Okhubo, C. B. Soc. Biologie, I. LXV1II, 11)1», p

3. Levaditi et Twort, G. B. Soc. Biologie, t. LXX, KM, pp. 64o, 7.'i3, 709, 927, 11)24 el t. LXXI, p. 127.

encore virulents pour la souris, ( les trypan. de nouvelle infection sont résistants in vitro au trypanocide. Les auteurs pensent qu'ils obtiennent ainsi une sélection de formes naturellement résistantes. Nous reviendrons plus loin sur ces faits.

Dans le chapitre de thérapeutique générale, il sera question de l'action in vitro des substances actives dans l'organisme vivant.

Nous nous contenterons de dire à cette place qu'il n'y a aucun rapport entre le pouvoir trypanocide in vitro et in vivo. La plupart des substances chimiques, actives dans l'organisme vivant, ne sont pas trypanocides in vitro. En revanche, des substances actives in vitro, extrêmement nombreuses comme on peut le supposer, très peu (émétiques, composés inorganiques d'arsenic) ont une action cura* tive dans les trypanosomiases.

Deux de ces substances méritent ici une mention spéciale : ce sont l'oxazirre et l'acridine, qui colorent électivement le centrosome. Nous en avons déjà parlé au chapitre III (voir p. 37).

§ 2. — Les trypanosomes en culture.

Conditions générales de la culture. — Nous avons vu que l'adjonction de sérums divers a pour effet général d'accroître la durée de conservation in vitro des trypanosomes. Par l'addition de sang défibriné à celui renfermant les trypanosomes, on arrive à cultiver ces organismes.

La culture se fait pour le mieux dans l'eau de condensation d'un milieu solide formé de gélose nutritive, à laquelle on a incorporé, alors qu'elle était encore à la température de 50°, le plus possible 'jusqu'à deux et trois fois son volume) de sang défibriné (voir le chapitre de Technique).

Ce problème de la- culture a été résolu pour le Tr. Lewisi et d'une façon générale pour tous les trypan. non pathogènes, de Bovidés, d'Oiseaux, de Batraciens, de Poissons. Les ensemencements de sang infecté réussissent bien et l'on peut affirmer qu'il suffit d'un très petit nombre d'individus pour qu'il y ait culture. On constate en effel que l'on réussit des cultures avec du sang dans lequel l'examen microscopique, même prolongé, ne permet pas de mettre en évidence des trypanosomes. Ils y sont donc extrêmement rares. Novy et Me Neal, les premiers ', ont obtenu des cultures, dans ces conditions, en ensemençant du sang de divers Oiseaux. Les chiffres qu'ils donnent mettent bien en lumière l'efficacité du procédé d'ensemencement.

I. Novy cl Me Neal, Journ. of inf. Dis., t. Il, t'005, |>. 2."i(i.

90 TRYPAN0S0MES ET TRYPANOSOMIASES

Ils oui reconnu, en combinant Les méthodes d'examen microscopique et de culture, la présence de trypan. clans le sang de 38 oiseaux. Sur te nombre, 19 ont été reconnus parasités par l'examen microscopique ordinaire ; dans ces cas, la culture a réussi toutes' les fois (10) qu'elle a été tentée. Chez 19, c'est-à-dire exactement la moitié des oiseaux parasités, l'infection a été reconnue seulement par le moyen de la culture (chez 5, les parasites ont été trouvés dans le sang- à un examen microscopique rétrospectif). Dans ces 19 derniers cas, comme pour les infections bactériennes, la méthode de culture s'est donc montrée un moyen plus délicat de recherche de parasites rares, que ne l'est le microscope. Comme celte méthode a été appliquée 43 fois seulement à des oiseaux chez lesquels l'examen microscopique était négatif, on a donc un pourcentage de 44 (19 sur 43).

Cet exemple prouve clairement la facilité des cultures des trypan. non pathogènes.

On verra, au chapitre spécial qui traite des trypan. propres aux bovidés, que ces organismes, rarement vus à l'examen direct, sont mis en évidence dans le sang d'un grand nombre d'animaux par le procédé des cul turcs; le milieu consiste simplement en bouillon nutritif ordinaire. Le sang que l'on ensemence, toujours en quantité appréciable, constitue sans doute l'apport nécessaire à la culture.

Les travaux de ces dernières années ont montré la réalité des anciennes observations de Danilewsky qui voyait le Tr.rotalorium de la grenouille se multiplier dans le sang parasité, gardé entre lame et lamelle, ou en goutte pendante. Le savant russe croyait observer le mode normal de multiplication du trypan. dans le sang circulant, alors qu'il avait sous les yeux un commencement de culture.

