quand il s'agit de matières colorantes, de savoir par quels réactifs le tissu a passé avant d'être soumis à leur action.

Il faut distinguer, dans les colorations, les temtures, qui colorent les objets ou les parties des objets de la couleur que possède la solution dans laquelle ils ont été plongés, et les imjjrégnationSy dans lesquelles des sels métalliques produisent par le dépôt du métal des colorations tout autres que celles de la liqueur que l'on a employée.

Teintures. — Carmin. — G'estàGerlacli ' que revient l'bonnem' d'avoir introduit la méthode de coloration des tissus des animaux à l'aide du carmin. Cette méthode a marqué le début d'un progrès considérable dans les recherches histologiques et a conduit à de nombreuses découvertes. Elle est devenue aujourd'hui d'un emploi si général, que plus des trois quarts des préparations conservées dans une collection sont teintes au carmin.

La propriété la plus remarquable et la plus utile du carmin, c'est l'élection de la matière colorante qu'il renferme pour certains éléments à l'exclusion des autres. Pour voir cette propriété se manifester, pour voir certains éléments dans une préparation se colorer, tandis que les autres restent incolores, il est indispensable de connaître les bons procédés et de s'y tenir rigoureusement.

L'élection dépend de deux circonstances : la concentration de la solution, et le temps pendant lequel elle agit. Les solutions fortes produisent des colorations brusques; les faibles, des colorations lentes. Il faut se servir des unes ou des autres suivant les cas.

1. Gerlach, Mikroskopische Studien aus dem Gebiete der menschliclien Morphologie. Eiiangen, 1858.

Quand les tissas sortent de l'alcool, on peut les colorer brusque- Différences ment. On se sert pour cela de la solution suivante : la coloration

suivant les réactifs

Eau distillée ' 100 -cjuel.^.

Ammoniaque 1 soumis.

Carmin 1

Le carmin est broyé dans un mortier de porcelaine avec trèspeu d'eau; on y verse l'ammoniaque, qui dissout le carmin, et ensuite on ajoute le reste de l'eau.

Il faut qu'il y ait juste assez d'ammoniaque pour dissoudre le carmin; la coloration se fait d'autant mieux qu'il y en a un excès moindre. Si donc il y a un excès d'ammoniaque, il faut le faire évaporer en cbauffant la liqueur au bain-inarie ; le moment où l'on doit cesser de chauffer est indiqué par le commencement de précipitation du carmin. Le carmin se trouve en effet dans un état de combinaison instable avec les tissus; ce qui le prouve, c'est que, si un fragment de tissu teint au carmin est plongé dans l'ammoniaque, il se décolore complètement.

Pour colorer une coupe d'un tissu qui a séjourné dans l'alcool, on commence par la mettre dans l'eau pour qu'elle reprenne son volume primitif; puis on glisse au-dessous une lame de verre sur laquelle elle est amenée. Avec une pipette, quelques gouttes de la solution de carmin sont déposées à côté de la préparation ; celle-ci est conduite avec une aiguille au milieu du liquide coloré ; elle y est laissée une demi-minute ou une minute, et ensuite elle est remise dans l'eau pour la faire dégorger. La matière colorante ne reste que sur les noyaux des cellules, les cylindraxes des nerfs, etc.

On peut aussi employer la coloration lente pour les pièces à l'alcool; mais elle sert surtout pour les tissus qui ont séjourné dans l'acide chromique ou le bichromate de potasse. Voici comment on procède. On prend environ 20 centimètres cubes d'eau distillée, et l'on y ajoute goutte à goutte avec une pipette la solution de carmin jusqu'à ce que l'eau ait pris une teinte fleur de pèclicr.

Cette solution, après avoir été filtrée, est mise dans un petit baquet au fond duquel a été placée une feuille de papier à filtrer. Sur ce papier sont déposées les coupes que l'on a faites ; le baquet est recouvert pour éviter la poussière. Au bout de vingtquatre à quarante-huit heures, la préparation est colorée. Les coupes sont mises sur du papier à filtrer, parce que, si elles

Ranvikr, llistol. 7

reposaient clireclcmonl sur le fond du vase, la face inférieure de la préparation aurait bientôt absorbé le carmin de la couche mince du liquide qui se trouverait au-dessous, et ne se colorerait pas sufiisamment, tandis qu'avec le papier à filtrer, il se diffuse continuellement, au-dessous de la pièce, de nouvelles quantités de carmin.

