Minchin, Quart. Journ. of micr. Se, l. III, 1000, p

méthylique (2 à 3 minutes); on laisse sécher ou on enflamme l'alcool resté sur la lame.

Fixation aux vapeurs osmiques. — Quand, au lieu de sang, on a affaire à d'autres liquides qui peuvent renfermer des parasites : sérosités sanguinolentes retirées des œdèmes, liquide céphalorachidien, liquides des milieux de cultures, suc d'organes dilacérés ou écrasés, puis étalés, — ou encore à du sang anémique, ou simplement du sang dilué d'eau physiologique ou d'eau ci d atée, la lixation après dessication n'est jamais aussi parfaite que pour le sang pur; souvent les trypan. de ces divers liquides apparaissent vacuolaires.

Dans ces cas, il est recommandé de fixer les frottis, faits de préférence sur lamelles, avant dessiccation, par les vapeurs osmiques. Minchin conseille d'employer une solution d'acide osmique à i p. 100 à laquelle on ajoute une goutte d'acide acétique glacial par 20 gouttes. Mais on peut utiliser des solutions moins concentrées, par exemple à 1 p. 100.

L'introduction de ce mode de fixation bien connu à l'étude des trypan.. est due à Gray et Tulloch 1905) ', qui l'ont employé pour les frottis faits avec les contenus intestinaux de tsétsés. C'est lé procédé de choix pour les flagellés de l'intestin des invertébrés, que l'on veut ensuite colorer par une méthode dérivée de celle de Ronianowsky.

Ce procédé réussit également bien pour le sang et, en particulier, la forme des trypan. est mieux conservée que dans les frottis fixés après dessiccation. Nous estimons que son emploi mérite d'être particulièrement recommandé et d'être généralisé. Quand le frottis est pauvre en albuminoïde. il y a avantage à lui ajouter une petite goutte de sérum d'un animal quelconque 2.

Il faut avoir soin de laisser agir l'acide osmique très peu de temps, en moyenne de 10 à 15 secondes, 20 secondes au maximum.

En général, on laisse le frottis se dessécher; la dessiccation commence d'ailleurs pendant que les vapeurs osmiques agissent.

Il est recommandé de faire suivre cette fixation par une seconde à l'alcool absolu.

On peut, dans le cas des fixations aux vapeurs osmiques, éviter la dessiccation et faire passer alors les lamelles de liquide en liquide. Cette manière de faire ne paraît pas comporter d'avantages particuliers; il est préférable alors de recourir à des liquides fixateurs osmiques.

Fixation des frottis humides. — Les cytologistes condamnent souvent les fixations précédées ou suivies de dessiccation, ou au

1. ( iray et Tulloch, Roy. Soc, Report of the Sleep. Sickn. Comm. (n° VIII). 1003.

2. Cette application do séruins ffâis a été recommandée pour la première fois par Leishman dans le Irailoinonl des coupes.

moins formulent des réserves sur les résultats obtenus. Une étude minutieuse de la structure des trypanosomes doit donc être complétée par l'examen de préparations traitées conformément aux principes admis en cytologie. Mais nous tenons à dire explicitement que, pour la pratique journalière du laboratoire, les frottis secs suffisent. Ils donnent en particulier d'excellents renseignements pour l'étude comparée des trypanosomes.

Salvin-Moore et Breinl 1 recommandent la fixation suivante :

Sur une lame enduite d'albumine glycérinée, on étale une goutte de sang (ou de tout autre milieu contenant les parasites) et, avant qu'elle n'ait séché, on la plonge dans le fixateur (de préférence le Flemming fort); on laisse S-10 minutes; on lave et on passe lentement par les alcools jusqu'à l'absolu; puis on redescend dans l'alcool à 80° iodoioduré; ensuite alcool à 30°.

Mais les liquides osmiques ont l'inconvénient de gêner les coloralions et les divers auteurs (Rosenbusch, Minchin, Giemsa2...) s'accordent maintenant pour recourir à la fixation au sublimé. On accorde généralement la préférence au liquide de Schaudinn qui est formé de 2 parties de sublimé à saturation et de I partie d'alcool absolu; on ajoute un peu d'acide acétique (1 p. 100 en moyenne). Rosenbusch recommande d'employer ce fixateur à froid.

