TECHNIQUE POUR L ETUDE DES TRY PAN OSOM ES

5> 1. — Recherclie et examen à l'état frais.

Pour Tobservation des trypanosomes dans le sang frais, on se procure une goutte de sang de l'animal infecté. Quand il s'agit d'un Mammifère, on fait une écorchure à l'oreille, ou bien (rat, souris) on coupe l'extrémité de la queue; pour les Oiseaux, on fait une piqûre à l'une des grosses veines qui font saillie à la face interne de l'aile; pour les Reptiles, on prend le sang, suivant les cas, à l'extrémité de la queue ou à un doigt; pour les Batraciens, on sectionne un doigt d'une des pattes, de préférence le pouce d'une patte antérieure; enfin, chez les Poissons, on sectionne un ou deux rayons de la nageoire caudale ou bien on fait une petite écorchure aux branchies.

La goutte de sang est recueillie sur une lame porte-objet et on recouvre d'une lamelle. Si l'on désire étudier la structure des parasites, le sang doit être en couche mince; il importe, en elîet, que les trypanosomes ne soient pas dissimulés, sur tous les points de la préparation, au milieu des hématies. Les mouvements que les trypanosomes impriment aux hématies permettent de reconnaître l'existence des parasites à un très faible grossissement (100 diamètres) quand ils sont nombreux, et facilite leur recherche à un grossissement plus fort (300 ou 400 diamètres) quand ils sont en petit nombre dans le sang.

Dans ce dernier cas, si l'on désire seulement constater la présence des parasites, il y a avantage à avoir une couche relativement épaisse de sang, où les globules serrés les uns contre les autres forment une couche en apparence uniforme. Avec quelque habitude, la présence des parasites se reconnaît alors aux mouvements giratoires qu'ils impriment aux hématies voisines, et l'on a ainsi l'avan-

tage d'observer une plus grande masse de sang. Mais il faut se garder de confondre avec d'autres parasites, tels que les spirochètes : il est bon de prolonger l'observation de la région en mouvement jusqu'à ce qu'on distingue nettement une partie du corps du trypanosomc. La confusion avec les microfiïaires, dont le corps cylindrique a une longueur qui atteint 200 ou 300 a, est plus facile à éviter.

Dans les cas douteux, en particulier quand il s'agit de faire le diagnostic microbiologique d'une trypanosomiase, il est souvent nécessaire d'examiner successivement plusieurs préparations de sang, et même, tant que l'examen est négatif, de le répéter plusieurs jours de suite (exemple : Ruminants atteints de nagana ou de surra, homme et mammifères divers infectés avec le Tr. gamhiense).

Pour faciliter la recherche des trypanosomes dans le sang. Kanthack, Durham et Blandford ont les premiers conseillé de centrifuger le sang rendu incoagulable; les trypanosomes se rencontrent dans la couche moyenne leucocytaire. Ce procédé est surtout utile pour rassembler, au-dessus des hématies, les parasites lorsque ceux-ci sont très nombreux.

Dans le cas de la dourine, nous verrons que l'examen doit surtout porter sur la sérosité sanguinolente des œdèmes; dans le cas de la maladie du sommeil, la recherche des parasites doit porter sur le sang, le suc de ponction ganglionnaire, et le liquide céphalorachidien de ponction lombaire. Gomme les trypanosomes sont généralement rares dans ce liquide, on le centrifugera avant l'examen.

Dans les cas où l'on veut faire des observations prolongées sur les trypanosomes, il faut employer des préparations, en goutte pendante, lutées à la paraffine ou à la vaseline, qui sont très utiles, notamment pour l'étude du phénomène de l'agglutination. Le sang est ou bien mélangé à de l'eau physiologique ordinaire, puis défibriné, ou bien mélangé à de l'eau physiologique citratée de manière à empêcher la coagulation, ou encore à du sérum d'animal neuf. Francis*, pour le Tr. Lewisi, conseille de laisser coaguler le sang : les trypanosomes passent dans le sérum où on peut les étudier débarrassés des hématies. Généralement au bout d'une heure entre lame et lamelle, au bout d'un temps un peu plus long en goutte pendante, le mouvement des trypanosomes se ralentit et l'on peut alors observer commodément leur forme et les mouvements de leurs diverses parties.

Pour hâter ce ralentissement des mouvements des trypano-

1. Francis, J$u11. n" 11, Hyij. Labor., U.S. Pub. Heallli a Mar. Hosp. Serv., Washington, iy()3.

somes, Plimmer et Bradford' conseillent d'ajouter à la goutte de sang une goutte d'une solution à 1 p. 100 de gélatine.

On a encore une bonne idée des trypan. à Tétai de mouvement en se. servant de microphotographies cinématographiques prises à Fultramicroscope, que Ton peut examiner en repos. Gomandon a exécuté des films très réussis de divers trypan. {Tr. Lewisi et trypan. pathogênes), et, avec le concours de Levaditi et Mutermilch, il a pu saisir sur le vif divers stades du phénomène de la phagocytose. Ces films constituent surtout un bon élément pour démonstrations.