Lorsque la pièce a été durcie dans l'acide cliromique avant d'être soumise à l'action du carmin, la coloration ne porte pas sur les mêmes éléments que lorsqu'elle n'a subi aucune préparation ou qu'elle a été durcie dans l'alcool ou l'acide picrique. Après l'acide chromique, ce sont les faisceaux de tissu conjonctif qui se colorent, tandis que les noyaux des cellules ne se colorent pas. Les cylindraxes des nerfs seuls, qui ont une très-grande affinité pour le carmin, se colorent dans tous les cas. On peut cependant arriver à colorer les noyaux en enlevant l'excès d'acide chromique par un séjour dans l'eau de vingt-quatre à quarante-huit heures, et en plongeant ensuite la pièce dans l'alcool ou dans un mélange d'alcool et d'acide acétique; puis reprenant par l'eau et soumettant à la coloration au carmin.

Après avoir séjourné- dans l'acide picrique, les pièces se colorent facilement. La coloration brusque est préférable.

Au contraire, quand on a fait usage de l'acide osmique, la coloration par le carmin se produit difficilement et est extrêmement lente, mais l'élection se fait sur les mêmes éléments qu'après l'action de l'alcool, et à ce point de vue l'acide osmique diffère complètement de l'acide chromique.

Les imprégnations au nitrate d'argent en solutions fortes empêchent l'élection du carmin; une pièce fortement imprégnée par l'argent se colore uniformément dans tous ses éléments. Les imprégnations faibles n'exercent aucune influence et laissent l'élection se produire dans toute son intégrité.

Solutiojis de carmin permanentes et bien déterminées. — Car min de Freij. — La solution ordinaire de carmin a deux inconvénients : rammoniaqueens'évaporant laisse précipiter le carmin, et d'autre part il peut s'y développer des infusoires. Frey, en suivant les principes de Gerlach, a réussi à éviter ces inconvénients en préparant la solution suivante :

Carmin. . .. . .

Eau dislillce

08^30 30 gram.

Ammoniaque, q. s. jusqu'à dissolution; on ajoute ensuite:

Glycérine Alcool.. . .

Cette liqueur n'a pas un grand avantage sur la solution carminée ordinaire au point de vue de la coloration, mais elle se conserve longtemps sans altération.

Carmin de Bcale. — En voici la formule :

30 gram.

Carmin 0'J'',G/i

Ammoniaque

Eau distillée 60 gram.

Glycérine 60

Alcool 15

Cette solution n'offre aucun avantage réel; elle a même l'inconvénient de rendre la coloration diffuse.

Carmin oxalique de Thiersch. — En voici la formule :

Carmin 1 .

Ammoniaque 1

Eau ". . 3 1

Acide oxalique 1 ■]

Eau 22 )

Alcool absolu 12

On fait un premier mélange de carmin, d'ammoniaque et d'eau, dans les proportions indiquées, et un second mélange d'acide oxalique et d'eau; on prend 8 parties de ce second mélange pour une du premier, et l'on ajoute au tout 12 parties d'alcool absolu. Quand il se fait un précipité, on ajoute quelques gouttes d'ammoniaque.

Carmin acétique de Schiveigger-Seidel. — L'ammoniaque nécessaire pour dissoudre le carmin exerce sur les éléments délicats l'action fâcheuse des alcalis en général. Schweigger-Seidel a essayé de l'éviter en faisant un carmin acide.

Pour cela, il verse peu à peu dans la solution ammoniacale (h; carmin de l'acide acétique jusqu'à produire la neutralisation complète, et même à la dépasser un peu. Il se fait un précipité peu abondant, qui est sépare par iiltralion, et l'on obtient une

liqueur d'un rouge vineux. Les préparations y sont laissées pendant quelques minutes, puis plongées dans un mélange de :

Eau 200 gram.

Acide chloi'liydrique 1

Quelle que soit la liqueur carminée que l'on emploie, il est nécessaire, pour avoir une belle élection, de conserver les pièces dans le baume ou dans un milieu acide ; on se sert généralement à cet effet de l'acide acétique, mais l'acide formique vaut mieux. Le meilleur milieu est le mélange de :

Glycérine 100

Acide formique 1

que nous avons indiqué depuis plusieurs années.

On trouvera plus loin le détail de ces procédés dans le chapitre qui traite de la conservation des préparations.

Carmin jncriquc. — Picro-carminate d'ammoniaque. — Cette solution, que nous avons imaginée et dont nous nous servons, a l'avanlage de n'agir ni comme acide ni comme alcali. l'icimniiiuM Pour la préparer, on verse dans une solution saturée d'acide rânlilnatc. picriquc du carmin dissous dans l'ammoniaque, jusqu'à saturation, puis on évapore dans une étuve. Après réduction des quatre cinquièmes, la liqueur refroidie abandonne un dépôt peu riche en carmin qui est séparé par fdtration. Les eaux mères évaporées donnent le picro-carminate solide sous la forme d'une poudre cristalline de la couleur de l'ocre rouge. Celte poudre doit se dissoudre entièrement dans l'eau distillée; une solution au centième est la plus convenable.