Giemsa, qui a eu surtout en vue d'appliquer aux préparations humides sa méthode azur-éosine (v. ci-dessous), conseille de faire le frottis aussi mince que possible sur une lamelle 3, de laisser agir le fixateur 12 à 24 heures; la lamelle tout d'abord Hotte face enduite en dessous, plus tard on peut l'immerger. On lave rapidement à l'eau, puis on passe (5 à 10 min.) dans la solution :

Iodure de potassium 2 gr.

Eau distillée 100 ce.

Solution de bugol 3 —

On lave encore à l'eau pendant un court temps; puis on enlève la feinte jaune de la préparation dans une solution aqueuse à 5 p. 100 d'hyposulfite de soude (10 min. environ). Enfin, on traite à l'eau courante pendant 5 minutes avant de plonger dans la solution colorante.

Dans des préparations qui n'ont jamais subi de dessiccation, les trypanosomes sont plus petits que dans les autres.

Fixation des pièces. — Les méthodes de fixation des pièces.

1. Salvin-Moore et Ureinl, Ann. of trop. Med. a. Permit., t. I, l!)<)7, p. 441.

2. ItosENBUSCii, Arch. f. Protislenk., I. XV, 1900, p. 203. — Minchin, L c — GlEMSA, Deutsche mediz. Woch., 1001), n° 40.

3. Los lamelles sont toujours ù recommander quand on veut fixer des frottis humides.

16 TRYPANOSOMES ET TKYPA NOSOM1ASES

organes, etc., où Ton désire mettre en évidence des Lrypan., sc-nl identiques à celles que nous venons d'indiquer pour les frottis humides.

Giemsa ', toujours en vue de l'application de sa méthode de coloration, conseille la fixation au sublimé de Schaudinn, l'inclusion à la paraffine et le débit en coupes de A u au plus d'épaisseur. Les coupes, une fois déparaffinées, sont passées par la série de liquides que nous venons d'énumérer.

Coloration. — Lorsqu'on veut colorer rapidement une préparation contenant des trypanosomes ou bien lorsqu'on n'a pas à sa disposition les colorants nécessaires pour appliquer les méthodes appropriées, on peut employer la solution alcoolique de fuchsine, ou bien une solution aqueuse de rouge Magenta, ou encore mieux une solution de phénate de thionine. La coloration est très rapide, quelquefois en moins d'une minute. Le noyau, le cenlrosome et le flagelle se colorent plus fortement que le protoplasme, et l'on obtient ainsi des préparations qui suffisent, dans la pratique, quand il s'agit seulement de reconnaître l'existence des trypanosomes et leur abondance.

Méthodes de Romanowsky el dérivées. — Pour colorer convenable ment les frottis de sang ou de milieux divers, fixés soit après dessiccation, soit par les vapeurs osmiques, il faut employer une méthode particulière : mélange colorant, à proportions définies, de bleu de méthylène et d'éosine. Ce mélange a été, pour la première fois, utilisé pour la coloration des hématozoaires (hématozoaire du paludisme) par Romanowsky.

La première application aux trypanosomes en a été faite en ISHN par Ziemann2 (trypanosome de la grenouille), qui a ainsi coloré le noyau et le centrosome. L'année suivante, Rabinowitsch et Kempner ;i ont coloré, par celle méthode, le Tr. Lewisi. Mais les premiers résultats vraiment parfaits n'ont été obtenus qu'en 1900 par Wasielewski et Senn ', également pour le Tr. Lewisi; ces savants ont usé de la méthode de Romanowsky modifiée par Nocht.

La méthode suivante ' nous a donné d'excellents résultais.

Les solutions qui suivent doivent être préparées à l'avance.

1° Bleu de méthylène à l'oxyde d'argent ou bien Borrel. Dans nue fiole de ISO ce. environ, on nid quelques cristaux d'azotate d'argent el 50 à 60 ce. d'eau distillée : quand les cristaux sont dissous, on remplit la fiole avec une solution de soude caustique concentrée el on agite; il se forme