Les ensemencements de tube en tube réussissent bien et donnent lieu à des cultures luxuriantes, dans lesquelles les éléments sont en parfait étal.

Quand le flagellé est adapté au milieu gélose-sang, il arrive à se développer, non seulement dans l'eau de condensation, mais enCore à la surface de la gélose. D'après Ch. Nicolle et Manceaux \ on faciliterait ce modé de culture en se servanl de tubes où la gélose n'est pas trop desséchée et où on enlève l'eau de condensation : ce fait, qu'ils ont observé pour la Leishmania tropica, est sans doute applicable aussi aux trypanosomes.

Dans les conditions de culture que nous avons indiquées, les trypan. peuvent être gardés des années, à condition de les réensemencer assez souvent. Pour le Tr. Lewisi, tout au moins, la conservation de la virulence a pu être constatée au bout de 2 ans.

I. Nicolle et Manc.f.aux, G. H. Soc. Biologie, I. LXX, 11)11, p. 712.

La température de 25" et mémo la température ordinaire du laboratoire paraissent être très favorables pour ces cultures : elles poussent lentement, mais restent vivantes et virulentes très longtemps. A 34-37°, la culture se fait généralement plus vite, mais en revanche elle meurt en peu de jours; une température supérieure à 37° est rapidement mortelle. Ce sont des faits analogues à ceux que nous avons signalés concernant les trypanosomes conservés in vitro.

Les résultats obtenus pour les trypanosomes pathogènes sont beaucoup moins satisfaisants, et les formes de culture, avec nombreux granules protoplasmiques, donnent l'impression d'être dans de mauvaises conditions vitales. Néanmoins, Novy et Me Neal 1 ont gardé deux ans en culture le Tr. Brucei, la seule espèce pathogène qui ait pu être cultivée en série.

L'action des substances chimiques et biologiques sur les flagellés des cultures n'a guère été étudiée. Nous avons déjà dit que les impuretés bactériennes et mycosiques gênaient, en général, le développement des cultures qui périssaient assez vite. Thiroux, qui a cultivé le Tr. pacldse, a vu que le sérum des paddas guéris est agglutinant pour les formes de culture, alors que le sérum de padda neuf ne l'est pas.

Morphologie des un panosomes des cultures. — Dans les cultures, les trypanosomes présentent diverses formes qui paraissent se succéder suivant un certain ordre. On peut distinguer 3 phases :

1° Passage des formes du sang aux formes caractéristiques des cultures; 2° Phase où ces formes de cultures se multiplient; 3° Retour au type trypanosome.

La première phase n'a pas encore été suivie chez un grand nombre de types. On ne la connaît avec quelques détails que pour quelques gros trypan. de vertébrés inférieurs. Pour ces organismes, la culture se fait facilement, par exemple, dans du sang retiré des vaisseaux et conservé entre lame et lamelle.

On peut schématiser celte phase en disant que le trypanosome se divise en un nombre de parties proportionnel à son volume. Ainsi, les gros trypan. de grenouille se divisent' en un grand nombre d'éléments. Les trypan., encore volumineux, de certains poissons, comme la raie, se divisent en 4. Il est probable que, pour les trypan. de petite taille des mammifères, il y a ou bien division en 2, ou simplement migration du centrosome au voisinage du noyau.

La figure XIX met en évidence la différence de taille entre les trypanosomes du sang des grenouilles et les formes de culture <|ui en dérivent.

I. Novy et Me Neal, Proc. Soc. for erper. Mol. a. Mcd., t. IV, 1007, p. 42.

92 THYPANOSOMES ET TRYPANOSOMI ASES

Le résultat Huai est l'acquisition d'individus, de volume à peu près égal, quel que soit le type de trypan. qui cultive. La l'orme présente aussi une assez grande constance : éléments allongés, à noyau médian, à centrosome juxtanucléaire ou anténucléaire, à membrane ondulante nulle ou peu développée, et à flagelle libre assez long. Le noyau et le centrosome ont la môme structure que ceux des trypan. du sang.

Chez les Crithidia des moustiques cultivées par Novy, Me Neal et Torrey, il n'y a aucune différence essentielle entre les formes qui vivent chez les insectes et celles des cultures.

La culture des trypanosomes conduit donc à une sorte d'uniformisation du type. Nous attachons à cette constatation un intérêt phi-

Pig. XIX. — Comparaison entre les formes sanguines et culturales de Tr. rotatorium (figure empruntée à Botjét). 1-2. Formes sanguines. — 3-6. Formes des cultures au mémo grossissement.

losophique. Elle nous paraît prouver en effet la valeur phylogénique de ce type uniforme, opposé à la variété de la forme trypanosome du sang; et elle nous amène, par une voie indirecte, à l'idée que les trypan. dérivent des formes à centrosome antérieur au noyau, qui caractérisent les genres Leptoinonas et Crithidia, hôtes propres d'un certain nombre d'invertébrés, dont nous parlerons au chapitre suivant el dont nous traiterons en particulier à la fin de ce livre.