Il y a deux manières de faire agir le picro-carminate d'ammoniaque (que nous appellerons dorénavant, pour abréger, picrocarminate). La première consiste à en mettre quelques gouttes dans un verre de montre et à y placer la coupe pendant im temps variable suivant les préparations que la pièce a subies auparavant. Du reste, l'avantage de cette solution, c'est que la coloration ne s'exagère pas par un séjour prolongé, comme avec les autres' préparations de carmin. L'autre méthode consiste à mettre du pici'O-carminate sur la lame de verre avec l'objet à colorer, à couvrir avec une lamelle et à fermer la préparation pour

MÉTHODES DE COLORATION. ' ' iOS

substances que nous venons do passer cn révue. Si, par exemple-,, on le fait agir sur un tissu qui contient uji grand nomljre d'éléments divers comme le mésentère, on verra les noyaux se colorer en beau violet, les nerfs en bleu gris, les muscles lisses en bleu; le protoplasma des cellules en bleu là. où il est j*eune, la graisse en . bleu. foncé.

Une fois la coloration produite , la préparation 'est layee et montée dans de la glycérine. Tingt-qùatre- heitres après, on .remarque, que les noyaux sont décolorés; le prdtoplasma reste' bleu, et dans son intérieur apparaissent des granulations d'un bleu intense; les nerfs restent d'un bleu gris; dans les tubes nerveux se produisent aussi des granulations bleues. Ces granulations sont formées par les matières grasses du protoplasnia cellulaire ou de la myéline des 'tubes nerveux, décomposées par l'action lente de la glycérine; cette coloration intense par le bleu de quinoléijie appartient, efi effet, spécialement à la graisse. Elle se montre non-seulement sur la graisse qui est contenue dans les cellules adipeuses, lés cellules du foie; etc., mais encore sui' celle qui apparaît au moment de la digestion dans les cellules épithéliales de l'intestin.

Les préparations colorées par le bleu de quinoléine peuvent être soumises avec avantage, au moins dans quelques cas, à l'action de la potasse à 40 pour 100. L'élection de la matière colorante est alors complète et immédiate. Les noyaux sont incolores, le protoplasma cellulaire, les muscles et les nerfs sont colorés' en bleu clair et la graisse en bleu foncé.

Hématoxyline. — Cette substance colorante, aujourd'hui trèsusitée dans les recherches histologiques , a été introduite par Boehmer qui en a bien réglé le mode d'emploi. Il fait une première solution avec

Hématoxyline 0,35

Alcool absolu 10

(ît une seconde solution avec

Alun 0,iO

Eau disLiiléc 30

On verse quelques gouttes de la première solution dans la seconde, et il se produit un liquide d'un beau violet.

' Boehmer, Aerzlliclics Inlclli-enzblatl (Baicrn), 1865, n" 38.

d'eau dislilloe, il est inutile d'indiquer les formules des mélanges d'alcool et d'eau dont on s'est servi pour augmenter la solubilité de ces matières.

Le principal inconvénient de ces couleurs est de teindre tout uniformément, de n'avoir pas d'élection; s'il y a des différences de coloration, elles tiennent aux différences d'épaisseur et de densité des éléments. Ainsi, dans une cellule plate, le noyau, qui possède une quantité de matière plus considérable que le reste de la cellule, sera coloré d'une façon plus intense. Cependant les solutions de rouge d'aniline sont bonnes pour teindre les éléments après qu'ils ont été dissociés par un mélange d'alcool et d'eau. Neumann' les a conseillées pour colorer les tubes nerveux après l'action de l'acide osmique. Elles teignent des éléments ({ue le cai'min n'atteint pas, comme par exemple les globules rouges du sang, quand ils ont été une fois fixés par l'alcool et quelques autres reactifs.

lileii d'aniline. — Les deux espèces de bleu d'aniline indiquées à la page 58 sont employées dans les recherches liistologiques. Le bleu insoluble dans l'eau, en solution alcoolique, sert à injecter le système canaliculé des os. Il colore les restes de substance cartilagineuse sur les os décalcifiés. Précipité par l'eau, il fournit des granulations d'une extrême finesse reconnaissables au microscope.

Ce bleu ainsi précipité a été employé par Cohnheim dans ses recherches sur T inflammation.

Le bleu soluble en solution aqueuse ou dissous dans un mélange de : alcool, 1 ; eau distillée, % colore d'une façon parfois trèsavantageuse les cellules épithéliales dissociées après l'action d'un mélange d'alcool et d'eau.