§ 2. ^ — Procédés de fixation et de coloration.

A l'état frais, on peut étudier la forme générale des trypanosomes, l^urs mouvements, l'action des divers agents physiques et chimiques. Mais, pour se faire une idée précise de leur structure intime, il est indispensable d'avoir des préparations colorées après fixation appropriée. De nombreuses méthodes ont été proposées, dont nous allons passer en revue les principales.

Pour se rendre compte des déformations que la fixation fait subir au corps des trypanosomes, il est bon d'avoir des tests donnant une idée exacte des trypan. à l'état vivant. Minchin -, à qui l'on doit tant de notions intéressantes sur la technique microscopique appliquée à l'élude des trypanosomes, a insisté sur l'importance de ces « standard préparations ». 11 conseille de se servir de parasites fixés aux vapeurs d'acide osmique et examinés soit en goutte pendante, soit entre lame et lamelle, sans autre technique ou bien après l'addition à la préparation d'une solution de vert de méthyle acidulée ; on arrive à distinguer les deux noyaux (trophonucléus et kinétonucléus de Minchin) et la membrane ondulante.

Fixation. — Les trypan. étant surtout observés dans le sang, on a commencé tout naturellement à leur appliquer les procédés ordinaires pour l'étude du sang.

Fixation des frqttis desséchés. — Le sang est étalé sur une lame de verre en couche minche, le mieux avec un morceau de carton, par exemple une carte de visite, ou encore avec une lamelle. Il faut quelque habitude pour obtenir une couche assez uniforme et d'épaisseur convenable. On sèche le plus rapidement- possible, au besoin en agitant vivement la lame ou en l'approchant d'une flamme. On fixe dans l'alcool absolu (5 à 10 minutes) ou encore dans l'alcool

1. Plimmer et Iîradfoiid. Ccntralbl. f. BulUer.. !.. t. X.KVI, 18'.)"), p. 4i().

2. Minchin, Qiiarl. Jouvn. of micr. Se. t. IH. l'.lOil. p. 7").").

inéthylique (2 à 3 minutes); on laisse sécher ou on enflamme Talcool resté sur la lame.

Fixation aux vapeurs osmiques. — Quand, au lieu de sang, on a affaire à d'autres liquides qui peuvent renfermer des parasites : sérosités sanguinolentes retirées des œdèmes, liquide céphalorachidien, liquides des milieux de cultures, suc d'organes dilacérés ou écrasés, puis étalés, — ou encore à du sang anémique, ou simplement du sang dilué d'eau physiologique ou d'eau cilratée, la fixation après dessication n'est jamais aussi parfaite que pour le sang pur; souvent les trypan. de ces divers liquides apparaissent vacuolaires.

Dans ces cas, il est recommandé de fixer les frottis, faits de préférence sur lamelles, avant dessiccation, par les vapeurs osmiques. Minchin conseille d'employer une solution d'acide osmique à 4 p. 100 à laquelle on ajoute une goutte d'acide acétique glacial par 20 gouttes. Mais on peut utiliser des solutions moins concentrées, par exemple à 1 p. 100.

L'introduction de ce mode de fixation bien connu à l'étude des trypan.. est due à Gray et Tulloch (1905) ', qui l'ont employé pour les frottis faits avec les contenus intestinaux de tsétsés. C'est le procédé de choix pour les flagellés de l'intestin des invertébrés, que l'on veut ensuite colorer par une méthode dérivée de celle de Romanowsky.

Ce procédé réussit également bien pour le sang et, en particulier, la forme des trypan. est mieux conservée que dans les frottis fixés après dessiccation. Nous estimons que son emploi mérite d'être particulièrement recommandé et d'être généralisé. Quand le frottis est pauvre en albuminoïde, il y a avantage à lui ajouter une petite goutte de sérum d'un animal quelconque -.

Il faut avoir soin de laisser agir l'acide osmique très peu de temps, en moyenne de 10 à 15 secondes, 20 secondes au maximum.

En général, on laisse le frottis se dessécher; la dessiccation commence d'ailleurs pendant que les vapeurs osmiques agissent.

Il est recommandé de faire suivre cette fixation par une seconde à l'alcool absolu.

On peut, dans le cas des fixations aux vapeurs osmiques, éviter la dessiccation et faire passer alors les lamelles de liquide en liquide. Cette manière de faire ne paraît pas comporter d'avantages particuliers; il est préférable alors de recourir à des liquides fixateurs osmiques.

Fixation des frottis humides. — Les cytologistes condamnent souvent les fixations précédées ou suivies de dessiccation, ou au

1. Gray et Tulloch, Roy. Soc, Report of Ihe Sleep. Sickn. Conim. (no VIII), 1905.

2. Cette application de séruins frais a- été recommandée pour la première fois par Leishman dans le traitement des coupes.

TECHNIQUE ir,

moins formulent des réserves sur les résultats obtenus. Une étude minutieuse de la structure des trypanosomes doit donc être complétée par l'examen de préparations traitées conformément aux principes admis en cytologie. Mais nous tenons à dire explicitement que, pour la pratique journalière du laboratoire, les frottis secs suffisent. Ils donnent en particulier d'excellents renseignements pour Tétude comparée des trypanosomes.