On ne saurait voir une objection au fait que le Tr. Brucei ne se présente, en culture, que sous la forme trypanosome. C'est là en effet le cas exceptionnel d'un trypanosome très difficile à cultiver; sans doute en raison d'une trop forte adaptation au mammifère, pour lequel il esl devenu pathogène, il ne sait plus revenir au type primitif dans les cultures et, par voie de conséquence, on ne sait

pas bien le cultiver comme les formes non pathogènes, moins adaptées.

Plus tard, il y a grande variation de taille chez certaines espèces, comme le Leivisi; on a toutes les dimensions depuis 1 à 2 «/. de long (flagelle non compris); certains éléments seraient môme capables de traverser les filtres Berkefeld : des filtrats de culture se seraient montrés, clan- les expériences de Novy et Me Neal, infectants. Des essais pour reproduire cette expérience n'ont pas été couronnés de succès.

Une fois la culture d'un trypan. réalisée, nous avons vu qu'on peut la conserver indéfiniment à condition de la réensemencer assez souvent.

Si ce réensemencement est assez fréquent, on ne trouvera, dans le liquide de condensation, ou à la surface de la gélose, que des formes Crithidia et Leplomonas. Elles sont, comme nous venons de le dire, construites à peu près toutes sur le môme type (voir fig. XX).

Fig. XX. — Formes de culture du Trypatm. Lewisi.

Les variations de forme qui vont d'un élément très allongé et très mince à une boule plus ou moins sphérique. indiquent, croyonsnous, beaucoup plus des modalités physiologiques que des particularités morphologiques essentielles.

Les diverses parties constituantes, noyaux, cytoplasme, appareil flagellaire. sont du môme type que pour les trypanosomes. La membrane ondulante présente une réduction plus ou moins grande pouvant aller jusqu'à la disparition.

La division est binaire et subégale. Elle peut être rapide et souvent les nouveaux éléments restent groupés en rosaces caractéristiques des cultures : les parties antérieures sont en effet dirigées vers le centre de l'amas où convergent tous les flagelles.

Le cytoplasme renferme parfois des granules métachromatiques plus ou moins abondants. Nous croyons que ces granules traduisent, toujours un certain état de souffrance de l'élément. Il y aurait analogie avec ce que nous avons dit des formes du sang circulant.

A côté des formes que nous venons de décrire, on observe souvent des éléments qui sont nettement du type trypanosome.

94 TRYPANOSOMES ET TRYPA N'OSOM I ASES

Nous avons dit que, dans le cas du Tr. Brucei, ce type paraissait exister seul dans les cultures; la présence de nombreux granules chromophiles, de forme irrégulière, dans le cytoplasme de ces trypanosomes, traduit manifestement leur état de souffrance.

L'existence de formes trypanosomes, dans les cultures des hématozoaires flagellés non pathogènes, signalée par Nbvj el Me Neal pour les trypan. d'Oiseaux, par Thomson pour ceux de Poissons, paraît générale. Delanoë 1 les a retrouvées dernièrement pour le trypan. des rats et pour celui des bovidés.

D'après cet observateur, ces éléments n'apparaîtraient dans les cultures du Tr. Lewisi qu'assez tard : 2 mois pour la culture d'isole-

ment, 15 jours pour les cultures des 6e et 7e générations. Ils apparaissent beaucoup plus tôt dans la culture du Tr. Theileri qui pousse très rapidement.

S'il est prouvé que ces formes sont surtout capables d'infecter l'hôte vertébré, il y aura là un parallélisme intéressant avec le développement des trypan. chez l'hôte invertébré : il parait bien prouvé, dans ce dernier cas, que la forme sous laquelle le parasite est réinoculé au vertébré est la forme trypan. qui termine le cycle chez l'invertébré.

Ces trypan. diffèrent, à certains égards, des formes du sang chez la même espèce. Ainsi, dans le cas du Tr. Lewisi, elles ne mesurenl que 8 à 10 a de long au lieu de 20 à 25.

D'après França2, on réalise rail ce passage du type Crithidia au type Trijpanosoma, en agitant le milieu dans lequel se trouvent les flagellés : il a opéré avec le Tr. rolatorium de la grenouille, pris dans la sangsue sous la forme crithidienne et mélangé à du sang non infecté. .