Bleu de quiiioléine. — La meilleure manière d'employer cette substance est de la faire dissoudre dans l'alcool à 36 degrés ; on étend la solution d'une partie d'eau. Il faut se garder d'ajouter l'eau tout de suite, car le bleu ne s'y dissoudrait pas. Ce bleu a une grande puissance colorante, et il faut l'employer en solutions très-faibles. A cet état, on peut en faire usage soit sur des tissus frais, soit sur des coupes obtenues après durcissement dans l'alcool ou l'acide picriquc.ll diffère complètement dans ses effets des

' Nenmntin, Degcneration und Régénération nach Nervendurchschncidungen, in Archiv dcr Hcilkiindc, 18G8, p. 193

MÉTHODES DE COLORATKJN. ' ' 103

substances que nous venons do passer en révue. Si, par exemple-,, on le fait agir sur un tissu qui contient uji grand nomljre d'éléments divers comme le mésentère, on verra les noyaux se colorer (}n beau violet, les nerfs en bleu gris, les muscles lisses en bleu; le protoplasma des cellules en bleu là où il est j*eune, la graisse en bleu. foncé.

Une fois la coloration produite , la préparation 'est lavée et montée dans de la glycérine. Tmgt-quatre- heitres après, on remarque que les noyaux sont décolorés ; le prdtoplasma reste • bleu, et dans son intérieur apparaissent des granulations d'un bleu intense; les nerfs restent d'un bleu gris; dans les tubes nerveux se produisent aussi des granidations bleues. Ces granulations sont formées par les matières grasses du protoplasma cellulaire ou de la myéline des 'tubes nerveux, décomposées par l'action lente de la glycérine; cette coloration intense par le bleu de quinoléine appartient, efi effet, spécialement à la graisse. Elle se montre non-seulement sur la graisse qui est contenue dans les cellules adipeuses, lés cellules du foie;' etc., mais encore sur celle qui apparaît au moment de la digestion dans les cellules épitbéliales de l'intestin.

Les préparations colorées par le bleu de quinoléine peuvent être soumises avec avantage, au moins dans quelques cas, à l'action de tapotasse à /*0 pour 100. L'élection de la matière colorante est alors complète et immédiate. Les noyaux sont incolores, le protoplasma cellulaire, les muscles et les nerfs sont colorés en bleu clair et la graisse en bleu foncé.

Hématoxijline. — Cette substance colorante, aujourd'hui trèsusitée dans les recherches histologiques , a été introduite par Boehmer qui en a bien réglé le mode d'emploi. Il fait une première solution avec

llcmatoxylinc 0,35

Alcool absolu 10

et une seconde solution avec

'^li'n 0,10

Eau distillée 30

On verse quelques gouttes d(; la première solution dans la so conde, et il se produit un liquide d'un beau violet.

' Boehmer, Aerzlliciics lulelligenzblalt (Baicrn), 1865, rio 38.

Mohjhdate d'ammoniaque. — Krausc a recommandé ce réactif à la dose de 5 pour 100; en vingt-quatre heures, il colore les tissus en bleu. On obtient une coloration plus forte en faisant macérer ensuite les tissus dans l'acide galliquc ou pyrogallique. Nous n'avons pas essayé ce réactif.

Carmin d'indigo (Thiersch). — On traite le carmin d'indigo (voy. plus haut, page 58) en pate par un mélange de :

Acide oxalique 1

Eau dislilléc 22 à 30

et l'on filtre le liquide. Pour avoir une solution moins colorée, il faut étendre ce bleu avec de l'acide oxalique dilué.

Iode. — L'iode constitue un réaclif beaucoup plus important. La formule dont je me sers est la suivante :

Eau distillée 100

lodurc de polasMum 2

Iode f[. s. pour saturer.

Il faul loujours laisser au fond du flacon quelques cristaux d'iode pour saturer la liqueur. Autrement l'iode de la solution se transforme peu à peu en acide iodbydrique, qui ne colore pas.

L'iode colore en brun à peu près tous les éléments ; cependant dans le cartilage il ne colore que faiblement la substance fondamentale hyaline et la capsule, mais il teint la masse cellulaire en brun foncé. La graisse est colorée plus foj'tement que le protoplasma. La matière glycogène est colorée en un rouge acajou, qui tranche très-bien sur la couleur brune donnée aux autres parties par l'action de l'iode. Ce réactif constitue donc un très-bon moyen pour la découvrir.

Il sert aussi à déceler la matière amyloïde, qu'il colore en brunacajou; on ajoutant ensuite de l'acide sulfurique, cette coloration passe quelquefois, mais pas toujours, au bleu verdâtre.