Salvin-Moore et Breinl ' recommandent la fixation suivante :

Sur une lame enduite d'albumine glycérinée, on étale une goutte de sang (ou de tout autre milieu contenant les parasites) et, avant qu'elle n'ait séché, on la plonge dans le fixateur (de préférence le Flemming fort); on laisse 5-10 minutes; on lave et on passe lentement par les alcools jusqu'à l'absolu; puis on redescend dans l'alcool à 80' iodoioduré; ensuite alcool à 30°.

.Mais les liquides osmiquesT)nt rinconvénient de gêner les colorations et les divers auteurs (Rosenbusch, Minchin, Giemsa-,..) s'accordent maintenant pour recourir à la fixation au sublimé. On accorde généralement la préférence au liquide de Schaudinn qui est formé de 2 parties de sublimé à saturation et de 1 partie d'alcool absolu; on ajoute un peu d'acide acétique (1 p. 100 en moyenne). Rosenbusch recommande d'employer ce fixateur à froid.

Giemsa, qui a eu surtout en vue d'appliquer aux préparations humides sa méthode azur-éosine (v. ci-dessous), conseille de faire le frottis aussi mince que possible sur une lamelle ^, de laisser agir le fixateur 12 à 24 heures; la lamelle tout d'abord (lotte face enduite en dessous, plus tard on peut l'immerger. On lave rapidement à l'eau, puis on passe (5 à 10 min.) dans la solution :

lodurc de potassium 2 gr.

Eau distillée 100 ce.

Solution de Lugol 3 —

On lave encore à l'eau pendant un court temps; puis on enlève la teinte jaune de la préparation dans une solution aqueuse à 5 p. 100 d'hyposulfite de soude (10 min. environ). Enfin, on traite à l'eau courante pendant 5 minutes avant de plonger dans la solution colorante.

Dans des préparations qui n'ont jamais subi de- dessiccation, les trypanosomes sont plus petits que dans les autres.

Fixation des pièces. — Les méthodes de fixation des pièces,

1. Salvin-Moore et Breinl, Ann. of trop. Med. a. Parasit., t. I, 1907, p. 441.

2. RosENDuscn, Arch. f. Protistenk., t. XV, lOOi), p. 263. — Minchin, l. c. — Giemsa, Deutsche inedu. ]Voch., l'JO'J, n° 40.

3. Los lamelles sont toujours à lecoiiiinander quand on veut fixer des frottis liumides.

16 TRYPANOSOMES ET THYPANOSOMiASES

organes, etc., où Ton désire mettre en évidence des trypan., sont identiques à celles que nous venons d'indiquer pour les frottis humides.

Giemsa *, toujours en vue de l'application de sa méthode de coloration, conseille la fixation au sublimé de Schaudinn, l'inclusion à la paraffine et le débit en coupes de 4 a au plus d'épaisseur. Les coupes, une fois déparaffinées, sont passées par la série de liquides que nous venons d'énumérer.

Coloration. — Lorsqu'on veut colorer rapidement une préparation contenant des trypanosomes ou bien lorsqu'on n'a pas à sa disposition les colorants nécessaires pour appliquer les méthodes appropriées, on peut employer la solution alcoolique de fuchsine, ou bien une solution aqueuse de rouge Magenta, ou encore mieux une solution de phénate de thionine. La coloration est très rapide, quelquefois en moins d'une minute. Le noyau, le centrosome et le flagelle se colorent plus fortement que le protoplasme, et l'on obtient ainsi des préparations qui suffisent, dans la pratique, quand il s'agit seulement de reconnaître l'existence des trypanosomes et leur abondance.

Mél/wdes de Romanowsky et dérivées. — Four colorer convenablement les frottis de sang ou de milieux divers, fixés soit après dessiccation, soit par les vapeurs osmiques, il faut employer une méthode particulière : mélange colorant, à proportions définies, de bleu de méthylène et d'éosine. Ce mélange a été, pour la première fois, utilisé pour la coloration des hématozoaires (hématozoaire du paludisme) par Romanowsky.

La première application aux trypanosomes en a été faite en 1898 par Ziemann - (trypanosome de la grenouille), qui a ainsi coloré le noyau et le centrosome. L'année suivante, Rabinowitsch etKempner^ ont coloré, par cette méthode, le Tr. Leivisi. Mais les premiers résultats vraiment parfaits n'ont été obtenus qu'en 4900 par Wasielewski et Senn \ également pour le Tr. Leivisi: ces savants ont usé de la méthode de Romanowsky modifiée par Nocht.

La méthode suivante ° nous a donné d'excellents résultats.

Les solutions qui suivent doivent être préparées à l'avance.

1° lîleu de méthylène à l'oxyde d'argent ou bien Dori-el. Dans une fiole de 150 ce. environ, on met quelques cristaux d'azotate d'argent et 50 à 60 ce. d'eau distillée; quand les cristaux sont dissous, on remplit la fiole avec une solution de soude caustique concentrée et on agite: il se forme