On peut aussi employer comme réactif colorant le sérum trèsiodé dont il a été question plus haut (voy. p. 76). Ce réactif est surtout précieux dans l'étude du tissu conjonctif embryonnaire et des éléments qui contiennent la matière glycogène.

iinpri'Knations. — Nitrate d'argent. — Ce réactif, signalé d'abord [)ar Coccius, a été beaucoup mis en usage par llis, et

MÉTHODES DE COLORATION. lO:;

surtout par Recklini'luuisGn.', qui a commence à en régulariser l'application et à en donner une technique à peu près exacte. Pour ce réactif plus que pour tout autre, il est indispensable de se servir d'une bonne méthode, autrement on peut obtenir les résultats les plus contradictoires, comme nous le verrons dans la suite. C'est parce que l'emploi n'en a pas toujours été bien l'égié que l'on a contesté et que certains observateurs contestent encore l'exactitude des images fournies par les imprégnations d'argent; c'est au "contraire un procédé qui donne les meilleurs résultats quand il est bien appliqué.

Le nitrate d'argent peut être employé en solution ou à l'état so- ■ lide. Parlons d'abord de ce dernier procédé, qui est le moins usité.

Il est d'une application simple et fournit de bonnes prépara- j'^ârgent lions. On s'en sert avec avantage pour la cornée et le tissu fibreux; il ne convient pas pour les épithéliums. Pour la cornée, par exemple, voici comment il faut procéder : L'œil étant enlevé, un morceau de nitrate d'argent est passé rapidement sur la surface antérieure de la membrane restée en place. La cornée est détachée et placée dans l'eau distillée; l'épithélium est chassé avec le pinceau. Le nitrate d'argent, dissous par le liquide qui baigne la cornée, a traversé la couche épithélialc et est venu se réduire sur le tissu fibreux, qu'il colore après l'action de la lumière. Les cellules, au contraire, sont ménagées par l'argent et restent incolores.

Le nitrate d'argent est plus fréquemment employé en solution. fg'n[{"X On fait généralement usage de la solution à 4 pour 100, à laquelle (l'argom. on ajoute 2, 3 ou -4 parties d'eau. A cet effet, on aspire avec une pipette non graduée une quantité donnée de la solution , par exemple jusqu'à un trait fait au diamant sur le verre; cette solution est déversée dans un baquet, puis on aspire deux fois avec la pipette une quantité égale d'eau distillée que l'on y ajoute, et l'on a une solution à 1 pour 300.

On pourra se procurer instantanément d'une façon analogue des solutions à 1 pour 400, 1 pour 500, 1 pour 1000, etc.

Pour se servir de ces solutions, il y a plusieurs méthodes; il iluU les suivre exactement et employer toutes les précautions indiquées, si l'on veut éviter les erreurs.

1 Voyez pour rhisloririue : Reckliiifjliuusen , Zur Gcscliiclite iler Versilbcningsmelliodc [Avch. de Vù-chow, 18G3, vol. XXVII, p. /iig).

l'l'écauliolis h prendre

pour l'iinpréi^iiii-

lliwi.

liupréguuliun sur pince.

Procédé pour les fflandcs.

Ainsi, pour une membrane comme l'épiploon, il faut la tondre sur un baquet de porcelaine comme la peau d'un tambour, l'arroser avec une pipette remplie d'eau distillée pour la nettoyer des albuminates et des globules blancs qui peuvent être à sa surface, puis on l'arrose avec une solution de nitrate d'argent. Pour obtenir des imprégnations vives, il est nécessaire que cette opération se fasse au soleil ou du moins à une lumière éclatante. Dès que le tissu blanchit et qu'il commence à passeï- au gris noirâtre, la membrane est détachée et portée dans l'eau distillée ; après avoir été lavée, elle est placée immédiiitement sur la lame de verr-e, et l'on en fait des préjiarationsdélinilives d'après les méthodes qui seront indiquées plus loin.

Si on la laissait séjourner dans l'eau dislillée, les cellules se détaclieraient et l'on ne les verrait plus.

Si la membrane n'était pas bien tendue, l'argent se déposerait non-seulement dans les espaces intercellulaires, mais partout où il y aurait le plus léger pli, et l'on ne pourrait plus se rendre compte de la forme des cellules.

Si la membrane n'était pas arrosée avec de l'eau distillée avant de l'imprégner, partout où il y aurait eu un fragment d'albuminate, il se ferait un dépôt d'argent, et l'on croirait voir quelque disposition normale du tissu. C'est ainsi bien souvent que des stomates ont été décrits, tandis que ce n'étaient que des impuretés de la préparation.

La méthode de l'imprégnation sur place est encore préférable. Pour examiner, par exemple, le mésentère d'une grenouille, le ventre étant ouvert, l'intestin est tendu avec la main, et après avoir arrosé le mésentère avec une pipette remplie d'eau -distillée, on y laisse tomber goutte à goutte la solution de nitrate d'argent. Ce procédé a l'avantage de permettre à l'albumine et au sang qui pourraient se trouver sur le mésentère d'être entraînés par le nitrate d'argent qui s'écoule, et de ne pas occasionner sur la préparation des images trompeuses.

S'il s'agit d'imprégner une glande, par exemple la glande Sousmaxillaire du chien, on y pratique, avec un rasoir trempé dans l'eau distillée, une incision franche au milieu de la masse; il y aura là une surface où se trouveront les différents éléments histologiques qui constituent la glande. On fait passer sur cette surface un courant d'eau distillée, auquel succède un courant de nitrate d'argent. La surface blanchit, puis brunit; on lave à l'eau

distillée. Les coupes se font parallèlement à la section , elles sont parfaitement imprégnées et rendues plus faciles à faire parce que la surface durcie par l'argent guide le trajet du rasoir.

Si la solution est trop faible, par exemple à 1 pour 500 ou à 1 pour 1000, ou si la lumière n'est pas vive, au lieu d'une imprégnation, il se produit une coloration plus ou moins forte. de l'ensemble des tissus, et tout autrement répartie que l'imprégnation. Ce sont les noyaux des cellules qui sont le plus colorés, puis le protoplasma, tandis que la substance intercellulaire ne contient que très-peu d'argent.

En général, dans une bonne imprégnation, le contenu cellulaire et surtout les noyaux n'apparaissent pas.

Chlorure d'or. — Ce réactif, que Cohnlieim* a introduit en histologie, a été employé par beaucoup d'observateurs, surtout pour la cornée.

On fait usage d'une solution à 1 pour 200; la cornée y est plongée jusqu'à ce qu'elle prenne une couleur jaune-paille; alors elle en est retirée, lavée à l'eau distillée, et mise dans 50 grammes d'eau distillée, à laquelle est ajoutée une goutte d'acide acétique, et le tout est exposé à la lumière. La masse devient violette ; il se produit de l'or métallique en poudre si fine, qu'elle n'est pas visible au microscope. On traite de la même façon d'autres tissus, en faisant durer la macération d'autant plus longtemps que le morceau est plus gros. Il convient de prendre les fragments aussi petits que possible.

Ces préparations gagnent en netteté lorsqu'elles sont conservées dans la glycérine, mais seulement pendant un certain temps ; ensuite elles se détériorent, et au bout de quelques mois elles n'ont plus aucune valeur. Du reste, cette mélliode, qui donne parfois de très-beaux résultats, est très-incertaine ; elle échoue souvent, sans que l'on puisse découvrir aucune raison de cet insuccès : ce qui prouve que toutes les conditions de son application ne. sont pas encore bien déterminées.

Chlorure double d'or et de potassium. — Ce réactif, dont Gei'lach- a tiré un très-bon parti dans un certain nombre de recherches histologiqucs, a une action semblable à celle du chlorure d'or, seulement elle est plus certaine. Il peut être appliqué

' Cohnheim, Vircliow's Archiv, 1867, vol. XXXVIil, p. 343. ■- Gerlach, Slrickcr's Handbuch, p, 678.

dans les mômes conditions et à la même dose; cependant Oerlach l'a employé en doses extrêmement laibles, à 1 pour iOOOO, soit pour colorer de la moelle durcie dans le bichromate d'ammoniaque, soit dans le but de faire apparaître sur des muscles Irais le réseau nerveux terminal. Le détail de ces méthodes sera donné plus loin, à propos de ces tissus.

Acide osmique. — L'acide osmique sert non-seulement à durcir les tissus, mais encore à en colorer certains éléments en noir plus ou moins intense, nuancé de brun ou de bleu. C'est ainsi que la myéline est colorée en noir bleuâtre et la graisse en noir brun. Le muscle est coloré en brun clair. Nous nous étendrons davantage sur l'emploi de ce précieux réactif colorant, lorsque nous parlerons du système nerveux.

Chlorure de palladium. — F. E. Schulze, qui a indiqué ce réactif, l'emjjloie à 1 pour iOOO. Pour que la dissolution s'effectue, il faut ajouter quelques gouttes d'acide chlorhydrique; au bout de trois ou quatre jours, les tissus sont assez durs, d'après cet auteur, pour que l'on puisse faire des coupes; les muscles sont colorés en brun, tandis que la graisse reste incolore.

Inipré(/natio)i par le bleu de Prusse formé au sein des tissus. — Ce procédé (Leber') consiste à plonger d'abord la cornée (car c'est surtout pour cet organe que cette méthode a été mise en usage) dans du sulilite de protoxyde de fer à 1 pour 200 pendant quelques minutes, puis dans du prussiale rouge (ferricyanure de potassium) à 1 pour iOO; après cela, on lave à l'eau distillée. Nous y reviendrons à propos de la cornée.

Éelnircisscnicnt des objets opaques. — Un poiut important

de la technique microscopique est de rendre les objets plus transparents. On peut y arriver de deux façons, soit en leur faisant subir des modifications chimiques, soit en les imprégnant d'une substance qui ait à peu près le môme indice de réfraction qu'eux-mêmes. — On peut aussi combiner ces deux procédés.

Substances qui agissent sur les tissus par modifications chimiques. — Les liquides qui rendent les tissus plus transparents en agissant de cette ûiçon sont certains acides : l'acide formique, l'acide chlorhydrique, l'acide acétique. C'est l'aride acétique qui est le plus généralement employé. Ces acides agissent

' Le/mr, Ucbcr cinigc anderweilige Impiiignalions mclhoden der Ilornhaulc (Arch. fiirOplithalmol., vol. XIY, p. 300).

en gonflant certains éléments, de ra;inière ù en former une masse à peu près homogène. Ainsi les faisceaux du tissu conjonclif, plus ou moins opaques à l'état frais, sont transformés par l'action de l'acide acétique en une masse transparente où l'on distingue à peine encore des stries ; le protoplasma granuleux des cellules devient aussi transparent, par suite du gonllement des grains albuminoïdcs dont il est composé; de cette façon les éléments qui ne subissent pas ce gonflement, comme par exemple les noyaux, apparaissent beaucoup plus nettement. Ce qui prouve que c'est bien là le mode d'action de l'acide acétique, et qu'il ne fait que gonller et non dissoudre les éléments, c'est que l'on peut ramener un tissu à sa forme primitive en enlevant l'acide que l'on a fait agir sur lui, si toutefois il n'a pas été employé à dose trop concentrée. Il y a longtemps que l'on fait usage de ce mode d'éclaircissement; on en a même beaucoup abusé : c'est un moyen dont il ne faut user qu'avec ménagement et dans des cas spéciaux. Du reste, les acides doivent toujours être employés à des doses trèsfaibles ; autrement on voit disparaître tous les éléments du tissu, qui se confondent en une masse gélatineuse, au milieu de laquelle on ne reconnaît plus môme la trace des éléments primitifs.

Substances qui éclaircissent les objets en s'interjjosant entre leurs éléments. — Le mode d'action de ces substances est facile à comprendre au moyen d'un exemple très-simple. C'est une expérience que chacun peut répéter. Si l'on prend une lame de glace transparente et qu'on la pile de manière à la briser en une quantité de petits morceaux, ces morceaux forment une masse opaque à travers laquelle la lumière ne passe pas. Cela tient à ce que les rayons lumineux qui traversent cette masse, passant alternativement à travers un fragment de verre et un petit espace rempli d'air, y sont réfractés suivant les sens les plus différents correspondant à leurs angles variés d'incidence, et finissent par se perdre en grande partie dans ces réfractions successives. Que l'on verse au contraire sur ce verre pilé du baume du Canada, on verra instantanément la masse s'éclaircir et redevenir transparente. En eiïct, l'indice de réfraction du baume du Canada est à peu près le même que celui du verre; les rayons lumineux ne passeront donc, pour ainsi dire, que par une seule substance au point de vue optique; ils n'éprouveront que peu de déviation, et la plus grande quantité d'entre eux arrivera à l'œil de l'observateur. C'est un but analogue que l'on se propose lorsque l'on

(k'Iaircit les préparations par ce second procédé. Les tissus à examiner sont en effet composés d'éléments divers entre lesquels une grande partie des rayons lumineux se trouve sulfisamment déviée pour ne plus arrivera l'œil; en interposant entre ces éléments des liquides qui ont à peu près la même réfringence, on arrive à se procurer des préparations beaucoup plus transparentes. Ces liquides sont surtout la glycérine, l'essence de térébenthine, l'essence de girofle, ^e baume du Canada et la résine d'Amraar.

Glijcérine. — La glycérine est la substance éclaircissante par excellence; non-seulement elle s'interpose entre les milieux ■ hislologiques de réfraction variée, mais elle infiltre ces milieux eux-mêmes, et en rapproche ainsi l'indice de réfraction du sien propre.

MÏcmirmC lïuit se garder de faire agir la glycérine brusquement sur des remploi (lo tissus frais; autrement ces tissus se ratatinent et deviennent

la g'lycoi'iiu'. '

impropres à l'observation. En effet, la glycérine, qui est trèsliygromélrique, s'euq)are de l'eau des tissus, et ceux-ci, manquant du soutien que leur donnait ce liquide interposé, reviennent sur eux-mêmes. On ne doit faire agir la glycérine pure que sur des objets qui sont déjà fixés dans leur forme, c'est-à-dire qui ont été soumis préalablement à l'action de l'un ou l'autre des réactifs durcissants ou modificateurs dont nous avons parlé plus haut. Dans les cas où les tissus ne sont pas suffisamment fixés par le réactif durcissant, il faut avoir soin que l'action de la glycérine se produise lentement et peu à peu. Il y a deux moyens pour atteindre ce but. Le premier est d'opérer avec un mélange d'eau et de glycérine. On dépose à côté de la lamelle une goutte de glycérine, et on laisse tomber à côté d'elle une ou plusieurs gouttes d'eau; avec la pointe de l'aiguille, les deux gouttes de liquide sont mélangées, et amenées au bord de la lamelle sous laquelle elles pénètrent par capillarité, surtout si l'on a soin de placer à l'autre bord de la lamelle un petit morceau de papier joseph en communication avec le liquide qui imbibe la préparation. Le papier joseph absorbe par capillarité le liquide qui se trouve sous la lamelle, et celui-ci est peu à peu remplacé par le mélange d'eau et de glycérine ; une fois què ce premier mélange a pénétré le tissu, on peut, si c'est nécessaire, déposer au bord de la lamelle une goutte de glycérine plus concentrée ou môme de glycérine pure ({ue l'on y fait pénétrer de la même façon.

MÉTHODES DE COLORATION. Hl

L'aiUrc moyen pour produire lentement l'acLion de la glycérine consiste à en placer une goutte au bord de la préparation et en conta('t avec le liquide qui l'imbibe, après avoir fixé les quatre coins de la lamelle au moyen de la parariinc. De cette façon, la glycérine pénètre dans la préparation progressivement, au i'ur et à mesure que s'évapore le liquide qui l'imbibait.

En général, il ne faut pas faire agir la glycérine sur des tissus frais délicats ; ils y deviennent en effet si transparents au bout de quelques heures, qu'il n'est plus possible d'y distinguer aucun élément.

Sur les pièces durcies par l'alcool, l'acide chromique et les autres réactifs qui obscurcissent les tissus (et ce sont ceux où elle agit avec le plus d'avantage), l'action de la glycérine se produit lentement, mais elle se poursuit constamment, de telle sorte que des préparations opaques, qui paraissent au premier abord n'être pas modifiées du tout par la glycérine, deviennent au bout de quelque temps parfaitement transparentes.

Essence de térébenthine. — On ne peut mettre directement dans l'essence de térébenthine que des préparations sèches ; si l'on y mettait des préparations humides, on les rendrait plus obscures au lieu de les éclaircir. En effet, comme l'essence de térébenthine n'est pas miscible à l'eau, il y aurait des éléments où l'eau séjournerait, et d'autres qui s'imbiberaient d'essence de térébenthine; les rayons lumineux se briseraient aux surfaces de séparation de ces miheux, et l'objet deviendrait opaque.

Il ne faut donc pas employer l'essence de térébenthine directement pour les préparations à l'eau, mais substituer d'abord à l'eau un corps qui puisse se mélanger avec l'essence. x\ cet effet, on commence par tremper les préparations dans un mélange d'alcool et d'eau, puis dans l'alcool ordinaire, enfin dans l'alcool absolu, et quand toute l'eau a été ainsi chassée de la préparation, on la trempe dans l'essence, qui peut alors se mêler d'abord à l'alcool et puis s'y substituer. Il est nécessaire de faire agir des mélanges d'alcool et d'eau de plus en plus forts avant d'arriver à l'alcool absolu, si l'on veut éviter le ratatinement qui se produit sur les parties délicates par l'action brusque de l'alcool. Les préparations traitées par l'essence de térébenthine deviennent si transparentes, que l'on peut à peine y reconnaître le contour des éléments. Aussi cette méthode convient-elle pour les préparations où les vaisseaux ont été injectés. Elle fait dispai-aître toiit, excepté

l'injection. Elle est aussi d'un fort bon usage pour des tissus dans lesquels on a préalablement coloré certains éléments à l'aide de réactifs divers : ainsi les noyaux et les cylindraxes colorés par le carmin apparaissent très-nettement dans les préparations à la térébenthine.

Essence de girofle ou d œillet. — Cette essence a un indice de réfraction plus élevé que la précédente et un pouvoir éclaircissant })lus considérable. Il n'est pas nécessaire que la déshydratation des pièces par l'alcool soit aussi parfaite qu'avec l'essence de térébenthine. Elle est donc préférable, d'autant plus qu'elle a une agréable odeur.

Il ne serait pas commode de conserver les préparations dans l'une ou l'autre de ces essences sans les fermer; mais en pratiquant l'inclusion dans le baume ou dans un vernis, comme nous allons le dire, on obtient des préparations qui se conservent fort bien.

Baume du Canada. — Pour employer cette substance, on la dissout dans la térébenthine, ou mieux encore dans le chloroforme. Suivant la quantité de chloroforme que l'on y ajoute, on peut lui donner des degrés de consistance variés.

Résine d'Ainmar. — On emploie cette résine en solution dans la térébenthine ; elle a sur le baume du Canada l'avantage de ne pas présenter une teinte jaune.